硝基还原酶/甲硝唑介导的消融和MATLAB平台（RpEGEN）研究斑马鱼视网膜色素上皮的再生

摘要

该协议描述了使用转基因斑马鱼模型对视网膜色素上皮（RPE）进行遗传消融的方法。使用药理学化合物调整方案以纳入信号通路调节被广泛详细。开发了一种基于色素沉着的量化RPE再生的MATLAB平台，并进行了介绍和讨论。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）位于眼睛的后部，执行维持邻近视网膜和血管组织的健康和完整性所必需的功能。目前，哺乳动物RPE的修复能力有限，仅限于小损伤，阻碍了理解 体内 RPE再生过程的进展。在这里，提供了一个详细的方法，以促进利用斑马鱼的 体内 RPE修复的研究，斑马鱼是一种能够进行强大组织再生的脊椎动物模型。该方案描述了转基因硝基还原酶/甲硝唑 （NTR/MTZ） 介导的损伤范式 （rpe65a:nfsB-eGFP），其在 MTZ 治疗 24 小时后可消融 24 小时后消融 RPE 的中央三分之二，随后组织恢复。重点放在斑马鱼幼虫的RPE消融上，并概述了测试药理学化合物对RPE再生的影响的方法。还讨论了RpEGEN的生成和验证，RpEGEN是一种MATLAB脚本，用于基于色素沉着自动量化RPE再生。除了活性RPE修复机制外，该方案还可以扩展到RPE变性和损伤反应的研究，以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织以及其他细胞和分子过程的影响。这种斑马鱼系统在识别驱动RPE再生和RPE疾病相关机制的基因，网络和过程方面具有重大前景，其长期目标是将这些知识应用于哺乳动物系统，并最终实现治疗发展。

引言

本文描述的方法详细说明了利用斑马鱼幼虫遗传消融视网膜色素上皮（RPE）的方案。RPE延伸到眼睛的后部，位于神经视网膜的分层层和构成脉络膜的脉管系统层之间。营养支持，光毒性光的吸收和视觉周期蛋白的维持只是RPE执行的一些关键功能，这些功能对于维持这些相邻组织的健康和完整性至关重要¹。当病变较小时，对哺乳动物RPE的损害是可以修复的²;然而，较大的损伤或进行性退行性疾病所遭受的损害是不可逆的。在人类中，RPE 退行性疾病（例如，年龄相关性黄斑变性 （AMD） 和 Stargardt 病）导致永久性视力丧失，并且由于可用的治疗选择很少，患者生活质量下降。哺乳动物RPE自我修复能力有限，这在RPE再生过程领域造成了知识空白。鉴于斑马鱼在许多不同组织类型中具有强大的再生能力，该方案旨在建立 体内 脊椎动物系统，以促进对内在再生RPE的研究，并揭示驱动该反应的机制。使用此处概述的消融范式，规范的Wnt信号通路³，mTOR通路⁴和免疫相关反应⁵ 已被确定为RPE再生的关键介质，可能具有重叠的功能。

在这种遗传消融范式中，斑马鱼（rpe65a:nfsB-eGFP）³表达细菌来源的硝基还原酶（NTR / nfsB）基因⁶在RPE增强子元件rpe65a⁷的控制下融合到eGFP。消融是通过在斑马鱼系统水中加入前体药物甲硝唑（MTZ）来实现的。硝基还原酶对MTZ的细胞内活化导致NTR / nfsB表达细胞^8，9中的DNA交联和凋亡。该技术已广泛应用于斑马鱼中，以消融视网膜^{10，11，12，13}和其他组织的细胞⁸。这些元素共同实现了诱导细胞消融方法（NTR / MTZ）^8，9和荧光标记物（eGFP）的靶向表达（rpe65a）以进行可视化。

还存在其他有趣的 体内 模型，可用于研究RPE¹⁴的再生潜力。这些是广泛的，包括两栖动物视网膜切除术后的RPE到视网膜转分化，其中因视网膜再生而失去的RPE细胞被替换^15，16;RPE修复损伤后"超强愈合"MRL/MpJ小鼠¹⁷;和自发性RPE和视网膜变性¹⁸的大鼠模型中RPE增殖的外源性刺激等。体 外 模型，如成人人RPE干细胞（RPESCs）¹⁹ 也被开发出来。这些模型都是有价值的工具，用于揭示与RPE再生相关的细胞过程（例如，增殖，分化等）;然而，斑马鱼在消融后具有固有的RPE修复能力方面是独一无二的。

虽然这里的方法是为了专注于理解驱动RPE再生的机制， 但Tg（rpe65a:nfsB-eGFP） 系和这种遗传消融方案可用于研究其他细胞过程，如RPE凋亡，RPE变性以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织的影响。消融方案也可以修改以包括药物操作，这是筛选目标信号通路的便捷初步策略。例如，使用 Wnt 反应抑制剂 -1 （IWR-1）²⁰ 阻断规范的 Wnt 途径已被证明会损害 RPE 再生³。这里重复了这一点，以指导用户完成药理学操作实验，并作为概念验证，以验证为根据色素沉着的恢复来量化RPE再生而创建的MATLAB脚本（RpEGEN）。与转基因系和消融方案一样，RpEGEN脚本具有适应性，可用于量化RPE中的其他标记物/细胞过程。

研究方案

此处概述的所有方法均符合匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的要求。

1.斑马鱼胚胎收集前的准备

1. 将胚胎培养箱设置为28.5°C。
2. 制备黑色素生成抑制剂N-苯基硫脲（PTU）^{21，22的25x}储备^溶液。该储备溶液根据常用配方²²进行缩放，1x等于每体积0.003%重量（%w / v）（例如，将0.003 g PTU粉末放入100 mL液体溶剂中）。
   1. 要制作25x PTU大储备溶液，将0.75gPTU粉末加入1L纯化去离子水（以下称为dH₂O）中，并使用搅拌棒和搅拌板在室温（〜25°C）下充分混合。在4°C下储存长达3个月，避光。
      注意:很难使PTU进入水溶液中，并且可能需要延长搅拌过夜。
      注意:PTU是危险的，应注意防止摄入，吸入和/或与皮肤或眼睛接触。根据国家和机构法规，PTU粉末和本文中描述的所有PTU液体衍生物可能需要作为化学废物进行处理。建议在使用前确认适当的PTU废物处理方法（如果有的话）。
   2. 要制造1.5x PTU工作溶液（以下简称1.5x PTU），请在940 mL斑马鱼围栏设施水（以下简称系统水）中加入60 mL的25x PTU储备溶液。²³ 描述了斑马鱼的最佳水质参数，水生设施应制定标准的水监测程序。在28.5°C下储存1.5倍PTU，避光1-2周。
      注意:该方案常规使用步骤1.2中描述的PTU浓度，溶剂和储存参数执行。作为预防措施，在 PTU 中应每 1-2 天观察一次胚胎/幼虫，以验证疗效并确认持续脱色。如果怀疑 PTU 溶解度/功效降低，应优化溶解和/或储存条件。
3. 通过向100 mL dH₂O中加入0.05g亚甲蓝粉末来制备0.05%w / v亚甲基蓝的储备溶液，真菌生长抑制剂。使用搅拌棒和搅拌板充分混合。储存在4°C。
4. 通过使用金刚石笔尖划线笔切回玻璃巴斯德移液器的锥形末端，准备用于胚胎/幼虫操作的移液器（例如，在培养皿之间移动胚胎/幼虫，在荧光筛选期间分离幼虫，将安乐死幼虫收集到微量离心管中进行固定等）。用金刚石笔在移液器的圆周上蚀刻，然后轻轻拉动或扣断末端以使其完全断裂。
   注意:移液器的口应光滑且足够宽，以便轻松吸收仍在绒毛膜内的胚胎而不会剪切。使用灯泡拉伸转移移液器作为替代方法。准备好的移液器也可用于在换水（而不是倒入）期间去除液体，以最大限度地减少胚胎/幼虫的损失。
5. 在1x磷酸盐缓冲盐（PBS）中制备4%多聚甲醛（PFA）溶液（例如，向4mL 10x PBS和26mL dH 2 O中加入10mL_的16%PFA）。在4°C下储存长达4周，避光。
   注意:多聚甲醛是一种危险化学品，应在化学通风橱中处理并妥善处理。应注意，并应穿戴个人防护装备（PPE），以防止摄入、吸入和/或与皮肤或眼睛接触。

2.斑马鱼胚胎在基因消融前的收集和维持（受精后0-5天）

1. 维持斑马鱼成虫，如前所述^3，4，5。在胚胎收集前的下午/晚上，将成年斑马鱼分离到繁殖池中产卵。
2. 第二天早上（受精后0天（dpf）），将胚胎收集到系统水中直径10厘米的培养皿中，并取出所有不活跃或未受精的卵子，这些卵子将显得不透明和/或显示不规则的细胞质和失败的裂解²⁴。
   注意:正常切割和发育分期事件在健康胚胎中将很明显，如上所述²⁵。在整个方案中，培养皿应保持四分之三的满量（对于直径为10cm的培养皿，约30 mL）。
   1. 向每个培养皿中加入两滴0.05%w / v亚甲基蓝，轻轻混合，并将胚胎储存在28.5°C，用于方案的其余部分。
3. 受精后约6小时（hpf）^4，5，26，用1.5x PTU（步骤1.2.2中制成的工作溶液）替换胚胎培养皿中的系统水并补充亚甲蓝。
   注意:在色素沉着发作之前（即在24 hpf之前）²⁵必须将PTU添加到胚胎中，因为添加PTU²¹后已经着色的组织不会脱色。然而，应该注意的是，PTU处理的斑马鱼^27，28，²⁹中报告了眼睛尺寸减小，眼部和颅面功能障碍以及某些信号通路（例如甲状腺信号传导）的破坏。PTU的发展毒性似乎取决于PTU添加^27，29的浓度和时间。如上所述，验证PTU功效（步骤1.2），还应仔细监测PTU毒性的迹象，如果怀疑，应优化PTU加用的工作浓度和/或时间。
4. 在2-3 dpf上，使用新鲜制作的促胰岛素溶液对胚胎进行去皮化。
   1. 通过涡旋将蛋白酶溶解在1.5x PTU中，浓度为2mg / mL。
      注意:Pronase被包装成非常细的粉末，是一种刺激物。采取措施避免吸入和/或接触皮肤、眼睛等。
   2. 将孵化的胚胎与未孵化的胚胎分开，仅对未孵化的胚胎进行原酶处理。
   3. 用步骤2.4.1中制备的2mg / mL促酶溶液替换1.5x PTU，并在未孵化的胚胎上以轻柔的搅拌（例如，在桌面旋转器/摇床上或通过手动旋转）留在未孵化的胚胎上4-5分钟。
   4. 倒出促酶溶液，立即用新鲜的1.5倍PTU冲洗。轻轻地研磨1.5x PTU，用球吸转移液管冲洗胚胎。
   5. 重复第二次 1.5 倍 PTU 冲洗以丢弃所有绒毛膜碎屑，然后补充 1.5 倍 PTU 进行维护。
      注意:胚胎也可以使用细尖的镊子手动去皮。在这种情况下，应清除脉络膜碎屑，并在手动去皮后补充1.5倍PTU。
5. 监测胚胎/幼虫健康，每1-2天补充1.5倍PTU。胚胎/幼虫保持在1.5x PTU中，直到以5 dpf消融。
   注:步骤 2.3 和 2.4 的重要性将在"讨论"部分进一步讨论。

3. 斑马鱼幼虫的rpe65a:nfsB-eGFP和视网膜色素上皮的遗传消融（受精后5-6天）

1. 在5 dpf（消融日）上制作新鲜的10mM甲硝唑（MTZ）溶液。此过程需要 2 小时才能完成。
   1. 将MTZ粉末加入没有PTU的系统水中，并通过剧烈摇动（例如，每分钟250转）在37°C下彻底混合1小时。
   2. 在室温下，在台式旋转器/摇床上冷却10 mM MTZ溶液，并确保在将幼虫添加到培养皿之前完全溶解。
      注意:eGFP ⁺ 幼虫的荧光筛选和分离（步骤3.2）可以在37°C和室温孵育期间进行。
      注意:MTZ是危险的，应注意防止摄入，吸入和/或与皮肤或眼睛接触。根据国家和机构法规，MTZ粉末和本文中描述的所有液体衍生物可能需要作为化学废物进行处理。建议在使用前确认适当的MTZ废物处理方法（如果有的话）。
2. 筛选斑马鱼幼虫的 rpe65a:nfsB-eGFP转基因。
   1. 使用荧光立体显微镜和488nm激发激光/滤光片，用0.168g / L三卡因（^MS-222）麻醉幼虫，并将转基因（eGFP ⁺）幼虫（图1）与非转基因（eGFP-）幼虫分开。
      注意:应将三卡因添加到1.5x PTU和/或药理学化合物溶液中，因为幼虫在筛查eGFP时应保持浸没在治疗中。仅在筛选期间在三卡因中孵育幼虫（例如，对于含有50只幼虫的10cm培养皿，≤10分钟）。
   2. 通过直接移液到培养皿中，立即唤醒筛选的幼虫，其中含有新鲜的1.5x PTU，不含三卡因。
   3. 在完成筛选后，将eGFP ⁺ 幼虫进一步分成两组培养皿:一组接受MTZ处理（消融/ MTZ ⁺），一组作为未升压（MTZ^-）对照组。
3. 消融视网膜色素上皮。
   1. 从未升压 （MTZ^-） 控制培养皿中取出 1.5 倍 PTU，并在不使用 PTU 的情况下添加新鲜系统水。
   2. 从消融（MTZ ⁺）处理皿中取出1.5倍PTU，并加入新鲜制作的10 mM MTZ溶液（步骤3.1）。
   3. 在正好24小时（指定为损伤后1天（dpi））后取出10 mM MTZ溶液，并在没有PTU的情况下加入新鲜系统水。更换MTZ^培养 皿上没有PTU的新鲜系统水。在方案的其余部分，幼虫不会再次暴露于PTU。
      注意:在溶液交换之间移液或倒出所有1.5x PTU（步骤3.3.1和3.3.2）或10 mM MTZ（步骤3.3.3）可能很困难，因为动物正在积极地游来游去。在这种情况下，可以添加不含PTU的系统水洗涤，以确保成功更换溶液。

4. 遗传消融术后幼虫维持（受精后6天以上）

1. 每天检查幼虫并补充没有PTU的系统水，直到安乐死（步骤5.6）或返回斑马鱼住房设施。
2. 使用体视显微镜上的透射光照明，以2 dpi（7 dpf）监测 体内 消融的成功和程度（图2）。

5. 将药物治疗纳入斑马鱼视网膜色素上皮消融方案

注意:与之前执行³一样，此处概述了从4 dpf开始使用15μM IWR-1或体积匹配的二甲基亚砜（DMSO）载体控制进行处理，作为测试RpEGEN的示例实验。浓度和时间表可能因不同的药理学化合物而异，讨论部分讨论了剂量反应验证，治疗持续时间，筛选和药理学操作研究实验设计的其他方面的建议。如果需要进行影像分析，请执行步骤 6 和 7。

1. 按照步骤2中所述收集和维持胚胎。以2 dpf对胚胎进行去皮化。
2. 按照步骤3.2所述，以4 dpf对eGFP ⁺ 幼虫进行筛选。而不是培养皿，将eGFP ⁺ 幼虫放入6孔板中，密度为n≤每6孔10个幼虫进行药物治疗。为将要未消融的幼虫（MTZ^-）和将要消融的幼虫（MTZ ⁺）指定单独的6孔板。
   注意:eGFP 信号在 4 dpf 上可见，但在 5 dpf 上看起来比信号强度暗。
3. 在使用10 mM MTZ溶液进行基因消融之前，用15μM IWR-1或体积匹配的DMSO载体对照预处理4 dpf eGFP ⁺ 幼虫24小时。
   注意:通常，药物治疗实验只需要很少的化合物。为了避免称出少量的IWR-1粉末，该药理化合物已经在DMSO溶液中购买，浓度为25 mM，并在抵达时等分到较小的体积中，以避免重复的冻融循环。
   1. 确定所需的药物和载体对照治疗的体积，并相应地将1.5x PTU等分到锥形管中。建议 5 mL/孔 6 孔板的体积。
   2. 将 IWR-1 储备液加入 1.5x PTU，最终浓度为 15 μM IWR-1（例如，每 5 mL 1.5x PTU 中 3 μL 25 mM IWR-1）。将匹配体积的 DMSO 储备液加入 1.5 倍 PTU（例如，每 5 毫升 1.5 倍 PTU ≥ 99.7% DMSO）。在这里，这最终将产生0.06%体积/体积（% v / v）DMSO的最终浓度。通过涡旋充分混合，并直观地确认化合物的溶解。
      注意:DMSO、IWR-1 和其他药理化合物和溶剂可能需要作为化学废物处理，具体取决于州和机构法规。建议在使用前确认这些化合物的危险水平和适当的废物处理方法（如果有的话）。
   3. 从6孔板中的eGFP ⁺ 幼虫中除去1.5x PTU，并从步骤5.3.2中加入5mL /孔中新鲜制作的0.06%v / v DMSO或15μM IWR-1处理。
4. 在 5 dpf 时，消融 RPE。除了24小时的预处理（步骤5.3）外，幼虫还将在10 mM MTZ的遗传消融24小时和消融后恢复期间保持浸入药理学和载体对照治疗中，直到固定（例如，从4-9 dpf）。
   1. 在进行基因消融前2小时制作10 mM MTZ溶液（步骤3.1）。
   2. 确定未稀释 （MTZ^-） 和烧蚀 （MTZ⁺） 6 孔板所需的药理学和载体对照处理的体积，并将适当体积的无 PTU （MTZ^-） 或 10 mM MTZ 溶液 （MTZ⁺） 的新鲜系统水等分试样放入锥形管中。这将产生四种处理条件:1）0.06%v / v DMSO，MTZ^-;2） 15 μM IWR-1， MTZ^-;3） 0.06% v/v DMSO， MTZ⁺;和 4） 15 μM IWR-1， MTZ⁺。
   3. 按照步骤5.3.2中的步骤，将IWR-1和DMSO储备溶液添加到相应的锥形管中。通过涡旋充分混合，并直观地确认化合物的溶解。
   4. 从指定的未升压（MTZ-）和烧蚀（MTZ⁺）6孔板中取出1.5倍PTU（步骤5.3.2）中的0.06%v / v DMSO和15μM ^IWR-1处理，并用步骤5.4.3中的适当处理补充。
   5. 在10 mM MTZ溶液中去除0.06%v / v DMSO和15μM IWR-1处理，精确24小时后，并在没有PTU的新鲜系统水中补充处理。在未稀释 （MTZ-） 6 孔板上补充 0.06% v/v DMSO 和 15 μM ^IWR-1 处理，无需 PTU 的新鲜系统水。
5. 按照步骤4中概述的消融后进行幼虫维持，并在没有PTU的系统水中每天补充0.06%v / v DMSO或15μM IWR-1处理。
6. 通过将动物浸入0.3g / L三卡因溶液（致命过量）中并快速冷却（例如， 将培养皿放在冰上）以9 dpf（年龄匹配的MTZ处理的兄弟姐妹为4 dpi）对幼虫实施安乐死至少20分钟³⁰。检查以确保幼虫对触摸无反应，并在室温下或在4°C过夜时以4%PFA（步骤1.5）固定3小时。
7. 在共聚焦显微镜上处理固定后幼虫组织以进行z-stack图像采集，如前面^5，31 和此处的代表性结果部分所述。步骤6和7中的分析至少需要获取核标记物（例如DAPI）和明场z-stack图像。

6. 斐济共聚焦显微镜z-stack图像预处理（ImageJ）

1. 使用FIJI³²导入共聚焦显微镜z-stack图像并设置其格式。
   1. 使用设置为"查看堆栈"的" 生物格式导入选项" 打开显微镜图像 :超堆叠 和 颜色模式:灰度。
   2. 通过选择图像投影来生成导入的显微镜图像的最大强度 投影|堆栈|Z 项目。在 ZProjection 窗口中，设置 "开始切片" 和 "停止切片" 以包括该图像的所有切片。例如， 将 "开始切片:1" 和 "停止切片:18 "设置为总共包含 18 个切片的 z 堆栈。选择 投影类型:最大强度 ，然后单击 确定。
   3. 通过选择"图像|将最大强度投影文件转换为 8 位图像（如果尚未 转换为图像）类型 |8 位。
   4. 通过选择"图像"，重新定向图像，使背侧向上并留下远端（即镜头），方法是选择"图像|转换|水平翻转（对于最后一个命令，请选择最适合该图像所需方向性的选项）。对于多通道图像，请单击"进程堆栈？" 窗口以重新定向所有通道。
      注意:此步骤至关重要，但如果图像已经位于背侧向上，左远端方向，则不需要此步骤。请参阅图3A-D和图4，了解眼睛在正确方向上进行处理的图像。
   5. 通过选取"文件|，将 8 位最大强度投影存储为标记图像文件格式 （TIF） 文件另存为|蒂夫....
2. 使用斐济生成感兴趣的 RPE 区域 （ROI）。
   1. 打开按照步骤 6.1 中所述生成的 8 位 TIF 映像。通过选择 "分析|"启动 ROI 管理器工具|投资回报率经理。
   2. 使用 图像| 在 DAPI 和明场通道之间缩放和切换，以识别 RPE 顶侧与外限制膜 （OLM） 尖端相邻的点（图 3B'， B"， D'， D";蓝色箭头）。使用此解剖学里程碑作为 ROI 起点。
   3. 使用多边 形选择 工具（位于斐济工具栏中）使用 DAPI 和明场图像通道以及缩放功能（图像|缩放）以识别顶端和基底 RPE 边界。将ROI的背端和腹端（即ROI从RPE的顶侧过渡到基底侧）带到尖锐的点，而不是钝化或四舍五入（图3B'，B"，D'，D";洋红色线）。
      注意:创建指向的 ROI 端是使用 RpEGEN 优化端点检测的关键步骤，讨论部分将对此进行介绍。
   4. 通过在 ROI 管理器中单击 "添加 "来添加 ROI。根据需要调整投资回报率，然后单击投资回报率管理器中的 更新 。
   5. 通过选择"更多"来保存 ROI 文件 >> |救。。。 在投资回报率经理内。对匹配的 ROI 和 TIF 图像文件使用相同的名称（例如，[文件名].tif和 [文件名].roi）。
3. 将每个条件的 8 位 TIF 和 ROI 文件合并到一个文件夹中。例如， 文件夹DMSO_9dpf将包含 9 dpf 未升压 （MTZ^-） 0.06% v/v DMSO 处理的幼虫组的所有匹配的 TIF 和 ROI 文件。

7. 使用RpEGEN脚本对RPE再生进行量化和可视化

1. 安装并准备 RpEGEN 脚本。
   1. 通过单击"代码|从 GitHub 存储库 （https://github.com/burchfisher/RpEGEN） 下载最新的 RpEGEN 脚本 下载压缩文件。
   2. 解压缩文件夹并将其放置在所需的工作区位置（例如，桌面）。
   3. 打开 MATLAB。
   4. 导航到"当前文件夹"窗格中的 RpEGEN 文件夹 （通常位于左侧）。
   5. 右键单击 RpEGEN 文件夹，然后选择 添加到路径|选定的文件夹和子文件夹。这会将文件夹添加到 MATLAB 路径，以便它可以自动查找并运行该文件夹中的任何脚本。
   6. 双击"当前文件夹"窗格中的 RpEGEN 文件夹以显示所有子文件夹和 M 文件。
   7. 双击 RpEGEN.m 文件以在 编辑器 窗格中打开。
   8. 在 RpEGEN.m 文件的" 用户定义的变量 "部分下，输入包含 ROI 文件 （.roi）、图像文件（.tif）的文件夹的目录位置以及应保存输出文件的位置。输入要导出的 .mat 文件的组名（例如，DMSO_9dpf、DMSO_4dpi等）和明场通道在 TIF 图像堆栈中的位置（例如，如果明场是图像堆栈中的第三个通道，则为 3）。如果图像文件仅包含明场图像，则此值应等于 1。
2. 运行 RpEGEN.m 脚本并验证结果。
   注意:RpEGEN 需要在用户 MATLAB 许可证上激活图像处理工具箱、曲线拟合工具箱以及统计和机器学习工具箱才能运行。此外，需要免费提供的ReadImageJROI工具箱³³ 才能将斐济投资回报率导入MATLAB;但是，它与不需要任何激活的其他函数M文件一起在RpEGEN文件夹中提供。
   1. 通过单击 MATLAB 顶部"编辑器"菜单中的"运行"按钮来运行脚本。
      注意:启动后， "命令 "窗口将提供指示脚本进度的详细输出。保存包含提取数据的MAT文件后，将出现一个三面板图形，并将其作为PDF保存到每次图像运行的输出目录中。这些是质量控制（QC）数字，以确保一切都正常运行，包括:1）ROI覆盖的明场图像（图4A）;2）具有中心线和相关角距离（度）的ROI（图4G）;3）具有中心线中位数强度值（0-255，8位色标）的ROI（图4H）。等到QC PDF已保存到输出文件夹并且最后一个数字消失后，然后再继续下一步。
   2. 在任何 PDF 查看器中打开导出到输出文件夹的单个 PDF，并验证所有 ROI 是否与明场图像匹配，中心线值是否为 ROI 中心的合理近似值，以及是否用数据适当地填充了中位数强度值（即，在整个中心线上不是所有相同的值）。
      注意:RpEGEN.m 保存在 MAT 文件中的每个变量的详细说明和结构可在 表 1 中找到。
3. 运行 RpEGEN_PermPlot.m 脚本。
   注意:RpEGEN_PermPlot.m 脚本使用 RpEGEN.m 的输出，通过对两组中位数的排列模拟来运行统计比较，还提供了使用免费提供的 GRAMM 工具箱³⁴ 复制本文中的绘图的代码，该工具箱也包含在 RpEGEN 文件夹中。
   1. 双击 RpEGEN_PermPlot.m 文件以在新的 编辑器 选项卡中打开。
   2. 在RpEGEN_PermPlot.m 文件中 的第 1 部分 - 用户定义变量 下，输入包含运行 RpEGEN.m 的 MAT 文件的输出文件夹的目录位置，并输入要加载的每个 MAT 文件名（例如，DMSO_4dpi.mat、IWR1_4dpi.mat）。
   3. 通过单击 MATLAB 顶部"编辑器"菜单中的"运行部分"按钮来运行脚本的此部分。
   4. 在第 2 节中，输入两个组的名称，以便在 data_A 和 data_B 变量（这些是使用排列模拟从中导出中位数的组）中进行统计比较的名称）。在 bin_sz 变量中，输入要对数据集的中位数强度值进行积分的度数（默认值为 1 度条柱）。
      注意: reps 变量指示用于构建概率分布的排列数，可以设置为任意数字（默认值为 20，000）。通常，重复次数越多，在统计上就越健壮，但会增加处理时间。
   5. 通过单击 MATLAB 顶部"编辑器"菜单中的"运行部分"按钮来运行脚本的此部分。根据指定的重复次数，此部分可能需要一些时间才能完成，但会在命令窗口中提供连续的状态更新。
   6. 使用运行部分按钮独立运行热图图并对结果和 P 值部分进行分组。编辑任何注释为"在此处输入数据"部分的数据变量。这些数字的PDF会自动保存，并且可以在任何矢量软件后处理中轻松修改。
      注意: RpEGEN_PermPlot.m 文件中生成的绘图是 临时 的，可能需要根据每个用户的特定数据和可视化需求进行修改。但是，这些数字确实提供了坚实的基础，可以使用MATLAB和GRAMM网站轻松个性化。

结果

已知抑制规范的Wnt信号通路会显着损害斑马鱼RPE再生使用方案³中描述的遗传消融范式（rpe65a:nfsB-eGFP）和药理学操作方法（IWR-1）。本文重复该实验，验证了一种基于色素沉着的斑马鱼RPE再生量化自动化方法。下面总结的结果涵盖了方案的所有步骤，从受精当天（0 dpf）到使用RpEGEN量化RPE再生。

在斑马鱼幼体中实施RPE消融方案（通过药物操作）

讨论

该协议描述了对RPE进行遗传消融的方法，并研究了幼体年龄斑马鱼的变性和再生机制。该方案也已在成年斑马鱼³ 中成功实施，但表征范围较小，这就是为什么幼虫是这里的重点。方案这一部分的关键方面（步骤1-4）包括:1）在黑色素发生开始之前向胚胎添加1.5倍PTU，2）以2-3 dpf对PTU处理的胚胎进行去壳化，3）仔细筛查eGFP，以及4）MTZ基因消融期间水的变化时间。PTU抑制黑色素合?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Millipore Sigma	D9542
6-well plates	Fisher Scientific	07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-539-13	Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen	Fisher Scientific	50-254-51	Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %	Fisher Scientific	BP231	Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)	Fisher Scientific	3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)	Labnet	I5110A
Fluorescence stereo microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16	Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-4	Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo	Millipore Sigma	5.04462	Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)	Fisher Scientific	BP117-100	Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)	Millipore Sigma	M3761	Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)	Millipore Sigma	P7629	Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free	Fisher Scientific	AA433689M	Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)	Millipore Sigma	P3813	Used to make 10 X PBS stock
Pronase	Millipore Sigma	PRON-RO
Shaking incubator	Benchmark	H2010	Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope	Leica	S9i	Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	91150-20	Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker	Scilogex	SK-D1807-E
Transfer pipette	Millipore Sigma	Z135003	3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Pentair	TRS1, TRS2, TRS5	Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)	FIJI (Fiji is Just ImageJ)	https://imagej.net/software/fiji/	Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos	MathWorks	https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support	MathWorks	https://www.mathworks.com/support.html