Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

Résumé

Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).

Résumé

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle nécessaire qui régule la fonction des protéines et dirige les résultats de la signalisation cellulaire. Les méthodes actuelles de mesure de la phosphorylation des protéines ne peuvent pas préserver l’hétérogénéité de la phosphorylation entre les protéines individuelles. Le test SiMPull (Single-Molecule Pull-Down) a été développé pour étudier la composition de complexes macromoléculaires par immunoprécipitation de protéines sur un couvercle en verre suivie d’une imagerie à molécule unique. La technique actuelle est une adaptation de SiMPull qui fournit une quantification robuste de l’état de phosphorylation des récepteurs membranaires pleine longueur au niveau de la molécule unique. L’imagerie de milliers de récepteurs individuels de cette manière permet de quantifier les modèles de phosphorylation des protéines. Le présent protocole détaille la procédure SiMPull optimisée, de la préparation de l’échantillon à l’imagerie. L’optimisation des protocoles de préparation du verre et de fixation des anticorps améliore encore la qualité des données. Le protocole actuel fournit un code pour l’analyse des données à molécule unique qui calcule la fraction des récepteurs phosphorylés dans un échantillon. Bien que ces travaux se concentrent sur la phosphorylation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), le protocole peut être généralisé à d’autres récepteurs membranaires et molécules de signalisation cytosoliques.

Introduction

La signalisation associée à la membrane est réglée par une combinaison d’activation des récepteurs membranaires induits par les ligands et de recrutement de protéines accessoires en aval qui propagent le signal. La phosphorylation des tyrosines clés dans les queues cytoplasmiques des récepteurs est essentielle pour initier la formation de complexes de signalisation, ou signalosomes ^1,2. Par conséquent, une question importante en biologie est de savoir comment les modèles de phosphorylation sont créés et maintenus pour recruter des partenaires de signalisation et dicter les résultats cellulaires. Cela comprend la compréhension de l’hétérogénéité de la phosphorylation des récepteurs, à la fois en abondance et dans les modèles spécifiques de phosphotyrosine qui peuvent fournir un moyen de manipuler les sorties de signalisation en dictant la composition du signalosome ^3,4,5,6,7. Cependant, il existe des limites dans les méthodes actuelles pour interroger la phosphorylation des protéines. L’analyse par transfert de Western est excellente pour décrire les tendances de la phosphorylation des protéines, mais elle est semi-quantitative⁸ et ne fournit pas d’informations sur l’hétérogénéité du système, car des milliers à des millions de récepteurs sont moyennés ensemble. Bien que les transferts de Western permettent de sonder un échantillon à l’aide d’anticorps spécifiques aux phosphos contre des tyrosines spécifiques, ils ne peuvent pas fournir d’informations sur les modèles de phosphorylation multisite au sein d’une même protéine. La phosphoprotéomique quantitative rend compte de l’abondance de la phosphotyrosine, mais il existe des limites à la détection de la phosphorylation multisite, car les résidus d’intérêt doivent être situés dans le même peptide (généralement 7-35 acides aminés) qui est généré par la digestion enzymatique ^9,10,11.

Pour surmonter les limites mentionnées ci-dessus, le test SiMPull (Single-Molecule Pull-Down) a été adapté pour quantifier les états de phosphorylation des récepteurs intacts au niveau de la molécule unique. SiMPull a été démontré pour la première fois comme un outil puissant pour interroger les complexes macromoléculaires par Jain et ^al.12,13. Dans SiMPull, les complexes macromoléculaires ont été immunoprécipités (IP) sur des couvercles de verre fonctionnalisés par anticorps, puis analysés par microscopie à molécule unique pour le nombre de sous-unités protéiques et la co-IP avec des composants complexes¹². Une modification de Kim et ^al.14, appelée SiMBlot, a été la première à utiliser une variante de SiMPull pour analyser la phosphorylation des protéines dénaturées. Le protocole SiMBlot repose sur la capture de protéines de surface cellulaire biotinylées à l’aide de couvercles recouverts de NeutrAvidin, qui sont ensuite sondés pour la phosphorylation avec un marquage d’anticorps^{spécifiques au phospho 14}. Malgré ces progrès, des améliorations étaient nécessaires pour rendre la quantification de la modification post-traductionnelle plus robuste et applicable à un plus large éventail de protéines.

Le présent protocole décrit une approche SiMPull optimisée qui a été utilisée pour quantifier les modèles de phosphorylation du récepteur du facteur de croissance épidermique intact (EGFR) en réponse à une gamme de conditions de ligand et de mutations oncogènes¹⁵. Bien que ces travaux se concentrent sur l’EGFR, cette approche peut être appliquée à n’importe quel récepteur membranaire et protéine cytosolique d’intérêt (POI), pour lesquels des anticorps de qualité sont disponibles. Le protocole comprend des étapes pour réduire l’autofluorescence des échantillons, une conception de réseau d’échantillons qui nécessite un volume d’échantillon minimal avec la préparation simultanée de jusqu’à 20 échantillons, et l’optimisation des conditions de marquage et de fixation des anticorps. Des algorithmes d’analyse de données ont été développés pour la détection et la quantification de protéines phosphorylées à molécule unique.

Protocole

1. Préparation du couvercle

REMARQUE: Pour cette étape, il faut porter un équipement de protection individuelle (EPI), qui comprend une double couche de gants en nitrile, des lunettes de sécurité ou un écran facial, et une blouse de laboratoire.

1. Effectuez une gravure au piranha pour éliminer les débris organiques du verre.
   ATTENTION: La solution de piranha est un agent oxydant puissant qui est corrosif et très réactif au contact de matières organiques. La réaction avec les débris organiques est exothermique et potentiellement explosive. Ainsi, la procédure doit être effectuée dans une hotte chimique avec le châssis abaissé. La verrerie Pyrex est nécessaire pour manipuler la solution de piranha.
   1. Préparez l’espace de travail à l’intérieur d’une hotte chimique. Disposer les couvercles sans chevauchement dans le fond d’un bécher en verre de 4 L, le bécher « réactionnel », et placer le bécher réactionnel sur une plaque chauffante à feu doux. Laissez la verrerie chauffer pendant 10 min. Placer un bécher en verre « déchets » de 1 L avec 500 mL de ddH₂O proximal au bécher réactionnel.
   2. Ajouter lentement 49 mL d’acide sulfurique 12 N (_H2SO4) au bécher réactionnel à l’aide d’une pipette sérologique en verre. Rincez la pipette dans le bécher avant de l’éliminer.
   3. Ajouter 21 mL de peroxyde d’hydrogène à 30 % (_{H2 O2}) goutte à goutte avec une pipette sérologique en verre au bécher réactionnel. Répartir lentement les gouttelettes H₂O₂ uniformément sur le fond de la fiole réactionnelle pour éviter la trempe localisée de la réaction de gravure du piranha. Rincez la pipette dans le bécher avant de l’éliminer.
      ATTENTION : Ajoutez toujours H₂O₂ dans le H₂SO₄, et jamais l’inverse.
   4. Piranha graver les couvercles pendant 30 min. Agiter doucement le contenu du bécher réactionnel toutes les 5 minutes.
   5. Trempez la solution de piranha en versant le contenu du bécher à déchets dans le bécher réactionnel. Transférez le liquide lentement le long de la paroi du bécher de réaction pour minimiser les éclaboussures. Retirez le bécher réactionnel de la plaque chauffante.
   6. Lorsque la réaction est trempée et refroidie, versez la solution de piranha dans le bécher à déchets pour la neutralisation sans retirer les couvercles gravés du bécher réactionnel.
   7. Neutraliser la solution de piranha avec l’ajout progressif d’une base faible. Par exemple, utilisez une masse excessive de 20 g de bicarbonate de sodium (NaHCO₃)/100 mL de solution de piranha.
      ATTENTION : Ne conservez pas les solutions de piranha dans des conteneurs à déchets scellés. La solution doit toujours être neutralisée avant d’être éliminée. La réaction de neutralisation produit des bulles vigoureuses et peut être explosive si elle n’est pas contrôlée par l’ajout progressif de la base faible.
   8. Remuer la solution neutralisée avec une tige d’agitation en verre et laisser réagir pendant 2 h. Augmentez le pH à >4 et éliminez la solution.
   9. Entre les ajouts de base faible à la solution de piranha, transférer les couvercles gravés du bécher réactionnel dans un entonnoir Buchner avec une tige d’agitation en verre et rincer pendant 5 min en ddH₂O.
      REMARQUE: Passez immédiatement à l’étape suivante ou conservez les couvercles gravés au piranha jusqu’à 2 semaines dans ddH₂O dans un bocal en verre scellé ou une boîte de Petri (envelopper avec un film d’étanchéité, voir Tableau des matériaux).
2. Bain-soniquer les couvercles dans des solvants organiques en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Placez les couvercles dans un bocal Coplin en verre (voir Tableau des matériaux) et recouvrez de méthanol (CH₃OH). Scellez le couvercle au pot avec un film d’étanchéité et soniquez le bain pendant 10 min. Versez soigneusement le méthanol du pot Coplin dans une bouteille de stockage en verre.
   2. Remplissez le pot Coplin avec de l’acétone (C₃H₆O), scellez le couvercle et faites du bain sonique pendant 10 min. Versez soigneusement l’acétone du pot Coplin dans une bouteille de stockage en verre.
      ATTENTION : Le méthanol est inflammable et extrêmement toxique. Utilisation dans une hotte chimique. L’acétone est inflammable et irritante. Par conséquent, manipulez-le et stockez-le dans du verre et utilisez-le dans une hotte à fumée chimique. Éliminer les déchets dangereux conformément aux réglementations et directives locales.
      REMARQUE: Le méthanol et l’acétone peuvent être réutilisés jusqu’à cinq fois chacun.
3. Activez la surface du couvercle pour la fonctionnalisation du silane.
   1. Bain-sonicate avec 1 M d’hydroxyde de potassium (KOH) pendant 20 min. Versez soigneusement le KOH hors du pot Coplin dans un tube conique de 50 mL pour le réutiliser.
      ATTENTION : Le KOH est corrosif et irritant. Utiliser dans une hotte à fumée chimique et ne pas stocker dans du verre. Conservez-le dans des tubes en polypropylène. Éliminer les déchets dangereux conformément aux réglementations et directives locales.
      REMARQUE: KOH peut être réutilisé jusqu’à cinq fois.
   2. Rincez deux fois avec ddH₂O. Égouttez ddH₂O des couvercles, puis chauffez chaque couvercle en agitant à travers la flamme d’un brûleur Bunsen pour éliminer toute humidité de surface. Placez les couvercles dans un pot Coplin sec.
4. Effectuer l’aminosilanisation coverslip.
   1. Préparer la solution d’aminosilane en mélangeant 69,4 mL de méthanol avec 3,6 mL d’acide acétique (CH₃COOH) dans une fiole conique. Ajouter 720 μL de N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane (aminosilane) et bien mélanger (voir tableau des matériaux).
      ATTENTION : L’acide acétique est inflammable et corrosif. Manipuler avec des pipettes en verre et stocker dans du verre. Travailler avec de l’acide acétique dans une hotte chimique. L’aminosilane est un danger d’inhalation extrêmement toxique, un sensibilisant et un irritant. Il est nocif pour la vie aquatique. Utilisation dans une hotte chimique. Éliminer les produits chimiques en tant que déchets dangereux conformément aux réglementations et directives locales.
      REMARQUE: Aminosilane est photosensible et s’hydrolyse rapidement dans l’eau. Toutes les étapes avec ce réactif doivent être effectuées dans des conditions d’éclairage minimales pour conserver l’activité. Purgez la bouteille avec de l’azote gazeux et appliquez un film d’étanchéité avant de le stocker dans un dessiccateur sombre. Remplacer tous les 6-9 mois.
   2. Ajouter immédiatement la solution d’aminosilane dans le pot Coplin. Couvrir et appliquer le film d’étanchéité en continuant à protéger de la lumière.
   3. Incuber les couvercles dans la solution d’aminosilane pendant 10 min dans l’obscurité à température ambiante (RT). Bain-soniquer pendant 1 min, puis incuber pendant encore 10 min. Versez soigneusement la solution d’aminosilane dans un récipient à déchets désigné pour CH₃OH avec trace aminosilane et CH₃COOH.
   4. Rincez les couvercles avec du méthanol et versez la solution dans un récipient à déchets destiné au méthanol.
   5. Rincez les couvercles trois fois pendant 2 minutes chacun avec ddH₂O. Égouttez les couvercles, tamponnez l’excès d’humidité et séchez complètement à l’air libre pendant 10 minutes.
5. Effectuer la préparation de la matrice/ fonctionnalisation biotine-PEG des couvercles.
   1. Préparer 1 M de NaHCO₃ (pH 8,5) sur un bouillon de travail en dissolvant 84,5 mg de NaHCO₃ en 1 mL de ddH₂O. Pour une concentration finale de 10 mM de NaHCO3, diluer 1 M de NaHCO3 en ddH₂O (1:100).
   2. Dessinez un réseau de grilles sur les couvercles aminosilanisés secs avec un stylo barrière hydrophobe (voir Tableau des matériaux) et attendez que l’encre sèche. Écrivez un identificateur sur le couvercle pour marquer l’orientation appropriée. Placez les couvercles dans une chambre humidifiée.
      REMARQUE: Le réseau doit être composé de 16 à 20 carrés, d’une taille d’environ 4 mm x 4 mm.
   3. Pour fabriquer la solution de valérate de succinimidyle biotine-PEG (biotine-PEG)/mPEG valérate de succinimidyle (mPEG), il faut d’abord retirer le mPEG et le biotin-PEG (voir Tableau des matériaux) du congélateur et équilibrer à RT. Ajouter 153 mg de mPEG et 3,9 mg de biotine-PEG (~1:39 biotine-PEG:mPEG) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, et remettre en suspension dans 609 μL de 10 mM NaHCO3 par pipetage doux. Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min à RT pour éliminer les bulles.
      REMARQUE: La demi-vie d’hydrolyse du valérate de succinimidyle dans un tampon de pH 8,5 est d’environ 30 min. Après avoir ajouté la mémoire tampon à mPEG, procédez comme suit le plus rapidement possible. Cette étape est essentielle.
   4. Appliquez la solution de biotine-PEG/mPEG pour couvrir complètement chaque carré dans les réseaux de couvercles, généralement 10-15 μL par carré. Ne laissez pas le liquide déborder de l’espace défini. Conservez les couvercles dans une chambre d’humidité dans l’obscurité pendant 3-4 h à RT.
   5. Lavez les couvercles avec de grandes quantités d’eau en les trempant séquentiellement dans 3 béchers en verre de 250 mL remplis de ddH₂O pendant 10 s chacun.
   6. Éliminez toute l’humidité des couvercles avec de l’azote gazeux. Conservez les couvercles dos à dos dans un tube conique rempli d’azote de 50 mL enveloppé d’un film d’étanchéité à -20 °C.
      REMARQUE: Passez immédiatement à l’étape 2 ou conservez les couvercles à -20 ° C pendant 1 semaine avant utilisation.

2. Préparation du lysat de SiMPull

ATTENTION : Les EPI requis pour les autres étapes du protocole sont des gants en nitrile, des lunettes de sécurité et des blouses de laboratoire.

REMARQUE: Les lysats ont été préparés à partir des cellules CHO adhérentes exprimant l’EGFR-GFP. Les cellules ont été plaquées dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm (TC60) pendant la nuit^12,13. Les cellules CHO ont été cultivées dans du DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 500 ng/mL de généticine (voir tableau des matériaux). D’autres lignées cellulaires adhérentes ou cellules de suspension peuvent également être utilisées.

1. Plaquez les cellules en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Laver la boîte de culture (contenant les cellules) avec 1 mL de 1x PBS. Ajouter 1 mL de 1x trypsine et incuber pendant 5 min à 37 °C pour détacher les cellules. À l’aide d’une pipette, transférer les cellules détachées de la boîte dans un tube centrifuge de 1,5 mL.
   2. Prendre 10 μL de bleu de trypan et mélanger avec 10 μL de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse séparé. Compter les cellules en utilisant 10 μL du mélange cellulaire dans un compteur de cellules automatique, conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).
   3. Plaque 8 x 10⁵ cellules pendant la nuit dans une boîte de Pétri TC60. Assiette un plat par condition.
      NOTE: Pour la présente étude, les cellules n’ont pas été traitées ou traitées avec du pervanadate et de l’EGF comme décrit à l’étape 2.4.1.
2. Préparez les solutions suivantes pour la préparation du lysat cellulaire.
   1. Préparez 1x PBS glacé (pH 7,4).
   2. Préparer un tampon de lyse, une solution de détergent non ionique et non dégénérant à 1 % (voir tableau des matériaux) dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,2) et 150 mM de NaCl complété par un inhibiteur de la protéase/phosphatase (IPP) (1:100 à partir du stock). Placer le tube sur un nutateur et laisser le tampon mélanger pendant 15 min. Gardez la solution préparée sur la glace.
   3. Préparer le tampon du Tyrode pour une concentration finale de 135 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 0,4 mM de_MgCl2, 1 mM de CaCl₂, 10 mM de HEPES (pH 7,2), 20 mM de glucose et 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) (voir tableau des matériaux). Réchauffer la solution à 37 °C.
3. Préparer le témoin positif pour le traitement par phosphorylation - 1 mM de pervanadate.
   REMARQUE : cette étape est facultative. Le pervandate est la forme peroxydée du vanadate, un inhibiteur de la protéine tyrosine phosphatases¹⁶. La prévention de la déphosphorylation des protéines en inhibant l’activité de la phosphatase donne un échantillon hautement phosphorylé.
   1. Préparer un stock de 200 mM d’orthovanadate de sodium activé (Na₃VO₄).
      1. Pour préparer une solution de 100 mL, ajouter 3,89 g de Na₃VO₄ (voir tableau des matériaux) à 90 mL de ddH₂O et dissoudre en remuant. Ajustez le pH à 10 en ajoutant HCl ou NaOH goutte à goutte. L’ajout de HCl rendra la solution jaune.
      2. Porter le volume à 100 mL avec ddH₂O. Faire bouillir la solution en la chauffant au micro-ondes. Après ébullition, la solution sera incolore.
      3. Refroidir la solution à RT et réajuster le pH à 10. Répétez l’ébullition, le refroidissement et l’ajustement du pH deux à quatre fois de plus, jusqu’à ce que le pH se stabilise à 10. Aliquote et conserver à -20 °C.
   2. Préparer un stock de 30 mM de pervanadate (PV) en mélangeant 20,4 μL de 3 %_H2O2 avec 100 μL de 200 mM Na₃VO₄ et 546,8 μL de ddH₂O (concentrations équimolaires de_H2O2 et de Na₃VO₄ activé). Incuber dans le noir à RT pendant 15 min.
   3. Préparez 1 mM de PV dans le tampon de Tyrode. Pour une solution de 10 mL, ajouter 0,33 mL de stock PV de 30 mM à 9,67 mL de tampon de Tyrode à 37 °C. Traiter les cellules immédiatement.
   4. Lavez les cellules une fois avec 3 mL de tampon de Tyrode. Ajouter 3 mL de PV de 1 mM dans le tampon du Tyrode aux cellules et incuber pendant 15 min à 37 °C.
4. Effectuez la stimulation du ligand.
   1. Stimuler les cellules avec le ligand d’intérêt en utilisant la concentration, le temps et la température appropriés. Pour une stimulation maximale de l’EGFR, incuber avec 1 mL de facteur de croissance épidermique (EGF, voir tableau des matériaux) + 1 mM de PV dans le tampon de Tyrode pendant 5 min à 37 °C.
5. Effectuer une lyse cellulaire.
   1. Après le traitement cellulaire souhaité, placez le plat sur de la glace et lavez-le avec du PBS glacé 1x. Retirez complètement le volume total de PBS à l’aide d’une pipette.
   2. Ajouter 180 μL de tampon de lyse (étape 2.2.2) à la plaque. Utilisez un grattoir à cellules pour tirer le tampon autour de la plaque afin de couvrir complètement les cellules. Appliquez une pression ferme et constante avec le grattoir à cellules sur toute la surface cultivée pour lyser complètement les cellules.
      REMARQUE: Le volume du tampon de lyse doit être maintenu au minimum pour assurer une concentration élevée en protéines.
   3. Pipeter les cellules lysées et les transférer dans un tube de 1,5 mL. Gardez le tube sur la glace pendant 30 min. Vortex les lysats toutes les 5 min.
      REMARQUE: Si le POI se compose de plusieurs sous-unités ou est sensible à la dissociation, ne pas vortexer les lysats.
   4. Centrifuger les cellules lysées à 16 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette. Celui-ci contient le lysat protéique total.
   5. Réservez 10 μL du lysat et diluez-le dans 90 μL du tampon de lyse pour l’analyse colorimétrique bicinchoninique (BCA)¹⁷. Conserver le lysat protéique total restant à -80 °C.
   6. Déterminer la concentration de protéines totales de lysat à l’aide de l’analyse BCA (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE: Les lysats protéiques totaux peuvent être préparés le jour de l’expérience et utilisés frais ou stockés comme aliquotes à usage unique à -80 ° C pendant 12 semaines. Ne pas congeler/décongeler.

3. Fonctionnalisation du réseau avec l’anticorps biotinylé

1. Préparez les solutions suivantes.
   1. T50 Buffer, une solution de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) et de 50 mM de NaCl. La solution est stable pendant 1 mois à RT.
   2. T50-BSA en complétant le tampon T50 avec 0,1 mg/mL de BSA. Gardez la solution préparée sur la glace.
   3. 10 mg/mL de borohydrure de sodium (NaBH₄) dans 1x PBS. Préparez-le immédiatement avant utilisation.
   4. 0,2 mg/mL de NeutrAvidin (voir tableau des matériaux) dans le tampon T50.
      ATTENTION : NaBH₄ est un agent réducteur et est inflammable. Purgez toujours le récipient avec de l’azote gazeux après utilisation et stockez-le dans un dessiccateur.
2. Fonctionnaliser le réseau avec l’anticorps biotinylé.
   1. Retirez les matrices fonctionnalisées PEG-biotine du congélateur et équilibrez le tube conique en RT avant de l’ouvrir. Placez le couvercle avec le réseau orienté vers le haut sur un film d’étanchéité doublé de 100 mm de boîte de culture tissulaire (TC100).
      REMARQUE: Minimisez l’éclairage aérien. Toutes les solutions doivent « perler » sur les carrés définis par le réseau hydrophobe. Ajouter un volume approprié de solution pour couvrir complètement chaque carré (généralement 10-15 μL) et ne pas laisser le liquide déborder de l’espace défini. Pour éliminer rapidement les liquides, utilisez une conduite de vide interne fixée à une fiole à vide pour capturer les déchets. Laisser le NaBH₄ dégazer pendant 1 h avant l’élimination en laissant le tube ouvert dans la hotte de fumée chimique. Le traitement NaBH₄ est nécessaire pour réduire l’autofluorescence de fond, réduisant ainsi les détections de molécules uniques faussement positives.
   2. Traiter chaque carré de la matrice avec 10 mg/mL de NaBH₄ dans 1x PBS pendant 4 min à TA. Laver trois fois avec PBS.
   3. Incuber chaque carré pendant 5 min avec 0,2 mg/mL de NeutrAvidin dans la T50. Laver trois fois avec T50-BSA.
      REMARQUE: NeutrAvidin se lie à la BIOTINE PEG et fournit un site de liaison pour les anticorps biotinylés 12,13,15.
   4. Incuber chaque carré pendant 10 min avec 2 μg/mL d’anticorps biotinylés spécifiques au POI dans le T50-BSA; laver trois fois avec du T50-BSA.
      REMARQUE : Le présent protocole utilise des IgG anti-EGFR biotinylées (voir tableau des matériaux) pour capturer l’EGFR-GFP.

4. SiMPull de POI à partir de lysats de cellules entières

REMARQUE: Placez la parabole TC100 des matrices SiMPull fonctionnalisées sur de la glace pour le reste de la préparation SiMPull. Cette étape est l’extraction d’un POI à partir du lysat protéique total. Le lysat ne doit pas être réutilisé après décongélation.

1. Préparez les solutions suivantes.
   1. Préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA)/0,1 % de glutaraldéhyde (GA) dans 1x PBS.
      ATTENTION : Les PFA et les AG sont des fixateurs chimiques toxiques et des cancérogènes potentiels. Portez de l’EPI. Éliminer les produits chimiques en tant que déchets dangereux conformément aux réglementations et directives locales.
   2. Préparer 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4.
2. Décongeler et mélanger le lysat en pipetant doucement de haut en bas. Restez sur la glace.
3. Diluer 1 μL du lysat dans 100 μL de T50-BSA/IPP glacé.
   REMARQUE: Si nécessaire, déterminez le facteur de dilution approprié du lysat protéique total en appliquant une gamme de dilutions à la matrice. La densité optimale des récepteurs SiMPull par zone de réseau est de 0,04-0,08/μm². Les dilutions de lysat peuvent être évaluées à l’étape 6 (Analyse des données).
4. Incuber le lysat sur le tableau pendant 10 min; puis laver quatre fois avec du T50-BSA/IPP glacé.
5. Diluer l’anticorps anti-phosphotyrosine conjugué AF647 (voir tableau des matériaux) dans du T50-BSA/IPP glacé et incuber sur la matrice pendant 1 h.
   NOTE: Dans le présent protocole, un pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG est utilisé pour identifier la population phosphorylée d’EGFR-GFP. L’utilisation d’anticorps directement marqués élimine le besoin d’anticorps secondaires, augmentant les options de marquage et améliorant la cohérence des résultats. Les anticorps marqués par fluorescence peuvent être obtenus à partir de sources commerciales. S’ils ne sont pas disponibles dans le commerce, les anticorps peuvent être étiquetés sur mesure à l’aide de techniques de bioconjugation standard, et des kits de bioconjugation commerciaux sont disponibles. Chaque lot d’anticorps marqués par fluorescence doit être testé pour des conditions de marquage optimales en effectuant SiMPull pour mesurer une courbe de dose et trouver le point de saturation.
6. Laver six fois avec du T50-BSA glacé pendant un total de 6 à 8 min.
7. Laver deux fois avec du PBS glacé 1x.
8. Incuber le réseau avec une solution à 4 % de PFA/0,1 % d’AG pendant 10 min pour éviter la dissociation des anticorps.
9. Laver deux fois pendant 5 min chacun avec 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4/PBS pour inactiver les fixateurs.
   REMARQUE : Pour les expériences utilisant plus d’un anticorps (p. ex., détection de plusieurs sites de phosphotyrosine), répétez les étapes 4.5 à 4.9. Voir l’étape 6.2.9 pour obtenir des renseignements sur la détermination de l’obstacle stérique entre deux anticorps.

5. Acquisition d’images

REMARQUE: L’acquisition d’images à molécule unique est effectuée à l’aide d’un objectif TIRF 150x et d’un séparateur d’images qui capture chaque canal spectral dans un quadrant spécifique de la caméra EMCCD (voir Tableau des matériaux). Les images d’étalonnage sont d’abord acquises pour permettre l’enregistrement des canaux et l’étalonnage du gain de la caméra avec une grille d’alignement des canaux nanomotifs (nanogrilles) qui contient 20 x 20 réseaux de trous de 200 ± 50 nm à une distance intra-trou de 3 ± 1 μm (taille totale ~ 60 μm × 60 μm).

1. Effectuez l’enregistrement du canal en suivant les étapes ci-dessous.
   REMARQUE: Un enregistrement précis des canaux est nécessaire pour calculer correctement la colocalisation des émetteurs. Cette étape est essentielle.
   1. Nettoyez l’objectif d’huile et déposez une goutte d’huile sur l’objectif. Placez le nanogrille sur la scène pour l’imagerie. À l’aide de la lumière blanche transmise, concentrez-vous sur le motif de la grille.
      REMARQUE: Les images avec le nanoréseau sont acquises à l’aide de la lumière transmise, qui traverse le nanoréseau et est détectée dans tous les canaux spectraux. Alternativement, on peut utiliser des perles multifluorescentes qui émettent de la fluorescence détectée dans chaque canal. L’acquisition d’images devra être optimisée en fonction de chaque configuration de microscope.
   2. Acquérir une série de 20 images de la grille. Assurez-vous que les pixels ne sont pas saturés. Enregistrez la série d’images sous le nom « Fiducial ».
   3. Décentrez le nanogrille pour créer un motif Airy¹⁸. Acquérez une série de 20 images pour des étalonnages de gain. Enregistrez l’image sous le nom « Gain ».
   4. Acquérir une série de 20 images pour le décalage de la caméra en empêchant toute la lumière d’aller à la caméra. Enregistrez l’image en tant que « Arrière-plan ».
2. Acquérir des images SiMPull.
   REMARQUE : Avant d’imager la matrice de couvercles, échangez la solution Tris contre T50-BSA et équilibrez la matrice sur RT.
   1. Nettoyez l’objectif d’huile et déposez de l’huile supplémentaire sur l’objectif. Fixez le réseau de couvercles sur l’étage du microscope.
   2. Optimisez la puissance d’excitation de chaque fluorophore, l’angle TIRF et le temps d’intégration de la caméra. L’objectif est d’obtenir le rapport signal-bruit le plus élevé tout en minimisant le photoblanchiment de l’échantillon. Enregistrez la puissance du laser pour plus de cohérence dans les mesures futures.
      REMARQUE: La présente étude a utilisé un temps d’exposition de 300 ms pour le canal rouge lointain et de 1 s pour le canal vert. Le laser de 642 nm a été utilisé à une puissance laser d’environ 500 μW, tandis que le laser de 488 nm a été utilisé à 860 μW, mesuré avant la lentille du tube.
   3. Acquérir des images pour chaque échantillon. Imagez d’abord le canal rouge lointain, suivi de chaque fluorophore de longueur d’onde inférieure pour réduire le photoblanchiment. En raison du faible volume utilisé pour chaque échantillon, vérifiez le niveau de tampon toutes les 30 à 45 minutes et réapprovisionnez-le au besoin.

6. Analyse des données

1. Téléchargez les codes de démonstration.
   REMARQUE : Le code de démonstration fourni et les exemples d’ensembles de données illustrent le flux de travail complet de l’analyse des données (fichiers de codage supplémentaires 1 à 4). La configuration système requise répertoriée dans SiMPullMain.m se trouve dans le fichier de codage supplémentaire 1.
   1. Décompressez et enregistrez dans un répertoire personnel Documents/MATLAB (MacOS/Linux) ou Documents\MATLAB (Windows).
      REMARQUE: Cela génère quatre nouveaux dossiers: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
   2. Ouvrez le fichier « ReadMe_Setup.txt » qui se trouve dans le dossier SiMPull_class.
   3. Installez MATLAB et MATLAB Toolboxes : Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox et Statistics and Machine Learning toolbox.
   4. Installez DipImage¹⁹ conformément aux instructions de téléchargement.
   5. Installez le package d’analyse monomoléculaire « smite » comme décrit dans ReadMe_setup.txt.
      REMARQUE: « smite » est disponible sur le référentiel GitHub (voir Table des matériaux).
   6. Ouvrez SiMPullMain.m, qui se trouve dans SiMPull_class dossier, en faisant glisser le fichier dans la fenêtre MATLAB.
   7. Remplacez le répertoire par ...\MATLAB\Sample Data\ en cliquant sur l’icône Rechercher un dossier et en sélectionnant le dossier.
2. Vue d’ensemble des étapes de traitement des données
   1. Exécutez SiMPullMain.m - suivez les instructions pour chaque section. Exécutez chaque section individuellement en plaçant le curseur dans cette section et en cliquant sur l’icône Exécuter la section.
      REMARQUE : Les étapes générales de l’analyse des données sont décrites dans cette section. Vous trouverez des instructions détaillées dans le code SiMPullMain.m qui l’accompagne.
   2. Exécutez la section « Initialisation » pour définir le chemin à suivre pour définir les canaux spectraux et la taille de l’image.
   3. Exécutez la section « Rechercher le gain et le décalage de la caméra » pour convertir la gain de la caméra en photons à l’aide des jeux de données Gain et Arrière-plan.
   4. Exécutez la section « Enregistrement du canal » pour calculer la transformation moyenne pondérée locale utilisée pour l’enregistrement de l’image.
   5. Formatez et organisez les données. Exécutez la section « Joindre des canaux séquentiels dans une image quadruple ». Exécutez « Supprimer les images incorrectes ».
   6. Exécutez la section « Ajuster les molécules uniques et trouver les molécules qui se chevauchent ».
      REMARQUE: Cette section exécute plusieurs fonctions pour localiser des molécules uniques dans chaque canal et déterminer les événements de colocalisation entre les canaux spectraux.
   7. Pour déterminer le nombre minimal de photons par ajustement GFP réel, exécutez le « Optimiser le seuil minimal de photons ». Il s’agit d’un processus itératif.
      1. Tout d’abord, définissez smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] et exécutez la section. Sélectionnez les fichiers « Données vides » lorsque vous y êtes invité. Répétez l’opération avec les fichiers « CHO-EGFR-GFP ».
      2. Sélectionnez une valeur seuil minimale appropriée en comparant les deux histogrammes. Définissez smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] et exécutez à nouveau la section.
   8. Exécutez la section « Calculer le pourcentage de GFP correspond positivement au signal FR » pour corriger les localisations en arrière-plan et calculer les valeurs finales.
   9. Exécutez l’option 1 (étape 6.2.10) ou l’option 2 (étape 6.2.11) selon les besoins expérimentaux.
   10. Option 1 : Corriger le nombre de récepteurs disponibles au niveau de la membrane plasmique pour la liaison aux ligands, comme décrit dans la référence¹⁵.
       1. Tout d’abord, étiqueter les récepteurs de surface avec des niveaux saturants de colorant fluorescent NHS Ester (NHS-AF647, voir Table des matériaux). Effectuez ensuite une expérience SiMPull pour déterminer le pourcentage de localisation GFP qui colocalise avec AF647.
          REMARQUE: Cela fournit une estimation de la fraction de récepteurs disponibles pour le marquage NHS et du rapport des récepteurs à la surface (SR).
       2. Appliquez la correction SR dans le calcul final : NGFP = (NLOC - NBG)*SR, où NGFP est le nombre corrigé de localisations GFP, NBG est le numéro de localisation d’arrière-plan et NLOC est le nombre total de localisations.
          NOTE: Dans le présent exemple, cette correction n’est pas appliquée car le pervanadate est perméable à la membrane¹⁶ et, par conséquent, l’action de l’inhibition de la phosphatase ne se limite pas aux récepteurs de surface.
   11. Option 2 : Pour les mesures de phosphorylation multisite, tenez compte du potentiel d’entrave stérique lorsque deux anticorps sont utilisés.
       REMARQUE: L’obstacle stérique peut entraîner une réduction du pourcentage observé de récepteurs phosphorylés pour l’anticorps 1 en présence de l’anticorps 2 (P12), par rapport à l’anticorps 1 seul (P1).
       1. Utilisez SiMPull pour déterminer P1 et P12 et calculer le facteur de correction de l’obstacle stérique, conformément à la référence¹⁵ publiée précédemment.

Résultats

Un dessin animé illustrant le processus SiMPull est illustré à la figure 1A. Les couvercles sont fonctionnalisés à l’aide de NeutrAvidin comme point d’ancrage pour les anticorps anti-EGFR biotinylés afin de capturer l’EGFR-GFP à partir de lysats de protéines totales. Après avoir éliminé les protéines non liées, les récepteurs phosphorylés sont marqués avec un anticorps anti-phosphotyrosine (anti-PY)¹⁵. La figure 1B m...

Discussion

Le protocole décrit ici a été optimisé pour permettre des mesures quantitatives de la phosphorylation des récepteurs au niveau d’une seule protéine. Plusieurs modifications simples mais importantes du protocole SiMPull ont été développées pour améliorer la fiabilité de la mesure pour la détection de la phospho-tyrosine, y compris la réduction de l’autofluorescence avec le traitement NaBH₄ et la postfixation de l’échantillon pour prévenir la dissociation des anticorps. L’utilisation du m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	MTC Bio	C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl			T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish	CELLTREAT	229620	Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous
50 mL conical tube			Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl			Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish	Corning	430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16020	Hazardous
Acetone (C3H6O)	Millipore Sigma	270725	Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin	Leinco Technologies, Inc	E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biotechnology	sc-7020 AF647
Bath-sonicator	Branson	1200
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23227
Biotin-PEG	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin	Gold Biotechnology	A-420-1	Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)	Millipore Sigma	C4901	Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper	Bioworld	30900017-1
Conical Filtering Flask	Fisher Scientific	S15464
Coplin Jar	WHEATON	900470
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5	Electron Microscopy Sciences	63793
DipImage			https://diplib.org/
DMEM	Caisson Labs	DML19-500
emCCD camera	Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima	Bio-Techne	S12450H	Heat Inactivated
Fusion 360 software	Autodesk
Geneticin G418 Disulfate	Caisson Labs	G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)	JT Baker	JTB-9526-01	Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)	Millipore Sigma	D9434	Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78446	Lysis Buffer Component
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)	VWR	BDH7204-1	Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)		HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)	EMD Millipore	HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)	Sigma Aldrich	I8896	Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000
Immersol 518F immersion oil	Zeiss	444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)	MPBio	2191421	Tyrode's Buffer Component
Matlab	Mathworks		Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)	IBIS Scientific	MX0486-1	Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits	Biotium	92245	Suggested conjugation kit
mPEG	Laysan Bio	mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane	UCT United Chemical	A0700	Hazardous
Nanogrid	Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein	Thermo Fisher Scientific	31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA			Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope	Olympus
Parafilm M Sealing Film	The Lab Depot	HS234526C
PBS pH 7.4	Caisson Labs	PBL06
PC-200 Analog Hot Plate	Corning	6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb	Cell Signaling Technology	2236BF
Potassium Chloride (KCl)	Millipore Sigma	529552	Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)	Millipore Sigma	1050330500	Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter	Raise 3D	PMS:2035U/RAL:3028	Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer	Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles	Corning	1395-100	CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter	Photometrics	Model QV2
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides	VWR	10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)	Semrock	LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package			https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	S6014	Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)	Millipore Sigma	452874	Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)	Millipore Sigma	S9625	Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide	VWR	BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Millipore Sigma	S6508	Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)	Millipore Sigma	258105	Hazardous
TetraSpeck Microspheres	Thermo Fisher Scientific	T7279	multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base	Millipore Sigma	T1503
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific	25300120