JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

Abstract

פוספורילציה היא שינוי פוסט-טרנסלציוני הכרחי המווסת את תפקוד החלבון ומכוון את תוצאות האיתות של התאים. השיטות הנוכחיות למדידת פוספורילציה של חלבונים אינן יכולות לשמר את ההטרוגניות בזרחון על פני חלבונים בודדים. הבדיקה של משיכה חד-מולקולה (SiMPull) פותחה כדי לחקור את ההרכב של קומפלקסים מקרומולקולריים באמצעות מיצוי חיסוני של חלבונים על מכסה זכוכית ולאחר מכן הדמיה של מולקולה אחת. הטכניקה הנוכחית היא התאמה של SiMPull המספקת כימות חזק של מצב הזרחון של קולטני ממברנה באורך מלא ברמת המולקולה הבודדת. הדמיה של אלפי קולטנים בודדים בדרך זו מאפשרת לכמת את דפוסי הזרחון של חלבונים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הליך SiMPull הממוטב, מהכנת דגימה ועד הדמיה. אופטימיזציה של הכנת זכוכית ופרוטוקולי קיבוע נוגדנים משפרת עוד יותר את איכות הנתונים. הפרוטוקול הנוכחי מספק קוד לניתוח נתונים של מולקולה בודדת המחשב את חלקם של הקולטנים הזרחניים בתוך דגימה. בעוד שעבודה זו מתמקדת בזרחון של קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR), ניתן להכליל את הפרוטוקול לקולטני ממברנה אחרים ולמולקולות איתות ציטוזוליות.

Introduction

איתות הקשור לממברנה מכוון על ידי שילוב של הפעלת קולטן ממברנה המושרה על ידי ליגנד וגיוס של חלבוני אביזר במורד הזרם המפיצים את האות. זרחון של טירוזינים מרכזיים בזנבות ציטופלסמיים של קולטנים הוא קריטי לייזום היווצרותם של קומפלקסי איתות, או איתותים 1,2. לכן, שאלה חשובה בביולוגיה היא כיצד דפוסי זרחון נוצרים ומתוחזקים כדי לגייס שותפים לאיתות ולהכתיב את התוצאות התאית. זה כולל את הבנת ההטרוגניות של זרחון הקולטן, הן בשפע והן בדפוסי הפוספוטירוזין הספציפיים שיכולים לספק אמצעי למניפולציה של יציאות איתות על ידי הכתבת הרכב האיתות 3,4,5,6,7. עם זאת, ישנן מגבלות בשיטות הנוכחיות לחקור זרחון חלבונים. ניתוח כתמים מערביים מצוין לתיאור מגמות של זרחון חלבונים, אך הוא כמותי למחצה8 ואינו מספק מידע על ההטרוגניות של המערכת מכיוון שאלפי עד מיליוני קולטנים ממוצעים יחד. בעוד שהכתמים המערביים מאפשרים לחקור דגימה באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוספו לטירוזינים ספציפיים, הם אינם יכולים לספק מידע על דפוסי זרחון מרובי אתרים בתוך אותו חלבון. פוספופרוטומיקה כמותית מדווחת על שפע פוספוטירוזין, אך ישנן מגבלות לאיתור זרחון מרובה אתרים, שכן שאריות העניין צריכות להיות ממוקמות בתוך אותו פפטיד (בדרך כלל 7-35 חומצות אמינו) שנוצר על ידי עיכול אנזימטי 9,10,11.

כדי להתגבר על המגבלות שהוזכרו לעיל, בדיקת המשיכה של מולקולה אחת כלפי מטה (SiMPull) הותאמה לכימות מצבי הזרחון של קולטנים שלמים ברמת המולקולה הבודדת. SiMPull הוכח לראשונה ככלי רב עוצמה לחקירת קומפלקסים מקרומולקולריים על ידי Jain et al.12,13. ב-SiMPull, קומפלקסים מקרומולקולריים עברו מיצוי חיסוני (IP) על כיסויי זכוכית פונקציונליים של נוגדנים ולאחר מכן נותחו באמצעות מיקרוסקופיה של מולקולה בודדת עבור מספר תת-יחידה של חלבונים ו-CO-IP עם רכיבים מורכבים12. שינוי של Kim et al.14, המכונה SiMBlot, היה הראשון שהשתמש בווריאציה של SiMPull כדי לנתח פוספורילציה של חלבונים שעברו דנטורציה. פרוטוקול SiMBlot מסתמך על לכידת חלבוני פני השטח של התאים שעברו ביוטינילציה באמצעות כיסויים מצופים NeutrAvidin, אשר נבדקים לאחר מכן לזרחון עם תוויות נוגדנים ספציפיות לפוספו14. למרות ההתקדמות הזו, היה צורך בשיפורים כדי להפוך את הכימות של שינויים פוסט-טרנסלציוניים לחזק יותר וישים יותר למגוון רחב יותר של חלבונים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישת SiMPull אופטימלית ששימשה לכימות דפוסי זרחון של קולטן גורם גדילה אפידרמלי שלם (EGFR) בתגובה למגוון מצבי ליגנד ומוטציות אונקוגניות15. בעוד שעבודה זו מתמקדת ב- EGFR, ניתן ליישם גישה זו על כל קולטן ממברנה וחלבונים ציטוזוליים בעלי עניין (POI), שעבורם קיימים נוגדנים איכותיים. הפרוטוקול כולל שלבים להפחתת הפלואורסצנציה אוטומטית של דגימה, תכנון מערך דגימות הדורש נפח דגימה מינימלי עם הכנה סימולטנית של עד 20 דגימות, ואופטימיזציה של תווי תיוג נוגדנים ותנאי קיבוע. אלגוריתמים לניתוח נתונים פותחו לזיהוי וכימות של מולקולות בודדות של חלבונים זרחניים.

Protocol

1. הכנת כיסוי

הערה: עבור שלב זה, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), הכולל שכבה כפולה של כפפות ניטריל, משקפי בטיחות או מגן פנים, ומעיל מעבדה.

  1. בצעו תחריט פיראנה כדי להסיר פסולת אורגנית מהזכוכית.
    זהירות: תמיסת פיראנה היא חומר מחמצן חזק שהוא קורוזיבי ותגובתי מאוד כאשר הוא בא במגע עם חומרים אורגניים. התגובה עם פסולת אורגנית היא אקסותרמית ובעלת פוטנציאל נפיץ. לכן, ההליך חייב להתבצע במכסה אדים כימי עם אבנט הוריד. כלי זכוכית Pyrex נדרשים כדי להתמודד עם פתרון פיראנה.
    1. הכינו את סביבת העבודה בתוך מכסה אדים כימי. מסדרים כיסויים ללא חפיפה בתחתית זכוכית 4 ליטר, "התגובה", ומניחים את התגובה על לוחית חמה בחום עדין. אפשרו לכלי הזכוכית להתחמם למשך 10 דקות. הניחו זכוכית "פסולת" 1 ליטר עם 500 מ"ל של ddH2O פרוקסימלית לכוס התגובה.
    2. הוסיפו 49 מ"ל של 12 N חומצה גופרתית (H2SO4) באיטיות לכוס התגובה עם פיפטה סרולוגית מזכוכית. יש לשטוף את הפיפטה בכוס הפסולת לפני הסילוק.
    3. הוסיפו 21 מ"ל של 30% מי חמצן (H2O2) באופן טיפתי עם פיפטה סרולוגית מזכוכית לכוס התגובה. פזרו באיטיות את טיפות H2O2 באופן שווה על פני החלק התחתון של בקבוקון התגובה כדי למנוע מרווה מקומית של תגובת התחריט של הפיראנה. יש לשטוף את הפיפטה בכוס הפסולת לפני הסילוק.
      אזהרה: הוסיפו תמיד את H2O2 ל-H2SO4, ולעולם לא להיפך.
    4. פיראנה תחרוט את הכיסויים במשך 30 דקות. עצבני בעדינות את התוכן של התגובה כל 5 דקות.
    5. מרווים את תמיסת הפיראנה על ידי שפיכת תכולת הפסולת לתוך התגובה. מעבירים את הנוזל באיטיות במורד דופן התגובה כדי למזער את ההתזה. הסר את התגובה מהפלטה החמה.
    6. כאשר התגובה מרווה ומתקררת, שפכו את תמיסת הפיראנה בחזרה לכוס הפסולת לנטרול מבלי להסיר את הכיסויים החרוטים מכוסות התגובה.
    7. לנטרל את תמיסת הפיראנה עם תוספת הדרגתית של בסיס חלש. לדוגמה, השתמש במסה מופרזת של 20 גרם של תמיסת סודיום ביקרבונט (NaHCO3)/100 מ"ל פיראנה.
      אזהרה: אין לאחסן פתרונות פיראנה במיכלי פסולת אטומים. הפתרון חייב תמיד להיות מנוטרל לפני הסילוק. תגובת הנטרול מייצרת בועות נמרצות ועשויה להיות נפיצה אם אינה נשלטת על ידי תוספת הדרגתית של הבסיס החלש.
    8. מערבבים את התמיסה המנוטרלת עם מוט ערבוב זכוכית ונותנים לה להגיב במשך שעתיים. העלו את ה-pH ל->4 והשליכו את הפתרון.
    9. בין התוספות של בסיס חלש לתמיסת הפיראנה, מעבירים את הכיסויים החרוטים מכוס התגובה לתוך משפך בוכנר עם מוט ערבוב זכוכית ושוטפים במשך 5 דקות בהפעלת ddH2O.
      הערה: המשך מיד לשלב הבא או אחסן את כיסויי הפיראנה החרוטים למשך עד שבועיים ב- ddH2O בצנצנת זכוכית אטומה או בצלחת פטרי (עטיפה בסרט איטום, ראה טבלת חומרים).
  2. אמבט-סוניק את הכיסויים בממסים אורגניים בהתאם לשלבים הבאים.
    1. מניחים את הכיסויים בצנצנת קופלין מזכוכית (ראו טבלת חומרים) ומכסים במתנול (CH3OH). אוטמים את המכסה לצנצנת עם סרט איטום ומרחצאות-סוניקט למשך 10 דקות. מזגו בזהירות את המתנול מתוך צנצנת קופלין לתוך בקבוק אחסון זכוכית.
    2. ממלאים את צנצנת קופלין באצטון (C3H6O), אוטמים את המכסה, ועושים אמבטיה-סוניקט למשך 10 דקות. מזגו בזהירות את האצטון מתוך צנצנת הקופלין לתוך בקבוק אחסון זכוכית.
      אזהרה: מתנול דליק ורעיל מאוד. יש להשתמש במכסה אדים כימי. אצטון הוא דליק ומגרה. לכן, טפלו בו ואחסנו אותו בזכוכית, והשתמשו בו במכסה אדים כימי. השליכו כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במתנול ובאצטון עד פי חמישה כל אחד.
  3. הפעל את משטח הכיסוי לצורך פונקציונליזציה של סילאן.
    1. אמבט-סוניקט עם 1 M אשלגן הידרוקסיד (KOH) במשך 20 דקות. בזהירות לשפוך את KOH מתוך צנצנת Coplin לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לשימוש חוזר.
      אזהרה: KOH הוא קורוזיבי ומגרה. יש להשתמש במכסה אדים כימי ולא לאחסן בזכוכית. אחסנו אותו בצינורות פוליפרופילן. השליכו כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר ב- KOH עד חמש פעמים.
    2. יש לשטוף פעמיים עם ddH2O. לנקז ddH2O מהכיסויים, ולאחר מכן לחמם כל כיסוי על ידי הנפת הלהבה של מבער בונזן כדי להסיר את כל לחות פני השטח. מניחים את הכיסויים בצנצנת קופלין יבשה.
  4. בצע כסות אמינוסילניזציה.
    1. הכן את תמיסת האמינוסילן על ידי ערבוב של 69.4 מ"ל של מתנול עם 3.6 מ"ל של חומצה אצטית (CH3COOH) בבקבוקון חרוטי. הוסיפו 720 μL של N-(2-אמינואתיל)-3-אמינופרופילטרימתוקסיסילן (אמינו-סילן) וערבבו היטב (ראו טבלת חומרים).
      אזהרה: חומצה אצטית היא דליקה וקורוזיבית. טפלו בפיפטות זכוכית ואחסנו בזכוכית. עבודה עם חומצה אצטית במכסה אדים כימי. אמינוסילן הוא סכנת שאיפה רעילה חריפה, רגישות וחומר מגרה. זה מזיק לחיים הימיים. יש להשתמש במכסה אדים כימי. השליכו את הכימיקלים כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
      הערה: אמינוסילן רגיש לאור ועובר הידרוליזה במהירות במים. כל השלבים עם מגיב זה צריכים להתבצע בתנאי תאורה מינימליים כדי לשמור על פעילות. טהרו את הבקבוק בגז חנקן והפעילו סרט איטום לפני האחסון במייבש כהה. החלף כל 6-9 חודשים.
    2. מיד להוסיף את תמיסת אמינוסילן לצנצנת קופלין. מכסים ומורחים את סרט האיטום, וממשיכים להגן מפני האור.
    3. דגירה של הכיסויים בתמיסת האמינוסילן למשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (RT). Bath-sonicate במשך דקה אחת ולאחר מכן דגירה במשך 10 דקות נוספות. יש לשפוך בזהירות את תמיסת האמינוסילן לתוך מיכל פסולת המיועד ל-CH3OH עם עקבות אמינוסילן ו-CH3COOH.
    4. יש לשטוף את הכיסויים במתנול ולשפוך את התמיסה למיכל פסולת המיועד למתנול.
    5. יש לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים במשך 2 דקות כל אחד עם ddH2O. לנקז את הכיסויים, לטשטש את עודפי הלחות ולייבש את האוויר לחלוטין למשך 10 דקות.
  5. בצע את הכנת המערך / תפקוד ביוטין-PEG של הכיסויים.
    1. הכן 1 M NaHCO3 (pH 8.5) מלאי עבודה על ידי המסת 84.5 מ"ג של NaHCO3 לתוך 1 מ"ל של ddH2O. לריכוז סופי של 10 mM NaHCO3, יש לדלל 1 M NaHCO3 ל-ddH2O (1:100).
    2. ציירו מערך רשת על הכיסויים המיאמיסילניים היבשים בעזרת עט מחסום הידרופובי (ראו טבלת חומרים) והמתינו עד שהדיו יתייבש. כתוב מזהה על הכיסוי כדי לסמן את הכיוון הנכון. מניחים את הכיסויים בתא לח.
      הערה: המערך צריך לכלול 16-20 ריבועים, בגודל של כ-4 מ"מ x 4 מ"מ.
    3. כדי להפוך את התמיסה ביוטין-PEG succinimidyl valerate (ביוטין-PEG)/mPEG succinimidyl valerate (mPEG), ראשית, הסר mPEG וביוטין-PEG (ראה טבלת חומרים) מהמקפיא ושיווי משקל ל-RT. הוסף 153 מ"ג של mPEG ו-3.9 מ"ג של ביוטין-PEG (~1:39 ביוטין-PEG:mPEG) לצינור מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל, והוסף מחדש ב-609 מיקרול של 10 mM NaHCO3 על ידי צנרת עדינה. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה אחת ב RT כדי להסיר בועות.
      הערה: זמן מחצית החיים של הידרוליזה של succinimidyl valerate במאגר pH 8.5 הוא ~ 30 דקות. לאחר הוספת המאגר ל- mPEG, המשך עם השלבים הבאים במהירות האפשרית. שלב זה הוא קריטי.
    4. החל את תמיסת ביוטין-PEG/mPEG כדי לכסות לחלוטין כל ריבוע במערכי הכיסויים, בדרך כלל 10-15 מיקרול' לריבוע. אין לאפשר לנוזל לעלות על גדותיו של החלל המוגדר. אחסנו את הכיסויים בתא לחות בחושך למשך 3-4 שעות ב-RT.
    5. שטפו את הכיסויים בכמויות אדירות של מים על ידי טבילה רציפה שלהם בכוסות זכוכית בגודל 3x250 מ"ל מלאות ב-ddH2O במשך 10 שניות כל אחת.
    6. הוציאו את כל הלחות מהכיסויים בגז חנקן. אחסנו את הכיסויים גב אל גב בצינור חרוטי 50 מ"ל מלא בחנקן, עטוף בסרט איטום בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: המשך מיד לשלב 2 או לאחסן כיסויים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני השימוש.

2. הכנת SiMPull lysate

אזהרה: ה-PPE הנדרש לשאר השלבים של הפרוטוקול הם כפפות ניטריל, משקפי בטיחות ומעילי מעבדה.

הערה: הליסאטים הוכנו מתאי CHO הדביקים המבטאים EGFR-GFP. התאים צופו בתרבית רקמה של 60 מ"מ (TC60) במשךהלילה 12,13. תאי CHO עברו תרבית ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-500 ננוגרם/מ"ל של גנטיקאין (ראו טבלת חומרים). ניתן להשתמש גם בקווי תאים דביקים אחרים או בתאי השעיה.

  1. צלחת את התאים בהתאם לשלבים הבאים.
    1. שטפו את צלחת התרבית (המכילה את התאים) ב-1 מ"ל של 1x PBS. הוסיפו 1 מ"ל של 1x טריפסין ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים. באמצעות פיפטה, מעבירים את התאים המנותקים מהצלחת לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    2. קח 10 μL של כחול טריפאן וערבב עם 10 μL של תרחיף התא בצינור צנטריפוגה נפרד. ספירת תאים באמצעות 10 μL של תערובת התאים במונה תאים אוטומטי, בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
    3. צלחת 8 x 105 תאים לילה בצלחת פטרי TC60. צלחת מנה אחת לכל תנאי.
      הערה: עבור המחקר הנוכחי, התאים לא טופלו או טופלו עם Pervanadate ו- EGF כמתואר בשלב 2.4.1.
  2. הכן את הפתרונות הבאים להכנת lysate התא.
    1. הכן קר כקרח 1x PBS (pH 7.4).
    2. הכינו מאגר ליזיס, תמיסה של 1% חומר ניקוי לא יוני ולא מתנוון (ראו טבלת חומרים) ב-50 mM Tris-HCl (pH 7.2) ו-150 mM NaCl בתוספת מעכב פרוטאז/פוספטאז (PPI) (1:100 מהמלאי). מניחים שפופרת על מאגוז ומאפשרים לחיץ לערבב במשך 15 דקות. שמור את הפתרון המוכן על הקרח.
    3. הכינו את החיץ של הטירוד לריכוז סופי של 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM גלוקוז ו-0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA) (ראו טבלת חומרים). חממו את התמיסה ל-37 מעלות צלזיוס.
  3. הכן את הבקרה החיובית עבור phosphorylation - 1 mM pervanadate טיפול.
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי. פרבנדאט הוא הצורה המחומצנת של מעכב ונדאט-אן של חלבון טירוזין פוספטזות16. מניעת דה-פוספורילציה של חלבונים על-ידי עיכוב פעילות פוספטאז גורמת לדגימה עם זרחון גבוה.
    1. הכינו מלאי של 200 mM של נתרן אורתובנדט פעיל (Na3VO4).
      1. כדי להכין תמיסה של 100 מ"ל, הוסיפו 3.89 גרם של Na3VO4 (ראו טבלת חומרים) ל-90 מ"ל של ddH2O והתמוססו תוך כדי ערבוב. התאם את ה- pH ל- 10 על-ידי הוספת HCl או NaOH בצורה נפתחת. הוספת HCl תהפוך את הפתרון לצהוב.
      2. הביאו נפח ל-100 מ"ל עם ddH2O. הרתיחו את התמיסה על ידי חימום במיקרוגל. לאחר הרתחה, הפתרון יהיה חסר צבע.
      3. מצננים את הפתרון ל-RT ומתאימים מחדש את ה-pH ל-10. יש לחזור על כוונון הרתיחה, הקירור וה-pH פעמיים עד ארבע פעמים נוספות, עד שה-pH יתייצב על 10. Aliquot ולחנות ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. הכן מלאי של 30 mM pervanadate (PV) על ידי ערבוב של 20.4 μL של 3% H2O2 עם 100 μL של 200 mM Na3VO4 ו- 546.8 μL של ddH2O (ריכוזים שווים של H2O2 והפעיל את Na3VO4). דגירה בחושך ב- RT במשך 15 דקות.
    3. הכן 1 mM PV במאגר של Tyrode. עבור פתרון של 10 מ"ל, הוסף 0.33 מ"ל של מלאי PV של 30 mM ל- 9.67 מ"ל של 37 °C של המאגר של Tyrode. לטפל בתאים מיד.
    4. לשטוף תאים פעם אחת עם 3 מ"ל של המאגר של Tyrode. הוסף 3 מ"ל של 1 mM PV במאגר של Tyrode לתאים ודגירה במשך 15 דקות ב 37 °C (74 °F).
  4. בצע את גירוי הליגנד.
    1. לעורר תאים עם ליגנד של עניין באמצעות ריכוז, זמן וטמפרטורה מתאימים. עבור גירוי EGFR מקסימלי, דגירה עם 1 מ"ל של 50 ננומטר גורם גדילה אפידרמלי (EGF, ראה טבלת חומרים) + 1 mM של PV במאגר של Tyrode למשך 5 דקות ב 37 °C (37 °C).
  5. לבצע ליזיס של תאים.
    1. לאחר הטיפול התאי הרצוי, הניחו את המנה על הקרח ושטפו עם 1x PBS קר כקרח. הסר לחלוטין את הנפח המלא של PBS באמצעות פיפטה.
    2. הוסף 180 μL של מאגר lysis (שלב 2.2.2) לצלחת. השתמשו במגרד תאים כדי למשוך חיץ סביב הצלחת כדי לכסות את התאים במלואם. הפעילו לחץ יציב ועקבי עם מגרד התאים על פני כל המשטח התרביתי כדי לשבש את התאים במלואם.
      הערה: נפח מאגר הליזיס צריך להישמר לכל הפחות כדי להבטיח ריכוז חלבון גבוה.
    3. פיפטה את התאים המכוסים והעבירה אותם לצינור של 1.5 מ"ל. שמור את הצינור על קרח במשך 30 דקות. מערבולת הליזטים כל 5 דקות.
      הערה: אם ה- POI מורכב מיחידות משנה מרובות או רגיש לדיסוציאציה, אל תסובב את ה- lysates.
    4. צנטריפוגה של התאים השקועים ב-16,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה. זה מכיל את סך החלבון lysate.
    5. שמרו 10 μL של הליזט ודללו אותו ל-90 μL של מאגר הליזיס עבור ניתוח בדיקה צבעונית ביסינכונינית (BCA)17. אחסנו את שארית החלבון ליזאט בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    6. קבע את ריכוז החלבון הכולל של הליזאט באמצעות ניתוח BCA (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ניתן להכין את סך כל החלבון lysates ביום הניסוי ולהשתמש בהם טריים או מאוחסנים כאליקוטים חד-פעמיים בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) למשך עד 12 שבועות. אין להקפיא/להפשיר.

3. פונקציונליזציה של המערך עם הנוגדן biotinylated

  1. הכן את הפתרונות הבאים.
    1. T50 Buffer, תמיסה של 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ו-50 mM NaCl. הפתרון יציב למשך חודש ב- RT.
    2. T50-BSA על ידי תוספת של מאגר T50 עם 0.1 מ"ג/מ"ל של BSA. שמור את הפתרון המוכן על הקרח.
    3. 10 מ"ג/מ"ל של נתרן בורוהידריד (NaBH4) ב-1x PBS. הכן זאת מיד לפני השימוש.
    4. 0.2 מ"ג/מ"ל של NeutrAvidin (ראו טבלת חומרים) במאגר T50.
      אזהרה: NaBH4 הוא חומר מחזר והוא דליק. תמיד לטהר את המיכל עם גז חנקן לאחר השימוש ולאחסן אותו במייבש.
  2. לתפקד את המערך עם הנוגדן biotinylated.
    1. הסר את המערכים הפונקציונליים של PEG-ביוטין מהמקפיא ושווי המשקל את הצינור החרוטי ל-RT לפני הפתיחה. הניחו את הכיסויים כשהמערך מכוון כלפי מעלה על סרט איטום מרופד בתרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ (TC100).
      הערה: צמצם את התאורה התקורה. כל הפתרונות צריכים "לחרוז" על הריבועים המוגדרים על ידי המערך ההידרופובי. הוסף נפח מתאים של תמיסה כדי לכסות לחלוטין כל ריבוע (בדרך כלל 10-15 μL) ואל תאפשר לנוזל להציף את השטח המוגדר. כדי להסיר במהירות נוזלים, השתמשו בקו ואקום פנימי המחובר לבקבוק ואקום כדי ללכוד פסולת. אפשרו ל-NaBH4 לעשות דגה במשך שעה אחת לפני הסילוק על ידי השארת הצינור פתוח במכסה האדים הכימי. טיפול NaBH4 נחוץ כדי להפחית את האוטו-פלואורסצנציה ברקע, ובכך להפחית זיהויים של מולקולות בודדות חיוביות כוזבות.
    2. טפלו בכל ריבוע של המערך עם 10 מ"ג/מ"ל של NaBH4 ב-1x PBS למשך 4 דקות ב-RT. שטפו שלוש פעמים עם PBS.
    3. דגירה של כל ריבוע למשך 5 דקות עם 0.2 מ"ג/מ"ל של NeutrAvidin ב-T50. יש לשטוף שלוש פעמים עם T50-BSA.
      הערה: NeutrAvidin נקשר ל-PEG-ביוטין ומספק אתר קשירת נוגדנים שעברו ביוטינילציה 12,13,15.
    4. דגירה של כל ריבוע למשך 10 דקות עם 2 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן ספציפי ל-POI שעבר ביוטינילציה ב-T50-BSA; לשטוף שלוש פעמים עם T50-BSA.
      הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-anti-EGFR IgG שעבר ביוטינילציה (ראה טבלת חומרים) כדי ללכוד EGFR-GFP.

4. SiMPull של POI מליאסטים של תאים שלמים

הערה: מקם את המנה TC100 של מערכי SiMPull פונקציונליים על קרח למשך שארית הכנת SiMPull. שלב זה הוא משיכה למטה של POI מכלל החלבון ליזט. אסור לעשות שימוש חוזר בליזאט לאחר ההפשרה.

  1. הכן את הפתרונות הבאים.
    1. הכן 4% paraformaldehyde (PFA)/0.1% glutaraldehyde (GA) ב 1x PBS.
      אזהרה: PFA ו- GA הם מקבעים כימיים רעילים וחומרים מסרטנים פוטנציאליים. ללבוש PPE. השליכו את הכימיקלים כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
    2. הכן 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
  2. להפשיר ולערבב את הליזאט על ידי צניחה עדינה למעלה ולמטה. תמשיכו לקרח.
  3. דילול 1 μL של הליזט לתוך 100 μL קר כקרח T50-BSA/PPI.
    הערה: במידת הצורך, קבע את מקדם הדילול המתאים של סך החלבון ליזט על-ידי החלת מגוון דילולים על המערך. הצפיפות האופטימלית של קולטני SiMPull לכל אזור מערך היא 0.04-0.08/μm2. ניתן להעריך דילולים של Lysate בשלב 6 (ניתוח נתונים).
  4. דגירה של הליזאט על המערך למשך 10 דקות; ואז לשטוף ארבע פעמים עם T50-BSA /PPI קר כקרח.
  5. דילול נוגדן אנטי-פוספוטירוזין מדולל AF647(ראה טבלת חומרים) ב-T50-BSA/PPI קר כקרח ודגירה על המערך במשך שעה אחת.
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי, פאן אנטי-pTyr (PY99)-AF647 IgG משמש לזיהוי האוכלוסייה הזרחנית של EGFR-GFP. השימוש בנוגדנים המסומנים ישירות מסיר את הצורך בנוגדנים משניים, מגדיל את אפשרויות הסימון ומשפר את עקביות התוצאות. ניתן לקבל נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית ממקורות מסחריים. אם הם אינם זמינים באופן מסחרי, נוגדנים יכולים להיות מסומנים בהתאמה אישית באמצעות טכניקות ביו-קונסיגנציה סטנדרטיות, וערכות ביו-מיזוג מסחריות זמינות. כל אצווה של נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי צריכה להיבדק לתנאי תיוג אופטימליים על ידי ביצוע SiMPull כדי למדוד עקומת מינון ולמצוא את נקודת הרוויה.
  6. לשטוף שש פעמים עם T50-BSA קר כקרח במשך 6-8 דקות בסך הכל.
  7. יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS קר כקרח.
  8. הדגירו את המערך עם תמיסת PFA/0.1% GA של 4% למשך 10 דקות כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים.
  9. יש לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחת עם 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS כדי להשבית את הקיבועים.
    הערה: לניסויים המשתמשים ביותר מנוגדן אחד (לדוגמה, זיהוי מספר אתרי פוספוטירוזין), חזור על שלבים 4.5-4.9. ראה שלב 6.2.9 לקבלת מידע על קביעת מכשול סטריק בין שני נוגדנים.

5. רכישת תמונה

הערה: רכישת תמונה של מולקולה בודדת מתבצעת באמצעות מטרת TIRF של 150x ומפצל תמונה הלוכד כל ערוץ ספקטרלי ברביע מסוים של מצלמת emCCD (ראו טבלת חומרים). תמונות כיול נרכשות לראשונה כדי לאפשר רישום תעלה וכיול השגת מצלמה עם רשת יישור תעלות ננו-פטרית (nanogrid) המכילה 20 x 20 מערכים של 200 ± חורים של 50 ננומטר במרחק תוך חור של 3 ± 1 מיקרומטר (גודל כולל ~ 60 מיקרומטר × 60 מיקרומטר).

  1. בצע רישום לערוץ בהתאם לשלבים הבאים.
    הערה: יש צורך ברישום ערוצים מדויק כדי לחשב כראוי את הקולוקליזציה של הפולטים. שלב זה הוא קריטי.
    1. נקו את מטרת הנפט והפקידו טיפת שמן על המטרה. הניחו את הננו-גריד על הבמה להדמיה. באמצעות אור לבן המועבר, התמקדו בתבנית הרשת.
      הערה: תמונות עם הננו-גריד נרכשות באמצעות אור מועבר, העובר דרך הננו-גריד ומתגלה בכל הערוצים הספקטרליים. לחלופין, ניתן להשתמש בחרוזים רב-פלואורסצנטיים הפולטים פלואורסצנציה שזוהתה בכל ערוץ. רכישת התמונה תצטרך להיות מותאמת בהתאם לכל מערך מיקרוסקופ.
    2. רכוש סדרה של 20 תמונות של הרשת. ודא שהפיקסלים אינם רוויים. שמור את סדרת התמונות כ-"Fiducial".
    3. נטרל את הננו-גריד כדי ליצור תבנית אוורירית18. רכשו סדרה של 20 תמונות לכיול רווחים. שמור את התמונה כ"רווח ".
    4. רכשו סדרה של 20 תמונות להסטת המצלמה על ידי חסימת כל האור מלהגיע למצלמה. שמור את התמונה כ"רקע ".
  2. רכוש תמונות SiMPull.
    הערה: לפני הדמיית מערך הכיסוי, החלף את פתרון Tris עבור T50-BSA ושווי המשקל את המערך ל- RT.
    1. נקו את מטרת השמן והפקידו שמן נוסף על המטרה. אבטחו את מערך הכיסויים בשלב המיקרוסקופ.
    2. מטב את עוצמת העירור של כל פלואורופור, את זווית ה-TIRF ואת זמן שילוב המצלמה. המטרה היא להשיג את האות לרעש הגבוה ביותר תוך מזעור ההלבנה הצילומית של הדגימה. תעד את עוצמת הלייזר לעקביות במדידות עתידיות.
      הערה: המחקר הנוכחי השתמש בזמן חשיפה של 300 אלפיות השנייה עבור הערוץ האדום הרחוק ו-1 שניות עבור הערוץ הירוק. הלייזר 642 ננומטר שימש בהספק לייזר של כ-500 μW, ואילו לייזר 488 ננומטר שימש ב-860 μW, שנמדד לפני עדשת הצינור.
    3. רכוש תמונות עבור כל דגימה. דמיינו תחילה את הערוץ האדום-רחוק, ואחריו כל פלואורופור באורך גל נמוך יותר כדי להפחית את ההלבנה הפוטו-אקונומיבית. בשל הנפח הנמוך המשמש עבור כל דגימה, בדוק את רמת המאגר כל 30-45 דקות ומלא מחדש לפי הצורך.

6. ניתוח נתונים

  1. הורד את קודי ההדגמה.
    הערה: קוד ההדגמה המסופק וערכות הנתונים לדוגמה מדגימים את זרימת העבודה המלאה של ניתוח נתונים (קבצי קידוד משלימים 1-4). דרישות המערכת המפורטות ב- SiMPullMain.m נמצאות בקובץ קידוד משלים 1.
    1. פתח את השרטוט ושמור בספריית מסמכים/MATLAB אישית (MacOS/Linux) או בספריית מסמכים\MATLAB (Windows).
      הערה: פעולה זו יוצרת ארבע תיקיות חדשות: SiMPull_class, smite, נתונים לדוגמה, יציאות ניתוח לדוגמה.
    2. פתח את הקובץ "ReadMe_Setup.txt" שנמצא בתיקיית SiMPull_class.
    3. התקן את ארגזי הכלים של MATLAB ו- MATLAB: ארגז כלים להתאמת עקומות, ארגז כלים למחשוב מקבילי וארגז כלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה.
    4. התקן DipImage19 בהתאם להוראות ההורדה.
    5. התקינו חבילת אנליזה של מולקולה בודדת "smite" כמתואר ב-ReadMe_setup.txt.
      הערה: "smite" זמין במאגר GitHub (ראה טבלת חומרים).
    6. פתח את SiMPullMain.m, שנמצא בתיקיית SiMPull_class, על-ידי גרירת הקובץ לחלון MATLAB.
    7. שנה את הספריה ל- ...\MATLAB\Sample Data\ על-ידי לחיצה על סמל עיון בתיקיה ובחירת התיקיה.
  2. מבט כולל על שלבי עיבוד נתונים
    1. הפעל את SiMPullMain.m - בהתאם להוראות עבור כל סעיף. הפעל כל מקטע בנפרד על-ידי הצבת הסמן במקטע זה ולחיצה על סמל הפעל מקטע.
      הערה: השלבים הכלליים לניתוח נתונים מתוארים בסעיף זה. הוראות מפורטות נמצאות בקוד SiMPullMain.m הנלווה.
    2. הפעל את המקטע "אתחול" כדי להגדיר את הנתיב להגדרת ערוצים ספקטרליים וגודל תמונה.
    3. הפעל את הקטע "מצא רווח מצלמה והסטה" כדי להמיר את רווח המצלמה לפוטונים באמצעות מערכי הנתונים רווח ורקע.
    4. הפעל את המקטע "רישום ערוץ" כדי לחשב את שינוי ההמרה הממוצע המשוקלל המקומי המשמש לרישום תמונה.
    5. עצב ואצור את הנתונים. הפעל את המקטע "הצטרף לערוצים רציפים לתוך תמונה מרובעת". הפעל "הסר מסגרות רעות".
    6. הפעל את הסעיף "התאם מולקולות בודדות ומצא מולקולות חופפות".
      הערה: מקטע זה מבצע פונקציות מרובות כדי למקם מולקולות בודדות בכל ערוץ ולקבוע אירועי קולוקליזציה בין ערוצים ספקטרליים.
    7. כדי לקבוע את ספירת הפוטונים המינימלית לכל התאמת GFP אמיתית, הפעל את "מיטוב סף הפוטונים המינימלי". זהו תהליך איטרטיבי.
      1. ראשית, הגדר smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] והפעל את הקטע. בחר קבצי "נתונים ריקים" כשתתבקש. חזור על הפעולה עם קבצי "CHO-EGFR-GFP".
      2. בחר ערך סף מינימלי מתאים על-ידי השוואת שתי ההיסטוגרמות. הגדר smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] והפעל את הקטע שוב.
    8. הפעל את הסעיף "חישוב אחוז GFP מתאים חיובי עבור אות FR" כדי לתקן לוקליזציות ברקע ולחשב ערכים סופיים.
    9. בצע אפשרות 1 (שלב 6.2.10) או אפשרות 2 (שלב 6.2.11) לפי צורך ניסיוני.
    10. אפשרות 1: נכון לגבי מספר הקולטנים הזמינים בקרום הפלזמה לקשירת ליגנד, כמתואר בהפניה15.
      1. ראשית, סמן קולטני פני שטח ברמות רוויות של צבע NHS Ester פלואורסצנטי (NHS-AF647, ראה טבלת חומרים). לאחר מכן בצע ניסוי SiMPull כדי לקבוע את אחוז הלוקליזציה של GFP שמתחברת ל- AF647.
        הערה: זה מספק הערכה של חלק הקולטנים הזמינים לתיוג NHS והיחס בין הקולטנים על פני השטח (SR).
      2. החל את תיקון ה- SR בחישוב הסופי: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, כאשר NGFP הוא המספר המתוקן של לוקליזציות GFP, NBG הוא מספר לוקליזציה ברקע, ו- NLOC הוא לוקליזציות כוללות.
        הערה: בדוגמה הנוכחית, תיקון זה אינו מיושם מכיוון שפרבנדט הוא חדיר ממברנה16 , ולכן הפעולה של עיכוב פוספטאז אינה מוגבלת לקולטני פני השטח.
    11. אפשרות 2: עבור מדידות זרחון מרובות אתרים, שקול את הפוטנציאל לעכבה סטרית כאשר נעשה שימוש בשני נוגדנים.
      הערה: הפרעה סטרית עלולה לגרום לירידה באחוז הנצפה של קולטנים זרחניים עבור נוגדן 1 בנוכחות נוגדן 2 (P12), בהשוואה לנוגדן 1 בלבד (P1).
      1. השתמש ב- SiMPull כדי לקבוע את P1 ו- P12 ולחשב את מקדם התיקון עבור הפרעה סטרית, בעקבות הפניה15 שפורסמה בעבר.

תוצאות

קריקטורה המתארת את תהליך SiMPull מוצגת באיור 1A. הכיסויים מתפקדים תוך שימוש ב-NeutrAvidin כעוגן לנוגדנים נגד EGFR שעברו ביוטינילציה כדי ללכוד EGFR-GFP מתוך סך כל החלבון ליזאטים. לאחר שטיפת חלבון לא מאוגד, הקולטנים הזרחניים מסומנים בנוגדן אנטי-פוספוטירוזין (אנטי-PY)15.

Discussion

הפרוטוקול שתואר כאן הותאם כדי לאפשר מדידות כמותיות של זרחון הקולטן ברמת החלבון הבודד. פותחו מספר שינויים פשוטים אך חשובים בפרוטוקול SiMPull ששיפרו את אמינות המדידה לזיהוי פוספו-טירוזין, כולל הפחתת האוטו-פלואורסצנציה באמצעות טיפול ב-NaBH4 ופרסום הדגימה כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים. שי...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R35GM126934, R01AI153617, ו- R01CA248166 ל- DSL. EMB נתמך באמצעות תוכנית ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) ו- JAR על ידי תוכנית UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). אנו מודים על השימוש במשאב המשותף של מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת ניו מקסיקו, הנתמך על ידי NIH P30CA118100. אנו רוצים להודות לד"ר אנקור ג'יין ולטאקיג'יפ הא, שהפיתוח המקורי שלהם של SiMPull היווה השראה לעבודה זו.
כתובת נוכחית של ES-C: קבוצת אימונודינמיקה, המעבדה לאימונולוגיה אינטגרטיבית של סרטן, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, בת'סדה

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaClT50 Buffer
100 mm Tissue Culture dishCELLTREAT229620Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710Hazardous
50 mL conical tubeFunctionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaClLysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dishCorning430166
8% Glutaraldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16020Hazardous
Acetone (C3H6O)Millipore Sigma270725Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albuminGold BiotechnologyA-420-1Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
Cell ScraperBioworld30900017-1
Conical Filtering FlaskFisher ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Electron Microscopy Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
emCCD cameraAndor iXon
Fetal Bovine Serum, OptimaBio-TechneS12450HHeat Inactivated
Fusion 360 softwareAutodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)VWRBDH7204-1Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)Sigma AldrichI8896Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F immersion oilZeiss444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling KitsBiotium92245Suggested conjugation kit
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaneUCT United ChemicalA0700Hazardous
NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDALook for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MicroscopeOlympus
Parafilm M Sealing FilmThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Analog Hot PlateCorning6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAbCell Signaling Technology2236BF
Potassium Chloride (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)Millipore Sigma1050330500Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameterRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printerRaise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottlesCorning1395-100CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image SplitterPhotometricsModel QV2
Refrigerated centrifugeEppendorfEP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting SlidesVWR10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis packagehttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma AldrichS6014Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)Millipore SigmaS9625Activate by successive heat and pH cycling
Sodium HydroxideVWRBDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)Millipore SigmaS6508Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)Millipore Sigma258105Hazardous
TetraSpeck MicrospheresThermo Fisher ScientificT7279multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) baseMillipore SigmaT1503
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120

References

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved