JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول إعداد العينات وتحليل البيانات لتحديد كمية فسفرة البروتين باستخدام فحص محسن للسحب أحادي الجزيء (SiMPull).

Abstract

الفسفرة هي تعديل ضروري بعد الترجمة ينظم وظيفة البروتين ويوجه نتائج إشارات الخلايا. لا يمكن للطرق الحالية لقياس فسفرة البروتين الحفاظ على عدم التجانس في الفسفرة عبر البروتينات الفردية. تم تطوير اختبار السحب أحادي الجزيء (SiMPull) للتحقيق في تكوين المجمعات الجزيئية الكبيرة عن طريق الترسيب المناعي للبروتينات على غطاء زجاجي متبوعا بتصوير جزيء واحد. التقنية الحالية هي تكيف مع SiMPull يوفر تقديرا كميا قويا لحالة الفسفرة لمستقبلات الغشاء كاملة الطول على مستوى الجزيء الواحد. يسمح تصوير الآلاف من المستقبلات الفردية بهذه الطريقة بتحديد أنماط فسفرة البروتين. يفصل البروتوكول الحالي إجراء SiMPull الأمثل ، من إعداد العينات إلى التصوير. إن تحسين إعداد الزجاج وبروتوكولات تثبيت الأجسام المضادة يزيد من تحسين جودة البيانات. يوفر البروتوكول الحالي رمزا لتحليل بيانات الجزيء الواحد الذي يحسب جزء المستقبلات المفسفرة داخل العينة. بينما يركز هذا العمل على فسفرة مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) ، يمكن تعميم البروتوكول على مستقبلات الغشاء الأخرى وجزيئات الإشارات الخلوية.

Introduction

يتم ضبط الإشارات المرتبطة بالغشاء عن طريق مزيج من تنشيط مستقبلات الغشاء التي يسببها الليغاند وتوظيف البروتينات الملحقة في المصب التي تنشر الإشارة. الفسفرة من التيروزين الرئيسية في ذيول السيتوبلازم المستقبلات أمر بالغ الأهمية لبدء تشكيل مجمعات الإشارات ، أو السيلوسومات 1,2. لذلك ، فإن السؤال المهم في علم الأحياء هو كيف يتم إنشاء أنماط الفسفرة والحفاظ عليها لتجنيد شركاء الإشارات وإملاء النتائج الخلوية. ويشمل ذلك فهم عدم تجانس فسفرة المستقبلات ، سواء في الوفرة أو في أنماط الفوسفوتيروزين المحددة التي يمكن أن توفر وسيلة للتلاعب بمخرجات الإشارات عن طريق إملاء تكوين الإشارة3،4،5،6،7. ومع ذلك ، هناك قيود في الطرق الحالية لاستجواب فسفرة البروتين. تحليل اللطخة الغربية ممتاز لوصف اتجاهات فسفرة البروتين ولكنه شبه كمي8 ولا يوفر معلومات عن عدم تجانس النظام لأن الآلاف إلى الملايين من المستقبلات يتم حسابها في المتوسط معا. في حين أن البقع الغربية تسمح بفحص عينة باستخدام أجسام مضادة خاصة بالفوسفو لتيروزينات محددة ، إلا أنها لا تستطيع توفير معلومات عن أنماط الفسفرة متعددة المواقع داخل نفس البروتين. تقرير الفوسفوبروتينات الكمي عن وفرة الفوسفوتيروزين ، ولكن هناك قيود على اكتشاف الفسفرة متعددة المواقع ، حيث يجب أن تكون المخلفات ذات الأهمية موجودة داخل نفس الببتيد (عادة 7-35 من الأحماض الأمينية) التي يتم إنشاؤها بواسطة الهضم الأنزيمي9،10،11.

للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، تم تكييف اختبار السحب أحادي الجزيء (SiMPull) لتحديد حالات الفسفرة للمستقبلات السليمة على مستوى الجزيء الواحد. تم إثبات SiMPull لأول مرة كأداة قوية لاستجواب المجمعات الجزيئية الكبيرة بواسطة Jain et al.12,13. في SiMPull ، تم ترسيب المجمعات الجزيئية الكبيرة (IP) على أغطية زجاجية وظيفية للأجسام المضادة ثم تم تحليلها من خلال الفحص المجهري أحادي الجزيء لعدد الوحدات الفرعية للبروتين و IP المشترك مع المكونات المعقدة12. كان التعديل الذي أجراه كيم وآخرون 14 ، والذي أطلق عليه اسم SiMBlot ، أول من استخدم اختلافا في SiMPull لتحليل فسفرة البروتينات المشوهة. يعتمد بروتوكول SiMBlot على التقاط بروتينات سطح الخلايا البيوتينيل باستخدام أغطية مغلفة ب NeutrAvidin، والتي يتم فحصها بعد ذلك للفسفرة باستخدام وضع العلامات على الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو14. وعلى الرغم من هذه التطورات، كانت هناك حاجة إلى تحسينات لجعل القياس الكمي للتعديل بعد الترجمة أكثر قوة وقابلية للتطبيق على مجموعة أوسع من البروتينات.

يصف هذا البروتوكول نهج SiMPull الأمثل الذي تم استخدامه لتحديد أنماط الفسفرة لمستقبلات عامل نمو البشرة السليمة (EGFR) استجابة لمجموعة من ظروف الرباط والطفرات الورمية15. بينما يركز هذا العمل على EGFR ، يمكن تطبيق هذا النهج على أي مستقبلات غشائية وبروتينات خلوية ذات أهمية (POI) ، والتي تتوفر لها أجسام مضادة عالية الجودة. يتضمن البروتوكول خطوات لتقليل التألق الذاتي للعينات ، وتصميم صفيف العينات الذي يتطلب الحد الأدنى من حجم العينة مع التحضير المتزامن لما يصل إلى 20 عينة ، وتحسين ظروف وضع العلامات على الأجسام المضادة وتثبيتها. تم تطوير خوارزميات تحليل البيانات للكشف عن جزيء واحد وتحديد كمية البروتينات المفسفرة.

Protocol

1. إعداد غطاء

ملاحظة: في هذه الخطوة ، يحتاج المرء إلى ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) ، والتي تشمل طبقة مزدوجة من قفازات النتريل ، ونظارات السلامة أو درع الوجه ، ومعطف المختبر.

  1. أداء حفر البيرانا لإزالة الحطام العضوي من الزجاج.
    تحذير: محلول البيرانا هو عامل مؤكسد قوي قابل للتآكل وشديد التفاعل عند ملامسته للمواد العضوية. التفاعل مع الحطام العضوي طارد للحرارة ويحتمل أن يكون متفجرا. وبالتالي ، يجب تنفيذ الإجراء في غطاء دخان كيميائي مع خفض الوشاح. مطلوب الأواني الزجاجية Pyrex للتعامل مع محلول البيرانا.
    1. قم بإعداد مساحة العمل داخل غطاء الدخان الكيميائي. رتب الأغطية دون تداخل في الجزء السفلي من كوب زجاجي سعة 4 لتر ، وهو دورق "التفاعل" ، وضع كوب التفاعل على صفيحة ساخنة بحرارة لطيفة. اترك الأواني الزجاجية تسخن لمدة 10 دقائق. ضع دورق زجاجي "نفايات" سعة 1 لتر مع 500 مل من ddH2O بالقرب من كوب التفاعل.
    2. أضف 49 مل من حمض الكبريتيك 12 N (H2SO4) ببطء إلى كوب التفاعل باستخدام ماصة مصلية زجاجية. شطف ماصة في كوب النفايات قبل التخلص منها.
    3. أضف 21 مل من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ (H 2 O2) بقطرة مع ماصة مصلية زجاجية إلى كوب التفاعل. قم بتوزيع قطرات H 2O2 ببطء بالتساوي عبر الجزء السفلي من قارورة التفاعل لمنع التبريد الموضعي لتفاعل حفر البيرانا. شطف ماصة في كوب النفايات قبل التخلص منها.
      تنبيه: أضف دائما H 2 O2 إلى H2 SO4 ، ولا العكس بالعكس أبدا.
    4. البيرانا حفر الأغطية لمدة 30 دقيقة. حرك بلطف محتويات كوب التفاعل كل 5 دقائق.
    5. قم بإخماد محلول البيرانا عن طريق صب محتويات كوب النفايات في كوب التفاعل. انقل السائل ببطء إلى أسفل جدار كوب التفاعل لتقليل الرذاذ. قم بإزالة كوب التفاعل من السخان.
    6. عندما يتم إخماد التفاعل وتبريده ، صب محلول البيرانا مرة أخرى في كوب النفايات لتحييده دون إزالة الأغطية المحفورة من وعاء التفاعل.
    7. تحييد حل البيرانا مع إضافة تدريجية لقاعدة ضعيفة. على سبيل المثال ، استخدم كتلة مفرطة 20 جم من بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) / محلول بيرانا 100 مل.
      تنبيه: لا تقم بتخزين محاليل البيرانا في حاويات نفايات مغلقة. يجب دائما تحييد الحل قبل التخلص منه. ينتج تفاعل التحييد فقاعات قوية وقد يكون متفجرا إذا لم يتم التحكم فيه عن طريق الإضافة التدريجية للقاعدة الضعيفة.
    8. حرك المحلول المحايد بقضيب تحريك زجاجي واتركه يتفاعل لمدة 2 ساعة. ارفع الرقم الهيدروجيني إلى >4 وتخلص من المحلول.
    9. بين إضافات القاعدة الضعيفة إلى محلول البيرانا ، انقل الأغطية المحفورة من كوب التفاعل إلى قمع Buchner بقضيب تحريك زجاجي وشطفه لمدة 5 دقائق في تشغيل ddH2O.
      ملاحظة: انتقل على الفور إلى الخطوة التالية أو قم بتخزين أغطية سمك البيرانا المحفورة لمدة تصل إلى أسبوعين في ddH2O في وعاء زجاجي مغلق أو طبق بتري (لف بفيلم مانع للتسرب ، انظر جدول المواد).
  2. قم بتسمير الأغطية في المذيبات العضوية باتباع الخطوات أدناه.
    1. ضع الأغطية في جرة كوبلن زجاجية (انظر جدول المواد) وقم بتغطيتها بالميثانول (CH3OH). أغلق الغطاء على الجرة بفيلم مانع للتسرب وسونيكات الحمام لمدة 10 دقائق. صب الميثانول بعناية من جرة كوبلن في زجاجة تخزين زجاجية.
    2. املأ جرة كوبلن بالأسيتون (C3H6O) ، وأغلق الغطاء ، واستحم سونيكات لمدة 10 دقائق. صب الأسيتون بعناية من جرة كوبلن في زجاجة تخزين زجاجية.
      تحذير: الميثانول قابل للاشتعال وسام بشكل حاد. استخدم في غطاء الدخان الكيميائي. الأسيتون قابل للاشتعال ومهيج. لذلك ، تعامل معه وخزنه في الزجاج ، واستخدمه في غطاء الدخان الكيميائي. التخلص من النفايات الخطرة وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية المحلية.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الميثانول والأسيتون حتى خمس مرات لكل منهما.
  3. قم بتنشيط سطح الغطاء لإضفاء الطابع الوظيفي على السيلان.
    1. حمام سونيكات مع 1 م هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) لمدة 20 دقيقة. صب بعناية KOH من جرة كوبلن في أنبوب مخروطي 50 مل لإعادة استخدامه.
      تحذير: KOH هو تآكل ومهيج. استخدم في غطاء الدخان الكيميائي ولا تخزنه في الزجاج. تخزينها في أنابيب البولي بروبلين. التخلص من النفايات الخطرة وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية المحلية.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام KOH حتى خمس مرات.
    2. اشطف مرتين باستخدام ddH 2 O. صفي ddH2O من الأغطية ، ثم سخني كل غطاء عن طريق التلويح عبر لهب موقد بنسن لطرد كل رطوبة السطح. ضع الأغطية في وعاء كوبلن جاف.
  4. أداء أمينوسيلان الغطاء.
    1. تحضير محلول أمينوسيلان عن طريق خلط 69.4 مل من الميثانول مع 3.6 مل من حمض الخليك (CH3COOH) في قارورة مخروطية. أضف 720 ميكرولتر من N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane (aminosilane) واخلطها جيدا (انظر جدول المواد).
      تحذير: حمض الخليك قابل للاشتعال والتآكل. التعامل مع الماصات الزجاجية وتخزينها في الزجاج. العمل مع حمض الخليك في غطاء الدخان الكيميائي. الأمينوسيلان هو خطر استنشاق سام بشكل حاد ، ومحسس ، ومهيج. إنه ضار بالحياة المائية. استخدم في غطاء الدخان الكيميائي. التخلص من المواد الكيميائية كنفايات خطرة وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية المحلية.
      ملاحظة: أمينوسيلان حساس للضوء ويتحلل بسرعة في الماء. يجب تنفيذ جميع الخطوات باستخدام هذا الكاشف في ظل الحد الأدنى من ظروف الإضاءة للحفاظ على النشاط. قم بتطهير الزجاجة بغاز النيتروجين وقم بتطبيق فيلم مانع للتسرب قبل التخزين في مجفف داكن. استبدل كل 6-9 أشهر.
    2. أضف على الفور محلول أمينوسيلان إلى جرة كوبلين. قم بتغطية وتطبيق فيلم الختم ، مع الاستمرار في الحماية من الضوء.
    3. احتضن الأغطية في محلول أمينوسيلان لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة (RT). حمام سونيكات لمدة 1 دقيقة ثم احتضان لمدة 10 دقائق أخرى. صب محلول الأمينوسيلان بعناية في حاوية نفايات مخصصة ل CH 3 OH مع تتبعأمينوسيلان و CH3COOH.
    4. شطف أغطية مع الميثانول وصب الحل في حاوية النفايات المخصصة للميثانول.
    5. اشطف الأغطية ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منها باستخدام ddH2O. صفي الأغطية ، وخففي الرطوبة الزائدة ، وجففيها في الهواء تماما لمدة 10 دقائق.
  5. أداء إعداد الصفيف / البيوتين-PEG وظيفية من الأغطية.
    1. تحضير 1 M NaHCO 3 (الرقم الهيدروجيني 8.5) مخزون العمل عن طريق إذابة 84.5 ملغ من NaHCO3 في 1 مل من ddH2O. للتركيز النهائي ل 10 mM NaHCO 3 ، قم بتخفيف 1 M NaHCO3 إلى ddH2O (1:100).
    2. ارسم صفيفا شبكيا على الأغطية الأمينوسيلانية الجافة باستخدام قلم حاجز كاره للماء (انظر جدول المواد) وانتظر حتى يجف الحبر. اكتب معرفا على الغطاء لتحديد الاتجاه الصحيح. ضع الأغطية في غرفة رطبة.
      ملاحظة: يجب أن يتكون الصفيف من 16-20 مربعا، بحجم 4 مم × 4 مم تقريبا.
    3. لجعل محلول بيوتين-بيغ سكسينيميديل فاليرات (بيوتين-بيغ)/مبيغ سكسينيميديل فاليرات (mPEG)، أولا، قم بإزالة mPEG وبيوتين-بيغ (انظر جدول المواد) من الفريزر والتوازن إلى RT. أضف 153 ملغ من mPEG و 3.9 ملغ من البيوتين-بيغ (~ 1:39 البيوتين-PEG:mPEG) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل، وأعد التعليق في 609 ميكرولتر من 10 مللي متر ناهكو3 عن طريق السحب اللطيف. جهاز طرد مركزي عند 10000 × g لمدة دقيقة واحدة في RT لإزالة الفقاعات.
      ملاحظة: عمر النصف للتحلل المائي لفالات سكسينيميديل في المخزن المؤقت للدرجة الهيدروجينية 8.5 هو ~ 30 دقيقة. بعد إضافة المخزن المؤقت إلى mPEG، تابع الخطوات التالية في أسرع وقت ممكن. هذه الخطوة حاسمة.
    4. قم بتطبيق محلول البيوتين-PEG / mPEG لتغطية كل مربع بالكامل في صفائف الغطاء ، وعادة ما يكون 10-15 ميكرولتر لكل مربع. لا تسمح للسائل بتجاوز المساحة المحددة. قم بتخزين الأغطية في غرفة الرطوبة في الظلام لمدة 3-4 ساعات في RT.
    5. اغسل الأغطية بكميات وفيرة من الماء عن طريق غمسها بالتتابع في أكواب زجاجية 3 × 250 مل مملوءة ب ddH2O لمدة 10 ثوان لكل منها.
    6. اطرد كل الرطوبة من الأغطية بغاز النيتروجين. قم بتخزين الأغطية من الخلف إلى الخلف في أنبوب مخروطي مملوء بالنيتروجين بسعة 50 مل ملفوف بفيلم مانع للتسرب عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: انتقل فورا إلى الخطوة 2 أو قم بتخزين الأغطية عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الاستخدام.

2. إعداد SiMPull lysate

تنبيه: معدات الوقاية الشخصية المطلوبة للخطوات المتبقية من البروتوكول هي قفازات النتريل ونظارات السلامة ومعاطف المختبر.

ملاحظة: تم تحضير الليزات من خلايا CHO الملتصقة التي تعبر عن EGFR-GFP. تم طلاء الخلايا في طبق زراعة الأنسجة 60 ملم (TC60) بين عشية وضحاها12,13. تم استزراع خلايا CHO في DMEM مع استكمال 10 ٪ من مصل البقر الجنيني ، و 1 ٪ L-الجلوتامين ، و 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين ، و 500 نانوغرام / مل من geneticin (انظر جدول المواد). يمكن أيضا استخدام خطوط الخلايا الملتصقة الأخرى أو خلايا التعليق.

  1. قم بلوحة الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
    1. اغسل طبق الثقافة (الذي يحتوي على الخلايا) ب 1 مل من 1x PBS. أضف 1 مل من 1x Trypsin واحتضنها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا. باستخدام ماصة ، انقل الخلايا المنفصلة من الطبق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
    2. خذ 10 ميكرولتر من التربان الأزرق واخلطها مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا في أنبوب طرد مركزي منفصل. عد الخلايا باستخدام 10 ميكرولتر من خليط الخلايا في عداد خلية أوتوماتيكي ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. طبق 8 × 105 خلايا بين عشية وضحاها في طبق بتري TC60. طبق طبق واحد لكل حالة.
      ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة، كانت الخلايا إما غير معالجة أو عولجت بالبيرفاناديت وEGF كما هو موضح في الخطوة 2.4.1.
  2. قم بإعداد الحلول التالية لإعداد الخلية المحللة.
    1. تحضير الثلج البارد 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4).
    2. قم بإعداد مخزن مؤقت للتحلل ، وهو محلول مكون من منظف غير أيوني وغير متحلل بنسبة 1٪ (انظر جدول المواد) في 50 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.2) و 150 mM NaCl مع مثبط البروتياز / الفوسفاتيز (PPI) (1:100 من المخزون). ضع الأنبوب على المغذيات واترك المخزن المؤقت يختلط لمدة 15 دقيقة. احتفظ بالمحلول المعد على الجليد.
    3. قم بإعداد المخزن المؤقت ل Tyrode للحصول على تركيز نهائي يبلغ 135 mM NaCl و 10 mM KCl و 0.4 mM MgCl 2 و 1 mM CaCl 2 و 10 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني7.2) و 20 mM glucose و 0.1٪ Bovine Serum Albumin (BSA) (انظر جدول المواد). تسخين الحل إلى 37 درجة مئوية.
  3. إعداد السيطرة الإيجابية للفسفرة - 1 مللي متر علاج pervanadate.
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. Pervandate هو شكل بيروكسيد من vanadate - مثبط بروتين التيروزين فوسفاتيز16. يؤدي منع إزالة الفسفرة من البروتين عن طريق تثبيط نشاط الفوسفاتيز إلى عينة عالية الفسفرة.
    1. قم بإعداد مخزون 200 mM من أورثوفانادات الصوديوم المنشط (Na3VO4).
      1. لتحضير محلول 100 مل ، أضف 3.89 جم من Na3VO4 (انظر جدول المواد) إلى 90 مل من ddH2O وتذوب أثناء التحريك. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10 عن طريق إضافة HCl أو NaOH قطرة. إضافة HCl سيحول المحلول إلى اللون الأصفر.
      2. ارفع الحجم إلى 100 مل مع ddH2O. قم بغلي المحلول عن طريق تسخينه في الميكروويف. بعد الغليان ، سيكون المحلول عديم اللون.
      3. قم بتبريد الحل إلى RT وأعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10. كرر الغليان والتبريد وضبط الرقم الهيدروجيني مرتين إلى أربع مرات أخرى ، حتى يستقر الرقم الهيدروجيني عند 10. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. قم بإعداد مخزون من 30 mM pervanadate (PV) عن طريق خلط 20.4 ميكرولتر من 3٪ H 2 O 2 مع 100 ميكرولتر من 200 mM Na 3 VO 4 و 546.8 ميكرولتر من ddH 2 O (تركيزات متساوية المولات من H 2 O 2 وتنشيط Na3VO4). احتضن في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    3. قم بإعداد 1 mM PV في المخزن المؤقت ل Tyrode. بالنسبة لمحلول 10 مل ، أضف 0.33 مل من مخزون 30 mM PV إلى 9.67 مل من المخزن المؤقت ل Tyrode 37 درجة مئوية. علاج الخلايا على الفور.
    4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت ل Tyrode. أضف 3 مل من 1 mM PV في المخزن المؤقت ل Tyrode إلى الخلايا واحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. إجراء تحفيز الرباط.
    1. تحفيز الخلايا مع الرباط من الاهتمام باستخدام التركيز المناسب، والوقت، ودرجة الحرارة. للحصول على أقصى قدر من تحفيز EGFR ، احتضن مع 1 مل من عامل نمو البشرة 50 نانومتر (EGF ، انظر جدول المواد) + 1 mM من PV في مخزن Tyrode المؤقت لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. إجراء تحلل الخلايا.
    1. بعد العلاج الخلوي المطلوب ، ضع الطبق على الثلج واغسله بالثلج البارد 1x PBS. قم بإزالة الحجم الكامل ل PBS بالكامل باستخدام ماصة.
    2. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (الخطوة 2.2.2) إلى اللوحة. استخدم مكشطة الخلايا لسحب المخزن المؤقت حول اللوحة لتغطية الخلايا بالكامل. ضع ضغطا ثابتا وثابتا مع مكشطة الخلايا عبر السطح المستزرع بأكمله لتحليل الخلايا بالكامل.
      ملاحظة: يجب الحفاظ على حجم المخزن المؤقت للتحلل عند الحد الأدنى لضمان تركيز عال من البروتين.
    3. ماصة الخلايا المحللة ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل. احتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة. دوامة الليزات كل 5 دقائق.
      ملاحظة: إذا كان POI يتكون من وحدات فرعية متعددة أو كان حساسا للانفصال، فلا تقم بتدوير الليزات.
    4. قم بالطرد المركزي للخلايا المحللة عند 16000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل باستخدام ماصة. هذا يحتوي على البروتين الكلي lysate.
    5. احتفظ ب 10 ميكرولتر من الليزات وقم بتخفيفه إلى 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل لتحليل المقايسة اللونية ثنائية التشينكونين (BCA)17. تخزين البروتين الكلي المتبقي تحلل في -80 درجة مئوية.
    6. تحديد تركيز البروتين الكلي للليزات باستخدام تحليل BCA (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن تحضير إجمالي محللات البروتين في يوم التجربة واستخدامها طازجة أو تخزينها كأليكوتات تستخدم لمرة واحدة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 أسبوعا. لا تجمد / تذوب.

3. تفعيل المصفوفة مع الجسم المضاد البيوتينيل

  1. قم بإعداد الحلول التالية.
    1. T50 المخزن المؤقت ، وهو محلول من 10 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0) و 50 mM NaCl. الحل مستقر لمدة 1 شهر في RT.
    2. T50-BSA عن طريق استكمال المخزن المؤقت T50 مع 0.1 ملغ / مل من BSA. احتفظ بالمحلول المعد على الجليد.
    3. 10 ملغ / مل من بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4) في 1x PBS. تحضير هذا مباشرة قبل الاستخدام.
    4. 0.2 ملغم/مل من نيوترافيدين (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت T50.
      تنبيه: NaBH4 هو عامل اختزال وقابل للاشتعال. قم دائما بتطهير الحاوية بغاز النيتروجين بعد الاستخدام وتخزينها في مجفف.
  2. قم بتفعيل المصفوفة باستخدام الجسم المضاد البيوتينيل.
    1. قم بإزالة صفائف PEG-biotin الوظيفية من الفريزر وقم بموازنة الأنبوب المخروطي مع RT قبل الفتح. ضع الغطاء مع توجيه الصفيف لأعلى على طبق من زراعة الأنسجة (TC100) مبطن بطبقة مانعة للتسرب (TC100).
      ملاحظة: تقليل الإضاءة العلوية. يجب أن "تبرز" جميع الحلول على المربعات التي تحددها الصفيف الكارهة للماء. أضف حجما مناسبا من المحلول لتغطية كل مربع بالكامل (عادة 10-15 ميكرولتر) ولا تسمح للسائل بتجاوز المساحة المحددة. لإزالة السوائل بسرعة، استخدم خط فراغ داخلي متصل بقارورة فراغ لالتقاط النفايات. اسمح ل NaBH4 بتفريغ الغاز لمدة 1 ساعة قبل التخلص منه عن طريق ترك الأنبوب مفتوحا في غطاء الدخان الكيميائي. يعد علاج NaBH4 ضروريا لتقليل التألق الذاتي في الخلفية ، وبالتالي تقليل اكتشافات الجزيء الواحد الإيجابية الكاذبة.
    2. عالج كل مربع من الصفيف ب 10 ملغم / مل من NaBH 4 في 1x PBS لمدة4 دقائق في RT. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS.
    3. احتضن كل مربع لمدة 5 دقائق مع 0.2 ملغ / مل من نيوترافيدين في T50. يغسل ثلاث مرات مع T50-BSA.
      ملاحظة: يرتبط NeutrAvidin ب PEG-biotin ويوفر موقعا ملزما للأجسام المضادة البيوتينيل12،13،15.
    4. احتضان كل مربع لمدة 10 دقائق مع 2 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة الخاصة ب POI البيوتينيل في T50-BSA ؛ يغسل ثلاث مرات مع T50-BSA.
      ملاحظة: يستخدم البروتوكول الحالي البيوتينيل المضاد ل EGFR IgG (انظر جدول المواد) لالتقاط EGFR-GFP.

4. SiMPull من POI من محللات الخلية بأكملها

ملاحظة: ضع طبق TC100 من صفائف SiMPull الوظيفية على الجليد لبقية إعداد Simpoll. هذه الخطوة هي سحب POI من إجمالي تحلل البروتين. يجب عدم إعادة استخدام الليزات بعد الذوبان.

  1. قم بإعداد الحلول التالية.
    1. تحضير 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) / 0.1٪ غلوتارالدهيد (GA) في 1x PBS.
      تحذير: PFA و GA هي مثبتات كيميائية سامة ومواد مسرطنة محتملة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية. التخلص من المواد الكيميائية كنفايات خطرة وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية المحلية.
    2. تحضير 10 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4.
  2. قم بإذابة وخلط الليزات عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. حافظ على الجليد.
  3. تمييع 1 ميكرولتر من الليزات إلى 100 ميكرولتر بارد مثلج T50-BSA / PPI.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، حدد عامل التخفيف المناسب لإجمالي تحلل البروتين عن طريق تطبيق مجموعة من التخفيفات على الصفيف. الكثافة المثلى لمستقبلات SiMPull لكل منطقة صفيف هي 0.04-0.08 / ميكرومتر2. يمكن تقييم تخفيفات Lysate في الخطوة 6 (تحليل البيانات).
  4. احتضان الليزات على الصفيف لمدة 10 دقائق ؛ ثم يغسل أربع مرات مع T50-BSA / PPI الباردة المثلجة.
  5. قم بتخفيف الأجسام المضادة المضادة للفوسفوتيروزين المترافقة AF647 (انظر جدول المواد) في T50-BSA/PPI الباردة على الجليد واحتضنها على الصفيف لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام عموم مضاد ل pTyr (PY99)-AF647 IgG لتحديد السكان المفسفرين من EGFR-GFP. إن استخدام الأجسام المضادة ذات العلامات المباشرة يزيل الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية ، مما يزيد من خيارات وضع العلامات ويحسن اتساق النتائج. يمكن الحصول على الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية من مصادر تجارية. إذا لم تكن متاحة تجاريا ، يمكن تصنيف الأجسام المضادة حسب الطلب باستخدام تقنيات الاقتران البيولوجي القياسية ، وتتوفر مجموعات الاقتران الحيوي التجارية. يجب اختبار كل دفعة من الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت لظروف وضع العلامات المثلى من خلال إجراء SiMPull لقياس منحنى الجرعة وإيجاد نقطة التشبع.
  6. يغسل ست مرات باستخدام T50-BSA المثلج لمدة 6-8 دقائق.
  7. يغسل مرتين مع الثلج البارد 1x PBS.
  8. احتضن المصفوفة بمحلول PFA 4٪ / 0.1٪ GA لمدة 10 دقائق لمنع تفكك الأجسام المضادة.
  9. يغسل مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما باستخدام 10 ملليمتر Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 / PBS لتعطيل المثبتات.
    ملاحظة: بالنسبة للتجارب التي تستخدم أكثر من جسم مضاد واحد، (على سبيل المثال، الكشف عن مواقع فوسفوتيروزين متعددة)، كرر الخطوات 4.5-4.9. انظر الخطوة 6.2.9 للحصول على معلومات حول تحديد العائق الستيري بين اثنين من الأجسام المضادة.

5. الحصول على الصور

ملاحظة: يتم الحصول على صورة أحادية الجزيء باستخدام هدف TIRF 150x وفاصل صور يلتقط كل قناة طيفية في ربع معين من كاميرا emCCD (انظر جدول المواد). يتم الحصول على صور المعايرة لأول مرة للسماح بتسجيل القناة ومعايرة اكتساب الكاميرا باستخدام شبكة محاذاة قناة نانوية (nanogrid) تحتوي على 20 × 20 صفائف من 200 ± 50 نانومتر ثقوب على مسافة داخل الثقب تبلغ 3 ± 1 ميكرومتر (الحجم الإجمالي ~ 60 ميكرومتر × 60 ميكرومتر).

  1. قم بإجراء تسجيل القناة باتباع الخطوات أدناه.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى تسجيل دقيق للقناة لحساب التوطين المشترك للبواعث بشكل صحيح. هذه الخطوة حاسمة.
    1. تنظيف هدف النفط وإيداع قطرة من النفط على الهدف. ضع الشبكة النانوية على المسرح للتصوير. باستخدام الضوء الأبيض المرسل ، ركز على نمط الشبكة.
      ملاحظة: يتم الحصول على الصور ذات الشبكة النانوية باستخدام الضوء المرسل ، الذي يمر عبر الشبكة النانوية ويتم اكتشافه في جميع القنوات الطيفية. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام الخرز متعدد الفلورسنت الذي ينبعث منه التألق المكتشف في كل قناة. ستحتاج عملية الحصول على الصور إلى التحسين وفقا لكل إعداد مجهري.
    2. احصل على سلسلة من 20 صورة للشبكة. تأكد من أن وحدات البكسل غير مشبعة. احفظ سلسلة الصور ك "Fiducial".
    3. قم بإلغاء تركيز الشبكة النانوية لإنشاء نمط متجدد الهواء18. احصل على سلسلة من 20 صورة لإجراء معايرات الكسب. احفظ الصورة باسم "كسب".
    4. احصل على سلسلة من 20 صورة لتعويض الكاميرا عن طريق منع كل الضوء من الذهاب إلى الكاميرا. احفظ الصورة ك "خلفية".
  2. الحصول على صور Simpoll.
    ملاحظة: قبل تصوير صفيف الانزلاق الغطائي، استبدل حل Tris ب T50-BSA وقم بموازنة الصفيف إلى RT.
    1. تنظيف هدف النفط وإيداع زيت إضافي على الهدف. قم بتأمين صفيف الغطاء على مرحلة المجهر.
    2. قم بتحسين قوة الإثارة لكل فلوروفور وزاوية TIRF ووقت تكامل الكاميرا. الهدف هو تحقيق أعلى إشارة إلى ضوضاء مع تقليل التبييض الضوئي للعينة. سجل طاقة الليزر للتأكد من اتساقها في القياسات المستقبلية.
      ملاحظة: استخدمت الدراسة الحالية وقت التعرض 300 مللي ثانية للقناة الحمراء البعيدة و 1 ثانية للقناة الخضراء. تم استخدام ليزر 642 نانومتر في حوالي 500 ميكروواط من طاقة الليزر ، في حين تم استخدام ليزر 488 نانومتر عند 860 ميكروواط ، تم قياسه قبل عدسة الأنبوب.
    3. احصل على صور لكل عينة. قم بتصوير القناة الحمراء البعيدة أولا ، متبوعة بكل فلوروفور منخفض الطول الموجي لتقليل التبييض الضوئي. نظرا لانخفاض الحجم المستخدم لكل عينة، تحقق من مستوى المخزن المؤقت كل 30-45 دقيقة وقم بتجديده حسب الحاجة.

6. تحليل البيانات

  1. قم بتنزيل الرموز التجريبية.
    ملاحظة: توضح التعليمات البرمجية التجريبية المقدمة ومجموعات البيانات النموذجية سير عمل تحليل البيانات الكامل (ملفات الترميز التكميلية 1-4). تم العثور على متطلبات النظام المدرجة في SiMPullMain.m في ملف الترميز التكميلي 1.
    1. قم بفك ضغط وحفظ في دليل المستندات الشخصية / MATLAB (MacOS / Linux) أو المستندات \ MATLAB (Windows).
      ملاحظة: يؤدي هذا إلى إنشاء أربعة مجلدات جديدة: SiMPull_class و smite و "بيانات العينة" و "مخرجات تحليل العينة".
    2. افتح الملف "ReadMe_Setup.txt" الموجود في المجلد SiMPull_class.
    3. قم بتثبيت مربعات أدوات MATLAB و MATLAB: صندوق أدوات تركيب المنحنى ، وصندوق أدوات الحوسبة المتوازية ، وصندوق أدوات الإحصاء والتعلم الآلي.
    4. قم بتثبيت DipImage19 وفقا لتعليمات التنزيل.
    5. قم بتثبيت حزمة تحليل الجزيء الواحد "smite" كما هو موضح في ReadMe_setup.txt.
      ملاحظة: يتوفر "smite" على مستودع GitHub (انظر جدول المواد).
    6. افتح SiMPullMain.m، الموجود في المجلد SiMPull_class، عن طريق سحب الملف إلى نافذة MATLAB.
    7. قم بتغيير الدليل إلى ...\MATLAB\Sample Data\ بالنقر فوق أيقونة استعراض بحثا عن مجلد وتحديد المجلد.
  2. نظرة عامة على خطوات معالجة البيانات
    1. قم بتشغيل SiMPullMain.m - باتباع التعليمات لكل قسم. قم بتنفيذ كل قسم على حدة عن طريق وضع المؤشر في هذا القسم والنقر فوق أيقونة تشغيل القسم.
      ملاحظة: يتم وصف الخطوات العامة لتحليل البيانات في هذا القسم. تم العثور على تعليمات مفصلة في رمز SiMPullMain.m المصاحب.
    2. قم بتشغيل قسم "التهيئة" لتعيين المسار لتحديد القنوات الطيفية وحجم الصورة.
    3. قم بتشغيل قسم "البحث عن كسب الكاميرا وإزاحتها" لتحويل كسب الكاميرا إلى فوتونات باستخدام مجموعات بيانات الكسب والخلفية.
    4. قم بتشغيل قسم "تسجيل القناة" لحساب متوسط التحويل المرجح المحلي المستخدم لتسجيل الصور.
    5. تنسيق البيانات وتنظيمها. قم بتشغيل قسم "الانضمام إلى القنوات المتسلسلة في صورة رباعية". قم بتشغيل "إزالة الإطارات السيئة".
    6. قم بتشغيل قسم "تناسب الجزيئات المفردة وابحث عن الجزيئات المتداخلة".
      ملاحظة: ينفذ هذا القسم وظائف متعددة لتوطين جزيئات مفردة في كل قناة وتحديد أحداث التوطين المشترك بين القنوات الطيفية.
    7. لتحديد الحد الأدنى لعدد الفوتونات لكل تناسب GFP حقيقي ، قم بتشغيل "تحسين الحد الأدنى لعتبة الفوتون". هذه عملية تكرارية.
      1. أولا ، قم بتعيين smf. Thresholding_MinPhotons = [0، 0، 0] وقم بتشغيل القسم. حدد ملفات "بيانات فارغة" عند مطالبتك بذلك. كرر ذلك مع ملفات "CHO-EGFR-GFP".
      2. حدد قيمة عتبة دنيا مناسبة عن طريق مقارنة المدرجين التكراريين. تعيين smf. Thresholding_MinPhotons = [475، 0، 0] وقم بتشغيل القسم مرة أخرى.
    8. قم بتشغيل القسم "حساب النسبة المئوية ل GFP يناسب موجب لإشارة FR" لتصحيح تعريبات الخلفية وحساب القيم النهائية.
    9. نفذ الخيار 1 (الخطوة 6.2.10) أو الخيار 2 (الخطوة 6.2.11) حسب الحاجة التجريبية.
    10. الخيار 1: صحيح لعدد المستقبلات المتاحة في الغشاء البلازمي لربط الليغاند، كما هو موضح في المرجع15.
      1. أولا ، مستقبلات سطح التسمية ذات المستويات المشبعة من صبغة NHS Ester الفلورية (NHS-AF647 ، انظر جدول المواد). ثم قم بإجراء تجربة SiMPull لتحديد النسبة المئوية لتوطين GFP الذي يتزامن مع AF647.
        ملاحظة: يوفر هذا تقديرا لجزء المستقبلات المتاحة لوضع العلامات على NHS ونسبة المستقبلات على السطح (SR).
      2. قم بتطبيق تصحيح SR في الحساب النهائي: NGFP = (NLOC - NBG) * SR ، حيث NGFP هو العدد المصحح لتعريبات GFP ، و NBG هو رقم تعريب الخلفية ، و NLOC هو إجمالي الترجمات.
        ملاحظة: في المثال الحالي ، لا يتم تطبيق هذا التصحيح لأن Pervanadate قابل للنفاذ إلى الغشاء16 ، وبالتالي ، فإن عمل تثبيط الفوسفاتيز لا يقتصر على المستقبلات السطحية.
    11. الخيار 2: بالنسبة لقياسات الفسفرة متعددة المواقع، ضع في اعتبارك احتمال وجود عائق ستيري عند استخدام جسمين مضادين.
      ملاحظة: قد يسبب عائق ستيريك انخفاضا في النسبة المئوية المرصودة من المستقبلات المفسفرة للأجسام المضادة 1 عندما تكون في وجود الأجسام المضادة 2 (P12) ، مقارنة بالأجسام المضادة 1 وحدها (P1).
      1. استخدم SiMPull لتحديد P1 و P12 وحساب عامل التصحيح للعائق الستيري ، بعد المرجع15 المنشور سابقا.

النتائج

يظهر الرسم الكاريكاتوري الذي يصور عملية SiMPull في الشكل 1A. يتم تشغيل Coverslips باستخدام NeutrAvidin كمرساة للأجسام المضادة المضادة ل EGFR البيوتينيل لالتقاط EGFR-GFP من إجمالي تحلل البروتين. بعد غسل البروتين غير المرتبط ، يتم وضع علامة على المستقبلات المفسفرة بجسم مضاد مضاد للفوسفوتيروزي?...

Discussion

تم تحسين البروتوكول الموصوف هنا لتمكين القياسات الكمية لفسفرة المستقبلات على مستوى البروتين الواحد. تم تطوير العديد من التعديلات المباشرة ولكنها مهمة على بروتوكول SiMPull التي حسنت موثوقية القياس للكشف عن الفوسفو التيروزين ، بما في ذلك الحد من التألق الذاتي مع علاج NaBH4 وما بعد تثبيت ا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R35GM126934 و R01AI153617 و R01CA248166 إلى DSL. تم دعم هيئة إدارة الانتخابات من خلال برنامج ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) و JAR من قبل برنامج UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). نحن نقر بامتنان باستخدام المورد المشترك للفحص المجهري الفلوري لمركز السرطان الشامل بجامعة نيو مكسيكو ، بدعم من NIH P30CA118100. نود أن نعترف بالدكتورين أنكور جاين وتايكيجيب ها ، اللذين ألهم تطويرهما الأصلي ل SiMPull هذا العمل.
ES-C الكلمة الحالية: مجموعة الديناميكا المناعية ، مختبر المناعة التكاملية للسرطان ، مركز أبحاث السرطان ، المعهد الوطني للسرطان ، بيثيسدا

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaClT50 Buffer
100 mm Tissue Culture dishCELLTREAT229620Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710Hazardous
50 mL conical tubeFunctionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaClLysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dishCorning430166
8% Glutaraldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16020Hazardous
Acetone (C3H6O)Millipore Sigma270725Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albuminGold BiotechnologyA-420-1Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
Cell ScraperBioworld30900017-1
Conical Filtering FlaskFisher ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Electron Microscopy Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
emCCD cameraAndor iXon
Fetal Bovine Serum, OptimaBio-TechneS12450HHeat Inactivated
Fusion 360 softwareAutodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)VWRBDH7204-1Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)Sigma AldrichI8896Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F immersion oilZeiss444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling KitsBiotium92245Suggested conjugation kit
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaneUCT United ChemicalA0700Hazardous
NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDALook for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MicroscopeOlympus
Parafilm M Sealing FilmThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Analog Hot PlateCorning6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAbCell Signaling Technology2236BF
Potassium Chloride (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)Millipore Sigma1050330500Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameterRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printerRaise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottlesCorning1395-100CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image SplitterPhotometricsModel QV2
Refrigerated centrifugeEppendorfEP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting SlidesVWR10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis packagehttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma AldrichS6014Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)Millipore SigmaS9625Activate by successive heat and pH cycling
Sodium HydroxideVWRBDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)Millipore SigmaS6508Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)Millipore Sigma258105Hazardous
TetraSpeck MicrospheresThermo Fisher ScientificT7279multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) baseMillipore SigmaT1503
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120

References

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved