Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la preparazione del campione e l'analisi dei dati per quantificare la fosforilazione proteica utilizzando un test di pull-down a singola molecola (SiMPull) migliorato.

Abstract

La fosforilazione è una modifica post-traduzionale necessaria che regola la funzione proteica e dirige i risultati della segnalazione cellulare. Gli attuali metodi per misurare la fosforilazione delle proteine non possono preservare l'eterogeneità della fosforilazione tra le singole proteine. Il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato sviluppato per studiare la composizione di complessi macromolecolari tramite immunoprecipitazione di proteine su un coverslip di vetro seguito da imaging a singola molecola. La tecnica attuale è un adattamento di SiMPull che fornisce una robusta quantificazione dello stato di fosforilazione dei recettori di membrana a lunghezza intera a livello di singola molecola. L'imaging di migliaia di singoli recettori in questo modo consente di quantificare i modelli di fosforilazione delle proteine. Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura SiMPull ottimizzata, dalla preparazione del campione all'imaging. L'ottimizzazione della preparazione del vetro e dei protocolli di fissazione degli anticorpi migliora ulteriormente la qualità dei dati. L'attuale protocollo fornisce il codice per l'analisi dei dati a singola molecola che calcola la frazione di recettori fosforilati all'interno di un campione. Mentre questo lavoro si concentra sulla fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il protocollo può essere generalizzato ad altri recettori di membrana e molecole di segnalazione citosolica.

Introduzione

La segnalazione associata alla membrana è sintonizzata da una combinazione di attivazione del recettore di membrana indotta dal ligando e reclutamento di proteine accessorie a valle che propagano il segnale. La fosforilazione delle tirosinine chiave nelle code citoplasmatiche dei recettori è fondamentale per avviare la formazione di complessi di segnalazione, o signalosomi ^1,2. Pertanto, una domanda importante in biologia è come vengono creati e mantenuti i modelli di fosforilazione per reclutare partner di segnalazione e dettare i risultati cellulari. Ciò include la comprensione dell'eterogeneità della fosforilazione del recettore, sia in abbondanza che nei modelli specifici di fosfotirosina che possono fornire un mezzo per manipolare le uscite di segnalazione dettando la composizione del signalosoma 3,4,5,6,7. Tuttavia, ci sono limitazioni nei metodi attuali per interrogare la fosforilazione delle proteine. L'analisi Western blot è eccellente per descrivere le tendenze della fosforilazione delle proteine, ma è semi-quantitativa⁸ e non fornisce informazioni sull'eterogeneità del sistema perché migliaia o milioni di recettori sono mediati insieme. Mentre i western blot consentono di sondare un campione utilizzando anticorpi fosfo-specifici contro tirosine specifiche, non possono fornire informazioni sui modelli di fosforilazione multisito all'interno della stessa proteina. La fosfoproteomica quantitativa riporta l'abbondanza di fosfotirosina, ma ci sono limitazioni al rilevamento della fosforilazione multisito, poiché i residui di interesse devono essere localizzati all'interno dello stesso peptide (tipicamente 7-35 amminoacidi) generato dalla digestione enzimatica ^9,10,11.

Per superare i limiti sopra menzionati, il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato adattato per quantificare gli stati di fosforilazione dei recettori intatti a livello di singola molecola. SiMPull è stato dimostrato per la prima volta come un potente strumento per interrogare complessi macromolecolari da Jain et ^al.12,13. In SiMPull, i complessi macromolecolari sono stati immunoprecipitati (IP) su coverslip di vetro funzionalizzati con anticorpi e quindi analizzati attraverso la microscopia a singola molecola per il numero di subunità proteiche e co-IP con componenti complessi¹². Una modifica di Kim et ^al.14, chiamata SiMBlot, è stata la prima a utilizzare una variazione di SiMPull per analizzare la fosforilazione delle proteine denaturate. Il protocollo SiMBlot si basa sulla cattura di proteine di superficie cellulari biotinilate utilizzando coverslip rivestiti con NeutrAvidin, che vengono quindi sondati per la fosforilazione con l'etichettatura degli anticorpi fosfo-specifici¹⁴. Nonostante questi progressi, erano necessari miglioramenti per rendere la quantificazione della modificazione post-traduzionale più robusta e applicabile a una gamma più ampia di proteine.

Il presente protocollo descrive un approccio SiMPull ottimizzato che è stato utilizzato per quantificare i modelli di fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico intatto (EGFR) in risposta a una serie di condizioni del ligando e mutazioni oncogeniche¹⁵. Mentre questo lavoro si concentra sull'EGFR, questo approccio può essere applicato a qualsiasi recettore di membrana e proteine citosoliche di interesse (POI), per le quali sono disponibili anticorpi di qualità. Il protocollo include passaggi per ridurre l'autofluorescenza del campione, un design dell'array di campioni che richiede un volume minimo del campione con preparazione simultanea fino a 20 campioni e l'ottimizzazione delle condizioni di etichettatura e fissazione degli anticorpi. Sono stati sviluppati algoritmi di analisi dei dati per il rilevamento e la quantificazione di proteine fosforilate a singola molecola.

Protocollo

1. Preparazione coverslip

NOTA: Per questo passaggio, è necessario indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), che includono un doppio strato di guanti in nitrile, occhiali di sicurezza o visiera e un camice da laboratorio.

1. Eseguire l'incisione piranha per rimuovere i detriti organici dal vetro.
   ATTENZIONE: La soluzione di Piranha è un forte agente ossidante corrosivo e altamente reattivo a contatto con materiali organici. La reazione con detriti organici è esotermica e potenzialmente esplosiva. Pertanto, la procedura deve essere eseguita in una cappa chimica con l'anta abbassata. La vetreria Pyrex è necessaria per gestire la soluzione di piranha.
   1. Preparare lo spazio di lavoro all'interno di una cappa aspirante chimica. Disporre i coverslip senza sovrapposizioni sul fondo di un bicchiere di vetro da 4 L, il becher "a reazione" e posizionare il becher di reazione su una piastra riscaldante con calore delicato. Lasciare scaldare la vetreria per 10 minuti. Posizionare un becher di vetro "di scarto" da 1 L con 500 mL di ddH₂O prossimale al becher di reazione.
   2. Aggiungere lentamente 49 mL di acido solforico 12 N (H₂SO₄) al becher di reazione con una pipetta sierologica di vetro. Risciacquare la pipetta nel becher di scarto prima dello smaltimento.
   3. Aggiungere 21 mL di perossido di idrogeno al 30% (H₂O₂) a goccia con una pipetta sierologica di vetro al becher di reazione. Distribuire lentamente le goccioline H₂O₂ in modo uniforme sul fondo del pallone di reazione per evitare la tempra localizzata della reazione di incisione piranha. Risciacquare la pipetta nel becher di scarto prima dello smaltimento.
      ATTENZIONE: aggiungere sempre H₂O₂ in H₂SO₄ e mai viceversa.
   4. Piranha incide le coperture per 30 minuti. Agitare delicatamente il contenuto del becher di reazione ogni 5 minuti.
   5. Spegnere la soluzione di piranha versando il contenuto del becher di scarto nel becher di reazione. Trasferire il liquido lentamente lungo la parete del becher di reazione per ridurre al minimo gli schizzi. Rimuovere il becher di reazione dalla piastra di cottura.
   6. Quando la reazione viene spenta e raffreddata, versare nuovamente la soluzione di piranha nel becher di scarto per la neutralizzazione senza rimuovere le coperture incise dal becher di reazione.
   7. Neutralizzare la soluzione piranha con l'aggiunta graduale di una base debole. Ad esempio, utilizzare una massa eccessiva di 20 g di bicarbonato di sodio (NaHCO₃) / 100 mL di soluzione di piranha.
      ATTENZIONE: Non conservare le soluzioni di piranha in contenitori sigillati per rifiuti. La soluzione deve essere sempre neutralizzata prima dello smaltimento. La reazione di neutralizzazione produce bolle vigorose e può essere esplosiva se non controllata dall'aggiunta graduale della base debole.
   8. Mescolare la soluzione neutralizzata con un'asta di vetro e lasciarla reagire per 2 ore. Aumentare il pH a >4 e smaltire la soluzione.
   9. Tra le aggiunte di base debole alla soluzione di piranha, trasferire i coverslips incisi dal becher di reazione in un imbuto Buchner con un'asta di agitazione in vetro e risciacquare per 5 minuti in ddH₂O in esecuzione.
      NOTA: Procedere immediatamente al passaggio successivo o conservare le coperture incise piranha per un massimo di 2 settimane in ddH₂O in un barattolo di vetro sigillato o in una capsula di Petri (avvolgere con pellicola sigillante, vedere Tabella dei materiali).
2. Bagnare le coperture in solventi organici seguendo i passaggi seguenti.
   1. Posizionare le coperture in un barattolo di vetro Coplin (vedere Tabella dei materiali) e coprire con metanolo (CH₃OH). Sigillare il coperchio al barattolo con pellicola sigillante e bagno-sonicate per 10 minuti. Versare con cura il metanolo dal barattolo Coplin in una bottiglia di vetro.
   2. Riempire il barattolo Coplin con acetone (C₃H₆O), sigillare il coperchio e bagnare per 10 minuti. Versare con cura l'acetone dal barattolo Coplin in una bottiglia di vetro.
      ATTENZIONE: il metanolo è infiammabile e acutamente tossico. Utilizzare in una cappa aspirante chimica. L'acetone è infiammabile e irritante. Pertanto, maneggiarlo e conservarlo in vetro e utilizzarlo in una cappa aspirante chimica. Smaltire come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
      NOTA: Metanolo e acetone possono essere riutilizzati fino a cinque volte ciascuno.
3. Attivare la superficie coverslip per la funzionalizzazione del silano.
   1. Bagno-sonicato con idrossido di potassio 1 M (KOH) per 20 min. Versare con attenzione il KOH dal barattolo Coplin in un tubo conico da 50 ml per il riutilizzo.
      ATTENZIONE: KOH è corrosivo e irritante. Utilizzare in una cappa aspirante chimica e non conservare in vetro. Conservalo in tubi di polipropilene. Smaltire come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
      NOTA: KOH può essere riutilizzato fino a cinque volte.
   2. Risciacquare due volte con ddH₂O. Scolare ddH₂O dai coperchi, quindi riscaldare ogni coverslip agitando la fiamma di un bruciatore Bunsen per eliminare tutta l'umidità superficiale. Posizionare le coperture in un barattolo coplin asciutto.
4. Eseguire l'aminosilanizzazione coverslip.
   1. Preparare la soluzione di aminosilano mescolando 69,4 mL di metanolo con 3,6 ml di acido acetico (CH₃COOH) in un matraccio conico. Aggiungere 720 μL di N-(2-amminoetil)-3-amminopropiltrimetossisilano (aminosilano) e mescolare bene (vedere Tabella dei materiali).
      ATTENZIONE: l'acido acetico è infiammabile e corrosivo. Maneggiare con pipette di vetro e conservare in vetro. Lavora con acido acetico in una cappa chimica. L'aminosilano è un rischio di inalazione acutamente tossico, un sensibilizzante e un irritante. È dannoso per la vita acquatica. Utilizzare in una cappa aspirante chimica. Smaltire le sostanze chimiche come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
      NOTA: L'aminosilano è fotosensibile e idrolizza rapidamente in acqua. Tutti i passaggi con questo reagente devono essere eseguiti in condizioni di luce minime per mantenere l'attività. Pulire la bottiglia con azoto gassoso e applicare la pellicola sigillante prima di conservarla in un essiccatore scuro. Sostituire ogni 6-9 mesi.
   2. Aggiungere immediatamente la soluzione di aminosilano al barattolo coplin. Coprire e applicare il film sigillante, continuando a proteggere dalla luce.
   3. Incubare i coverslip nella soluzione di aminosilano per 10 minuti al buio a temperatura ambiente (RT). Bath-sonicate per 1 minuto e poi incubare per altri 10 minuti. Versare con attenzione la soluzione di aminosilano in un contenitore per rifiuti designato per CH₃OH con tracce di aminosilano e CH₃COOH.
   4. Risciacquare i coperchi con metanolo e versare la soluzione in un contenitore per rifiuti designato per il metanolo.
   5. Risciacquare le coverslip tre volte per 2 minuti ciascuna con ddH₂O. Scolare le coperture, tamponare l'umidità in eccesso e asciugare completamente all'aria per 10 minuti.
5. Eseguire la preparazione dell'array/funzionalizzazione biotina-PEG dei coverslip.
   1. Preparare 1 M NaHCO₃ (pH 8,5) di stock di lavoro sciogliendo 84,5 mg di NaHCO₃ in 1 mL di ddH₂O. Per la concentrazione finale di 10 mM NaHCO₃, diluire 1 M NaHCO₃ in ddH₂O (1:100).
   2. Disegna una griglia sui coperchi aminosilanizzati asciutti con una penna barriera idrofoba (vedi Tabella dei materiali) e attendi che l'inchiostro si asciughi. Scrivi un identificatore sulla copertina per contrassegnare l'orientamento corretto. Posizionare i coverslips in una camera umidificata.
      NOTA: l'array deve essere composto da 16-20 quadrati, di circa 4 mm x 4 mm.
   3. Per produrre la soluzione di biotina-PEG succinimidyl valerate (biotin-PEG)/mPEG succinimidyl valerate (mPEG), in primo luogo, rimuovere mPEG e biotina-PEG (vedere Tabella dei materiali) dal congelatore ed equilibrare a RT. Aggiungere 153 mg di mPEG e 3,9 mg di biotina-PEG (~1:39 biotina-PEG:mPEG) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere in 609 μL di 10 mM NaHCO₃ mediante un tubo delicato. Centrifugare a 10.000 x g per 1 minuto a RT per rimuovere le bolle.
      NOTA: L'emivita di idrolisi del succinimidyl valerate in pH 8,5 tampone è di ~ 30 min. Dopo aver aggiunto il buffer a mPEG, procedere con i seguenti passaggi il più rapidamente possibile. Questo passaggio è fondamentale.
   4. Applicare la soluzione di biotina-PEG/mPEG per coprire completamente ogni quadrato negli array di coverslip, in genere 10-15 μL per quadrato. Non lasciare che il liquido superi lo spazio definito. Conservare le coperture in una camera di umidità al buio per 3-4 ore a RT.
   5. Lavare le coperture con abbondanti quantità di acqua immergendole sequenzialmente in 3 bicchieri di vetro da 250 ml riempiti con ddH₂O per 10 s ciascuno.
   6. Scaccia tutta l'umidità dai coperchi con azoto gassoso. Conservare le coperture back-to-back in un tubo conico da 50 mL riempito di azoto avvolto con pellicola sigillante a -20 °C.
      NOTA: Procedere immediatamente al passaggio 2 o conservare le coperture a -20 °C per un massimo di 1 settimana prima dell'uso.

2. Preparazione del lisato SiMPull

ATTENZIONE: I DPI richiesti per le fasi rimanenti del protocollo sono guanti in nitrile, occhiali di sicurezza e camici da laboratorio.

NOTA: I lisati sono stati preparati dalle cellule CHO aderenti che esprimono EGFR-GFP. Le cellule sono state placcate in una coltura tissutale di 60 mm (TC60) durante la notte^12,13. Le cellule CHO sono state coltivate in DMEM integrate con il 10% di siero bovino fetale, l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina-streptomicina e 500 ng/ ml di geneticaina (vedere Tabella dei materiali). Possono essere utilizzate anche altre linee cellulari aderenti o celle di sospensione.

1. Placcare le celle seguendo i passaggi seguenti.
   1. Lavare il piatto di coltura (contenente le cellule) con 1 mL di 1x PBS. Aggiungere 1 mL di 1x Tripsina e incubare per 5 minuti a 37 °C per staccare le cellule. Utilizzando una pipetta, trasferire le celle staccate dal piatto a un tubo centrifugo da 1,5 ml.
   2. Prendere 10 μL di tripano blu e mescolare con 10 μL di sospensione cellulare in un tubo centrifugo separato. Contare le celle utilizzando 10 μL della miscela cellulare in un contatore automatico di celle, secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
   3. Piastra 8 x 10⁵ celle durante la notte in una capsula di Petri TC60. Piatto un piatto per condizione.
      NOTA: Per il presente studio, le cellule non sono state trattate o trattate con Pervanadate ed EGF come descritto nel passaggio 2.4.1.
2. Preparare le seguenti soluzioni per la preparazione del lisato cellulare.
   1. Preparare 1 PBS ghiacciato (pH 7,4).
   2. Preparare il tampone di lisi, una soluzione di detergente non ionico all'1% non degenerante (vedi Tabella dei materiali) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) e 150 mM NaCl integrato con Proteasi/Inibitore della Fosfatasi (PPI) (1:100 da magazzino). Posizionare il tubo su un nutator e lasciare che il tampone si mescoli per 15 minuti. Conservare la soluzione preparata sul ghiaccio.
   3. Preparare il tampone di Tyrode per una concentrazione finale di 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM di glucosio e 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) (vedere Tabella dei materiali). Riscaldare la soluzione a 37 °C.
3. Preparare il controllo positivo per la fosforilazione - 1 mM di trattamento con pervanadato.
   NOTA: questo passaggio è facoltativo. Pervandate è la forma perossidata di vanadato,un inibitore della proteina tirosina fosfatasi¹⁶. Prevenire la defosforilazione delle proteine inibendo l'attività della fosfatasi si traduce in un campione altamente fosforilato.
   1. Preparare uno stock di 200 mM di ortovanadato di sodio attivato (Na₃VO₄).
      1. Per preparare una soluzione da 100 ml, aggiungere 3,89 g di Na₃VO₄ (vedere Tabella dei materiali) a 90 mL di ddH₂O e sciogliere mescolando. Regolare il pH a 10 aggiungendo HCl o NaOH a goccia. L'aggiunta di HCl renderà la soluzione gialla.
      2. Portare il volume a 100 ml con ddH₂O. Far bollire la soluzione riscaldandola nel microonde. Dopo l'ebollizione, la soluzione sarà incolore.
      3. Raffreddare la soluzione a RT e regolare nuovamente il pH a 10. Ripetere l'ebollizione, il raffreddamento e la regolazione del pH altre due o quattro volte, fino a quando il pH si stabilizza a 10. Aliquota e conservare a -20 °C.
   2. Preparare uno stock di 30 mM pervanadato (PV) mescolando 20,4 μL di 3% H₂O₂ con 100 μL di 200 mM Na₃VO₄ e 546,8 μL di ddH₂O (concentrazioni equimolari di H₂O₂ e Na₃VO₄ attivato). Incubare al buio a RT per 15 min.
   3. Preparare 1 mM PV nel buffer di Tyrode. Per una soluzione da 10 mL, aggiungere 0,33 mL di stock fotovoltaico da 30 mM a 9,67 mL di tampone Tyrode a 37 °C. Trattare immediatamente le cellule.
   4. Lavare le cellule una volta con 3 ml di tampone di Tyrode. Aggiungere 3 mL di 1 mM PV nel tampone di Tyrode alle cellule e incubare per 15 minuti a 37 °C.
4. Eseguire la stimolazione del ligando.
   1. Stimolare le cellule con il ligando di interesse utilizzando la concentrazione, il tempo e la temperatura appropriati. Per la massima stimolazione EGFR, incubare con 1 mL di 50 nM di fattore di crescita epidermico (EGF, vedi Tabella dei materiali) + 1 mM di PV nel tampone di Tyrode per 5 minuti a 37 °C.
5. Eseguire la lisi cellulare.
   1. Dopo il trattamento cellulare desiderato, posizionare il piatto su ghiaccio e lavare con 1x PBS ghiacciato. Rimuovere completamente l'intero volume di PBS utilizzando una pipetta.
   2. Aggiungere 180 μL di tampone di lisi (punto 2.2.2) alla piastra. Utilizzare un raschietto cellulare per tirare il tampone attorno alla piastra per coprire completamente le celle. Applicare una pressione ferma e costante con il raschietto cellulare su tutta la superficie coltivata per lisare completamente le cellule.
      NOTA: Il volume del tampone di lisi deve essere mantenuto al minimo per garantire un'elevata concentrazione proteica.
   3. Pipettare le celle lisate e trasferirle in un tubo da 1,5 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio per 30 minuti. Vortice i lisati ogni 5 min.
      NOTA: se il POI è costituito da più subunità o è sensibile alla dissociazione, non vorticare i lisati.
   4. Centrifugare le cellule lisate a 16.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 ml utilizzando una pipetta. Questo contiene il lisato proteico totale.
   5. Riservare 10 μL del lisato e diluirlo in 90 μL del tampone di lisi per l'analisi del saggio colorimetrico bicinchoninico (BCA)¹⁷. Conservare il lisato proteico totale rimanente a -80 °C.
   6. Determinare la concentrazione totale di proteine lisate utilizzando l'analisi BCA (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: i lisati proteici totali possono essere preparati il giorno dell'esperimento e utilizzati freschi o conservati come aliquote monouso a -80 °C per un massimo di 12 settimane. Non congelare/scongelare.

3. Funzionalizzazione dell'array con l'anticorpo biotinilato

1. Preparare le soluzioni seguenti.
   1. T50 Buffer, una soluzione di 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 50 mM NaCl. La soluzione è stabile per 1 mese a RT.
   2. T50-BSA integrando il tampone T50 con 0,1 mg/mL di BSA. Conservare la soluzione preparata sul ghiaccio.
   3. 10 mg/mL di boroidruro di sodio (NaBH₄) in 1x PBS. Preparare questo immediatamente prima dell'uso.
   4. 0,2 mg/mL di NeutrAvidin (vedere Tabella dei materiali) in tampone T50.
      ATTENZIONE: NaBH₄ è un agente riducente ed è infiammabile. Pulire sempre il contenitore con azoto gassoso dopo l'uso e conservarlo in un essiccatore.
2. Funzionalizzare l'array con l'anticorpo biotinilato.
   1. Rimuovere gli array funzionalizzati PEG-biotina dal congelatore ed equilibrare il tubo conico in RT prima dell'apertura. Posizionare il coverslip con l'array orientato verso l'alto su un piatto di coltura tissutale (TC100) rivestito con pellicola sigillante.
      NOTA: ridurre al minimo l'illuminazione dall'alto. Tutte le soluzioni dovrebbero "perline" sui quadrati definiti dall'array idrofobo. Aggiungere un volume appropriato di soluzione per coprire completamente ogni quadrato (in genere 10-15 μL) e non lasciare che il liquido trabocchi nello spazio definito. Per rimuovere rapidamente i liquidi, utilizzare una linea di vuoto interna collegata a un pallone sottovuoto per catturare i rifiuti. Lasciare che NaBH₄ degasi per 1 ora prima dello smaltimento lasciando il tubo aperto nella cappa dei fumi chimici. Il trattamento con NaBH₄ è necessario per ridurre l'autofluorescenza di fondo, riducendo così i rilevamenti di singole molecole false positive.
   2. Trattare ogni quadrato dell'array con 10 mg/mL di NaBH₄ in 1x PBS per 4 minuti a RT. Lavare tre volte con PBS.
   3. Incubare ogni quadrato per 5 minuti con 0,2 mg/mL di NeutrAvidin in T50. Lavare tre volte con T50-BSA.
      NOTA: NeutrAvidin si lega a PEG-biotina e fornisce un sito di legame per gli anticorpi biotinilati 12,13,15.
   4. Incubare ogni quadrato per 10 minuti con 2 μg/mL di anticorpo biotinilato POI-specifico in T50-BSA; lavare tre volte con T50-BSA.
      NOTA: Il presente protocollo utilizza IgG anti-EGFR biotinilato (vedi Tabella dei materiali) per catturare EGFR-GFP.

4. SiMPull di POI da lisati a cellule intere

NOTA: posizionare la parabola TC100 degli array SiMPull funzionalizzati sul ghiaccio per il resto della preparazione SiMPull. Questo passaggio è il pull-down di un POI dal lisato proteico totale. Il lisato non deve essere riutilizzato dopo lo scongelamento.

1. Preparare le soluzioni seguenti.
   1. Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA)/0,1% di glutaraldeide (GA) in 1x PBS.
      ATTENZIONE: PFA e GA sono fissativi chimici tossici e potenziali agenti cancerogeni. Indossare DPI. Smaltire le sostanze chimiche come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
   2. Preparare 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
2. Scongelare e mescolare il lisato pipettando delicatamente su e giù. Continua sul ghiaccio.
3. Diluire 1 μL del lisato in 100 μL di T50-BSA/PPI ghiacciato.
   NOTA: se necessario, determinare il fattore di diluizione appropriato del lisato proteico totale applicando una serie di diluizioni all'array. La densità ottimale dei recettori SiMPull per area array è 0,04-0,08/μm². Le diluizioni del lisato possono essere valutate nella fase 6 (Analisi dei dati).
4. Incubare il lisato sull'array per 10 minuti; quindi lavare quattro volte con T50-BSA/PPI ghiacciato.
5. Diluire l'anticorpo anti-fosfotirosina coniugato AF647 (vedere Tabella dei materiali) in T50-BSA/PPI ghiacciato e incubare sull'array per 1 ora.
   NOTA: Nel presente protocollo, un pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG viene utilizzato per identificare la popolazione fosforilata di EGFR-GFP. L'uso di anticorpi direttamente etichettati elimina la necessità di anticorpi secondari, aumentando le opzioni di etichettatura e migliorando la coerenza dei risultati. Gli anticorpi marcati con fluorescenza possono essere ottenuti da fonti commerciali. Se non disponibili in commercio, gli anticorpi possono essere etichettati su misura utilizzando tecniche di bioconiugazione standard e sono disponibili kit di bioconiugazione commerciali. Ogni lotto di anticorpi marcati fluorescentemente deve essere testato per condizioni di etichettatura ottimali eseguendo SiMPull per misurare una curva di dose e trovare il punto di saturazione.
6. Lavare sei volte con T50-BSA ghiacciato per un totale di 6-8 min.
7. Lavare due volte con 1x PBS ghiacciato.
8. Incubare l'array con una soluzione al 4% di PFA/0,1% ga per 10 minuti per prevenire la dissociazione degli anticorpi.
9. Lavare due volte per 5 minuti ciascuno con 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS per inattivare i fissativi.
   NOTA: per gli esperimenti che utilizzano più di un anticorpo (ad esempio, rilevando più siti di fosfotirosina), ripetere i passaggi 4.5-4.9. Vedere il passo 6.2.9 per informazioni sulla determinazione dell'ostacolo sterico tra due anticorpi.

5. Acquisizione di immagini

NOTA: l'acquisizione di immagini a singola molecola viene eseguita utilizzando un obiettivo TIRF 150x e uno splitter di immagini che cattura ciascun canale spettrale in un quadrante specifico della telecamera emCCD (vedere Tabella dei materiali). Le immagini di calibrazione vengono prima acquisite per consentire la registrazione del canale e la calibrazione del guadagno della telecamera con una griglia di allineamento dei canali nanopatterned (nanogrid) che contiene 20 x 20 array di fori da 200 ± 50 nm a una distanza intraforale di 3 ± 1 μm (dimensione totale ~ 60 μm × 60 μm).

1. Eseguire la registrazione del canale seguendo i passaggi seguenti.
   NOTA: è necessaria una registrazione accurata del canale per calcolare correttamente la colocalizzazione degli emettitori. Questo passaggio è fondamentale.
   1. Pulisci l'obiettivo petrolifero e deposita una goccia di petrolio sull'obiettivo. Posiziona la nanogriglia sul palco per l'imaging. Utilizzando la luce bianca trasmessa, concentrarsi sul modello di griglia.
      NOTA: Le immagini con la nanogriglia vengono acquisite utilizzando la luce trasmessa, che passa attraverso la nanogriglia e viene rilevata in tutti i canali spettrali. In alternativa, si possono usare perline multifluorescenti che emettono fluorescenza rilevata in ciascun canale. L'acquisizione delle immagini dovrà essere ottimizzata in base a ciascuna configurazione del microscopio.
   2. Acquisisci una serie di 20 immagini della griglia. Assicurarsi che i pixel non siano saturi. Salvare la serie di immagini come "Fiducial".
   3. Sfoca la nanogriglia per creare un modello^{Airy 18}. Acquisisci una serie di 20 immagini per le calibrazioni del guadagno. Salva l'immagine come "Guadagno".
   4. Acquisire una serie di 20 immagini per l'offset della fotocamera impedendo a tutta la luce di andare alla fotocamera. Salva l'immagine come "Sfondo".
2. Acquisisci immagini SiMPull.
   NOTA: prima di creare l'imaging dell'array coverslip, sostituire la soluzione Tris con T50-BSA ed equilibrare l'array in RT.
   1. Pulire l'obiettivo petrolifero e depositare olio aggiuntivo sull'obiettivo. Fissare l'array coverslip sul palco del microscopio.
   2. Ottimizza la potenza di eccitazione di ogni fluoroforo, l'angolo TIRF e il tempo di integrazione della telecamera. L'obiettivo è quello di ottenere il più alto rapporto segnale-rumore riducendo al minimo il fotosbiancamento del campione. Registrare la potenza del laser per coerenza nelle misurazioni future.
      NOTA: il presente studio ha utilizzato un tempo di esposizione di 300 ms per il canale rosso lontano e 1 s per il canale verde. Il laser a 642 nm è stato utilizzato con una potenza laser di circa 500 μW, mentre il laser a 488 nm è stato utilizzato a 860 μW, misurato prima della lente valvolare.
   3. Acquisire immagini per ogni campione. Immagina prima il canale rosso lontano, seguito da ogni fluoroforo a lunghezza d'onda inferiore per ridurre il fotosbiancamento. A causa del basso volume utilizzato per ciascun campione, controllare il livello del buffer ogni 30-45 minuti e ricostituire secondo necessità.

6. Analisi dei dati

1. Scarica i codici demo.
   NOTA: il codice demo fornito e i set di dati di esempio illustrano l'intero flusso di lavoro di analisi dei dati (file di codifica supplementari 1-4). I requisiti di sistema elencati in SiMPullMain.m si trovano nel file di codifica supplementare 1.
   1. Decomprimi e salva in una directory personale Documents/MATLAB (MacOS/Linux) o Documents\MATLAB (Windows).
      NOTA: in questo modo vengono generate quattro nuove cartelle: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
   2. Apri il file "ReadMe_Setup.txt" che si trova nella cartella SiMPull_class.
   3. Installa MATLAB e MATLAB Toolboxes: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning toolbox.
   4. Installare DipImage¹⁹ secondo le istruzioni per il download.
   5. Installare il pacchetto di analisi a singola molecola "smite" come descritto nella ReadMe_setup.txt.
      NOTA: "smite" è disponibile nel repository GitHub (vedere Tabella dei materiali).
   6. Apri SiMPullMain.m, che si trova nella cartella SiMPull_class, trascinando il file nella finestra MATLAB.
   7. Cambia la directory in ...\MATLAB\Sample Data\ facendo clic sull'icona Cerca cartella e selezionando la cartella.
2. Panoramica delle fasi di trattamento dei dati
   1. Eseguire SiMPullMain.m - seguendo le istruzioni per ogni sezione. Eseguire ogni sezione singolarmente posizionando il cursore in tale sezione e facendo clic sull'icona Esegui sezione.
      NOTA: i passaggi generali per l'analisi dei dati sono descritti in questa sezione. Istruzioni dettagliate si trovano nel codice SiMPullMain.m allegato.
   2. Eseguire la sezione "Inizializzazione" per impostare il percorso per definire i canali spettrali e le dimensioni dell'immagine.
   3. Esegui la sezione "Trova guadagno e offset della fotocamera" per convertire il guadagno della fotocamera in fotoni utilizzando i set di dati Guadagno e Sfondo.
   4. Eseguire la sezione "Registrazione canale" per calcolare la trasformazione media ponderata locale utilizzata per la registrazione delle immagini.
   5. Formattare e curare i dati. Esegui la sezione "Unisci canali sequenziali in un'immagine quadrupla". Esegui "Rimuovi frame danneggiati".
   6. Esegui la sezione "Adatta singole molecole e trova molecole sovrapposte".
      NOTA: questa sezione esegue più funzioni per localizzare singole molecole in ciascun canale e determinare gli eventi di colocalizzazione tra canali spettrali.
   7. Per determinare il numero minimo di fotoni per il vero adattamento GFP, eseguire la sezione "Ottimizza soglia minima di fotoni". Questo è un processo iterativo.
      1. Innanzitutto, imposta smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] ed eseguire la sezione. Seleziona i file "Dati vuoti" quando richiesto. Ripetere l'operazione con i file "CHO-EGFR-GFP".
      2. Selezionare un valore di soglia minimo appropriato confrontando i due istogrammi. Imposta smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] ed eseguire nuovamente la sezione.
   8. Eseguire la sezione "Calcola percentuale di GFP si adatta positivamente al segnale FR" per correggere le localizzazioni in background e calcolare i valori finali.
   9. Eseguire l'opzione 1 (passaggio 6.2.10) o l'opzione 2 (passaggio 6.2.11) in base alle esigenze sperimentali.
   10. Opzione 1: Correggere il numero di recettori disponibili sulla membrana plasmatica per il legame del ligando, come descritto nel riferimento¹⁵.
       1. In primo luogo, etichettare i recettori di superficie con livelli saturanti di colorante fluorescente NHS Ester (NHS-AF647, vedere Tabella dei materiali). Quindi eseguire un esperimento SiMPull per determinare la percentuale di localizzazione GFP che viene colocalizzata con AF647.
          NOTA: Questo fornisce una stima della frazione di recettori disponibili per l'etichettatura NHS e il rapporto tra i recettori sulla superficie (SR).
       2. Applicare la correzione SR nel calcolo finale: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, dove NGFP è il numero corretto di localizzazioni GFP, NBG è il numero di localizzazione in background e NLOC è localizzazioni totali.
          NOTA: Nel presente esempio, questa correzione non viene applicata perché Pervanadato è permeabile alla membrana¹⁶ e, pertanto, l'azione dell'inibizione della fosfatasi non è limitata ai recettori di superficie.
   11. Opzione 2: per le misurazioni di fosforilazione multisito, considerare il potenziale di ostacolo sterico quando vengono utilizzati due anticorpi.
       NOTA: l'ostacolo sterico può causare una riduzione della percentuale osservata di recettori fosforilati per l'anticorpo 1 in presenza di anticorpo 2 (P12), rispetto all'anticorpo 1 da solo (P1).
       1. Utilizzare SiMPull per determinare P1 e P12 e calcolare il fattore di correzione per l'ostacolo sterico, seguendo il riferimento¹⁵ precedentemente pubblicato.

Risultati

Un cartone animato raffigurante il processo SiMPull è mostrato nella Figura 1A. I coverslip sono funzionalizzati utilizzando NeutrAvidin come ancoraggio per gli anticorpi anti-EGFR biotinilati per catturare EGFR-GFP dai lisati proteici totali. Dopo aver lavato via le proteine non legate, i recettori fosforilati sono etichettati con un anticorpo anti-fosfotirosina (anti-PY)¹⁵. La Figura 1B mostra un'immagine dell'array idrofobo, in cui è...

Discussione

Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per consentire misurazioni quantitative della fosforilazione del recettore a livello di singola proteina. Sono state sviluppate diverse modifiche semplici ma importanti al protocollo SiMPull che hanno migliorato l'affidabilità della misurazione per il rilevamento della fosfo-tirosina, compresa la riduzione dell'autofluorescenza con il trattamento con NaBH₄ e il postfissaggio del campione per prevenire la dissociazione degli anticorpi. L'utilizzo della maschera ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	MTC Bio	C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl			T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish	CELLTREAT	229620	Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous
50 mL conical tube			Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl			Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish	Corning	430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16020	Hazardous
Acetone (C3H6O)	Millipore Sigma	270725	Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin	Leinco Technologies, Inc	E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biotechnology	sc-7020 AF647
Bath-sonicator	Branson	1200
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23227
Biotin-PEG	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin	Gold Biotechnology	A-420-1	Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)	Millipore Sigma	C4901	Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper	Bioworld	30900017-1
Conical Filtering Flask	Fisher Scientific	S15464
Coplin Jar	WHEATON	900470
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5	Electron Microscopy Sciences	63793
DipImage			https://diplib.org/
DMEM	Caisson Labs	DML19-500
emCCD camera	Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima	Bio-Techne	S12450H	Heat Inactivated
Fusion 360 software	Autodesk
Geneticin G418 Disulfate	Caisson Labs	G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)	JT Baker	JTB-9526-01	Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)	Millipore Sigma	D9434	Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78446	Lysis Buffer Component
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)	VWR	BDH7204-1	Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)		HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)	EMD Millipore	HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)	Sigma Aldrich	I8896	Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000
Immersol 518F immersion oil	Zeiss	444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)	MPBio	2191421	Tyrode's Buffer Component
Matlab	Mathworks		Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)	IBIS Scientific	MX0486-1	Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits	Biotium	92245	Suggested conjugation kit
mPEG	Laysan Bio	mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane	UCT United Chemical	A0700	Hazardous
Nanogrid	Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein	Thermo Fisher Scientific	31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA			Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope	Olympus
Parafilm M Sealing Film	The Lab Depot	HS234526C
PBS pH 7.4	Caisson Labs	PBL06
PC-200 Analog Hot Plate	Corning	6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb	Cell Signaling Technology	2236BF
Potassium Chloride (KCl)	Millipore Sigma	529552	Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)	Millipore Sigma	1050330500	Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter	Raise 3D	PMS:2035U/RAL:3028	Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer	Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles	Corning	1395-100	CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter	Photometrics	Model QV2
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides	VWR	10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)	Semrock	LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package			https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	S6014	Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)	Millipore Sigma	452874	Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)	Millipore Sigma	S9625	Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide	VWR	BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Millipore Sigma	S6508	Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)	Millipore Sigma	258105	Hazardous
TetraSpeck Microspheres	Thermo Fisher Scientific	T7279	multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base	Millipore Sigma	T1503
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific	25300120