Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).

Zusammenfassung

Die Phosphorylierung ist eine notwendige posttranslationale Modifikation, die die Proteinfunktion reguliert und die Ergebnisse der Zellsignalisierung steuert. Aktuelle Methoden zur Messung der Proteinphosphorylierung können die Heterogenität der Phosphorylierung über einzelne Proteine hinweg nicht erhalten. Der Einzelmolekül-Pulldown-Assay (SiMPull) wurde entwickelt, um die Zusammensetzung makromolekularer Komplexe durch Immunpräzipitation von Proteinen auf einem Glasdeckglas zu untersuchen, gefolgt von Einzelmolekül-Bildgebung. Die aktuelle Technik ist eine Adaption von SiMPull, die eine robuste Quantifizierung des Phosphorylierungszustands von Membranrezeptoren in voller Länge auf Einzelmolekülebene ermöglicht. Die Abbildung von Tausenden von einzelnen Rezeptoren auf diese Weise ermöglicht die Quantifizierung von Proteinphosphorylierungsmustern. Das vorliegende Protokoll beschreibt das optimierte SiMPull-Verfahren von der Probenvorbereitung bis zur Bildgebung. Die Optimierung von Glaspräparations- und Antikörperfixierungsprotokollen verbessert die Datenqualität weiter. Das aktuelle Protokoll liefert Code für die Einzelmolekül-Datenanalyse, die den Anteil der in einer Probe phosphorylierten Rezeptoren berechnet. Während sich diese Arbeit auf die Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) konzentriert, kann das Protokoll auf andere Membranrezeptoren und zytosolische Signalmoleküle verallgemeinert werden.

Einleitung

Die membranassoziierte Signalgebung wird durch eine Kombination aus Ligand-induzierter Membranrezeptoraktivierung und Rekrutierung von nachgeschalteten akzessorischen Proteinen, die das Signal verbreiten, abgestimmt. Die Phosphorylierung von Schlüsseltyrosinen in rezeptorzytoplasmatischen Schwänzen ist entscheidend für die Einleitung der Bildung von Signalkomplexen oder Signalosomen ^1,2. Daher ist eine wichtige Frage in der Biologie, wie Phosphorylierungsmuster erzeugt und aufrechterhalten werden, um Signalpartner zu rekrutieren und zelluläre Ergebnisse zu diktieren. Dazu gehört das Verständnis der Heterogenität der Rezeptorphosphorylierung, sowohl im Überfluss als auch in den spezifischen Phosphotyrosinmustern, die ein Mittel zur Manipulation der Signalausgänge bieten können, indem sie die Zusammensetzung des Signalosoms 3,4,5,6,7 diktieren. Es gibt jedoch Einschränkungen in den derzeitigen Methoden zur Abfrage der Proteinphosphorylierung. Die Western-Blot-Analyse eignet sich hervorragend zur Beschreibung von Trends der Proteinphosphorylierung, ist jedoch semi-quantitativ⁸ und liefert keine Informationen über die Heterogenität des Systems, da Tausende bis Millionen von Rezeptoren zusammen gemittelt werden. Während westliche Blots die Untersuchung einer Probe mit Phospho-spezifischen Antikörpern gegen bestimmte Tyrosine ermöglichen, können sie keine Informationen über Multisite-Phosphorylierungsmuster innerhalb desselben Proteins liefern. Quantitative Phosphoproteomiken berichten über die Phosphotyrosin-Häufigkeit, aber es gibt Einschränkungen beim Nachweis der Multisite-Phosphorylierung, da sich die interessierenden Reste innerhalb desselben Peptids (typischerweise ^7-35 Aminosäuren) befinden müssen, das durch enzymatische Verdauung erzeugt wird ^9,10,11.

Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, wurde der Einzelmolekül-Pull-Down-Assay (SiMPull) angepasst, um die Phosphorylierungszustände intakter Rezeptoren auf Einzelmolekülebene zu quantifizieren. SiMPull wurde erstmals von Jain et ^al.12,13 als leistungsfähiges Werkzeug zur Befragung makromolekularer Komplexe demonstriert. In SiMPull wurden makromolekulare Komplexe immunpräzipitiert (IP) auf Antikörper-funktionalisierten Glasdeckgläsern und dann durch Einzelmolekülmikroskopie auf Proteinuntereinheitennummer und Co-IP mit komplexen Komponenten^{analysiert 12}. Eine Modifikation von Kim et ^al.14, genannt SiMBlot, war die erste, die eine Variation von SiMPull verwendete, um die Phosphorylierung von denaturierten Proteinen zu analysieren. Das SiMBlot-Protokoll beruht auf der Erfassung biotinylierter Zelloberflächenproteine unter Verwendung von NeutrAvidin-beschichteten Deckgläsern, die dann zur Phosphorylierung mit Phospho-spezifischer Antikörpermarkierung^{untersucht werden 14}. Trotz dieser Fortschritte waren Verbesserungen erforderlich, um die Quantifizierung der posttranslationalen Modifikation robuster und auf ein breiteres Spektrum von Proteinen anwendbarer zu machen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen optimierten SiMPull-Ansatz, der verwendet wurde, um Phosphorylierungsmuster des intakten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) als Reaktion auf eine Reihe von Ligandenbedingungen und onkogenen Mutationen zu quantifizieren¹⁵. Während sich diese Arbeit auf EGFR konzentriert, kann dieser Ansatz auf jeden Membranrezeptor und zytosolische Proteine von Interesse (POI) angewendet werden, für die hochwertige Antikörper verfügbar sind. Das Protokoll umfasst Schritte zur Reduzierung der Probenautofluoreszenz, ein Probenarray-Design, das ein minimales Probenvolumen bei gleichzeitiger Vorbereitung von bis zu 20 Proben erfordert, und die Optimierung der Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen. Datenanalysealgorithmen wurden für den Einzelmolekülnachweis und die Quantifizierung phosphorylierter Proteine entwickelt.

Protokoll

1. Deckglas-Vorbereitung

HINWEIS: Für diesen Schritt muss man persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, die eine doppelte Schicht Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz und einen Laborkittel umfasst.

1. Führen Sie Piranha-Ätzen durch, um organische Ablagerungen aus dem Glas zu entfernen.
   ACHTUNG: Piranha-Lösung ist ein starkes Oxidationsmittel, das bei Kontakt mit organischen Materialien korrosiv und hochreaktiv ist. Die Reaktion mit organischen Ablagerungen ist exotherm und potenziell explosiv. Daher muss das Verfahren in einem chemischen Abzug mit abgesenktem Flügel durchgeführt werden. Für die Handhabung der Piranha-Lösung sind Pyrex-Glaswaren erforderlich.
   1. Bereiten Sie den Arbeitsbereich in einem chemischen Abzug vor. Ordnen Sie Deckgläser ohne Überlappung im Boden eines 4-Liter-Glasbechers, des "Reaktionsbechers", an und legen Sie das Reaktionsbecherglas mit sanfter Hitze auf eine Kochplatte. Lassen Sie die Glaswaren für 10 Minuten erwärmen. Legen Sie ein "Abfall" 1 L Glasbecherglas mit 500 ml ddH₂O proximal auf das Reaktionsbecherglas.
   2. 49 ml 12 N Schwefelsäure (_H2SO4) langsam mit einerserologischen Glaspipette in das Reaktionsbecherglas geben. Spülen Sie die Pipette vor der Entsorgung im Abfallbecherglas ab.
   3. 21 ml 30% Wasserstoffperoxid (_H2O2)tropfenweise mit einer serologischen Glaspipette in das Reaktionsbecherglas geben. Verteilen Sie die_{H2O2-Tröpfchen}langsam gleichmäßig über den Boden des_{Reaktionskolbens}, um ein lokales Abschrecken der Piranha-Ätzreaktion zu verhindern. Spülen Sie die Pipette vor der Entsorgung im Abfallbecherglas ab.
      ACHTUNG_: Fügen Sie H 2 O_{2 immer} in das H₂SO 4 hinzu undniemals umgekehrt.
   4. Piranha ätzt die Deckblätter für 30 min. Den Inhalt des Reaktionsbechers alle 5 Minuten vorsichtig rühren.
   5. Quen Sie die Piranha-Lösung ab, indem Sie den Inhalt des Abfallbechers in das Reaktionsbecherglas gießen. Übertragen Sie die Flüssigkeit langsam die Wand des Reaktionsbechers hinunter, um das Spritzen zu minimieren. Entfernen Sie das Reaktionsbecherglas von der Kochplatte.
   6. Wenn die Reaktion abgeschreckt und abgekühlt ist, gießen Sie die Piranha-Lösung zur Neutralisierung zurück in das Abfallbecherglas, ohne die geätzten Deckgläser vom Reaktionsbecherglas zu entfernen.
   7. Neutralisieren Sie die Piranha-Lösung mit der allmählichen Zugabe einer schwachen Basis. Verwenden Sie beispielsweise eine übermäßige Masse von 20 g Natriumbicarbonat (_{NaHCO 3}) / 100 ml Piranha-Lösung.
      ACHTUNG: Lagern Sie Piranha-Lösungen nicht in versiegelten Abfallbehältern. Die Lösung muss vor der Entsorgung immer neutralisiert werden. Die Neutralisationsreaktion erzeugt kräftige Blasen und kann explosiv sein, wenn sie nicht durch die allmähliche Zugabe der schwachen Basis kontrolliert wird.
   8. Rühren Sie die neutralisierte Lösung mit einem Glasrührstab um und lassen Sie sie 2 h reagieren. Erhöhen Sie den pH-Wert auf >4 und entsorgen Sie die Lösung.
   9. Zwischen den Zugabe von schwacher Basis zur Piranha-Lösung die geätzten Deckgläser aus dem Reaktionsbecher in einen Buchner-Trichter mit einem Glasrührstab geben und 5 min bei Ausführung von ddH₂O abspülen.
      HINWEIS: Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort oder bewahren Sie die geätzten Piranha-Deckgläser bis zu 2 Wochen in ddH₂O in einem versiegelten Glasgefäß oder einer Petrischale auf (mit Siegelfolie umwickeln, siehe Materialtabelle).
2. Beschallen Sie die Deckgläser in organischen Lösungsmitteln mit den folgenden Schritten.
   1. Legen Sie die Deckgläser in ein Coplin-Glas aus Glas (siehe Materialtabelle) und bedecken Sie sie mit Methanol (_CH3OH). Verschließen Sie den Deckel mit Dichtungsfolie und Badebeschallung für 10 min. Gießen Sie das Methanol vorsichtig aus dem Coplin-Glas in eine Glasvorratsflasche.
   2. Füllen Sie das Coplin-Glas mit Aceton (C₃H₆O), verschließen Sie den Deckel und baden, um 10 Minuten zu beschallen. Gießen Sie das Aceton vorsichtig aus dem Coplin-Glas in eine Glasvorratsflasche.
      ACHTUNG: Methanol ist brennbar und akut giftig. Verwendung in einem chemischen Abzug. Aceton ist brennbar und reizend. Behandeln und lagern Sie es daher in Glas und verwenden Sie es in einem chemischen Abzug. Entsorgen Sie als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
      HINWEIS: Methanol und Aceton können jeweils bis zu fünf Mal wiederverwendet werden.
3. Aktivieren Sie die Deckglasoberfläche für die Silanfunktionalisierung.
   1. Badebeschallung mit 1 M Kaliumhydroxid (KOH) für 20 min. Gießen Sie den KOH vorsichtig aus dem Coplin Jar in ein 50 ml konisches Rohr zur Wiederverwendung.
      ACHTUNG: KOH ist ätzend und reizend. In einem chemischen Abzug verwenden und nicht in Glas lagern. Lagern Sie es in Polypropylenröhren. Entsorgen Sie als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
      HINWEIS: KOH kann bis zu fünf Mal wiederverwendet werden.
   2. Zweimal mit ddH 2 O abspülen. ddH₂O aus den Deckgläsern abtropfen lassen und dann jeden Deckglas erhitzen, indem Sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners winken, um die gesamte Oberflächenfeuchtigkeit abzuleiten. Legen Sie die Deckgläser in ein trockenes Coplin-Glas.
4. Führen Sie eine Deckglasaminosilanisierung durch.
   1. Die Aminosilanlösung wird hergestellt, indem 69,4 ml Methanol mit 3,6 ml Essigsäure (_CH3COOH) in einem konischen Kolben gemischt werden. 720 μL N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan (Aminosilan) zugeben und gut mischen (siehe Materialtabelle).
      ACHTUNG: Essigsäure ist brennbar und korrosiv. Mit Glaspipetten handhaben und in Glas aufbewahren. Arbeiten Sie mit Essigsäure in einem chemischen Abzug. Aminosilan ist eine akut toxische Inhalationsgefahr, ein Sensibilisator und ein Reizstoff. Es ist schädlich für das Wasserleben. Verwendung in einem chemischen Abzug. Entsorgen Sie die Chemikalien als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
      HINWEIS: Aminosilan ist lichtempfindlich und hydrolysiert schnell in Wasser. Alle Schritte mit diesem Reagenz müssen unter minimalen Lichtverhältnissen durchgeführt werden, um die Aktivität aufrechtzuerhalten. Spülen Sie die Flasche mit Stickstoffgas aus und tragen Sie die Siegelfolie auf, bevor Sie sie in einem dunklen Exsikkator lagern. Alle 6-9 Monate ersetzen.
   2. Fügen Sie die Aminosilanlösung sofort in das Coplin-Glas hinzu. Decken Sie die Dichtungsfolie ab und tragen Sie sie auf, um weiterhin vor Licht zu schützen.
   3. Inkubieren Sie die Deckgläser in der Aminosilanlösung für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT). Badebeschallung für 1 min und dann weitere 10 min inkubieren. Gießen Sie die Aminosilanlösung vorsichtig in einen für CH 3 OH bestimmten Abfallbehälter mit Spuren_vonAminosilan und CH₃COOH.
   4. Spülen Sie die Deckgläser mit Methanol aus und gießen Sie die Lösung in einen für Methanol bestimmten Abfallbehälter.
   5. Spülen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 2 min mit ddH₂O ab. Die Deckgläser abtropfen lassen, überschüssige Feuchtigkeit abtupfen und 10 Minuten lang vollständig an der Luft trocknen.
5. Führen Sie die Array-Vorbereitung/Biotin-PEG-Funktionalisierung der Deckgläser durch.
   1. Es wird ein 1 m NaHCO 3 (pH 8,5) Arbeitsmaterial hergestellt, indem 84,5 mg_{NaHCO 3} in 1 ml ddH₂ O gelöst werden. Für eine Endkonzentration von 10 mM NaHCO 3 1 M_{NaHCO 3} in ddH₂O (1:100₎ verdünnen.
   2. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift ein Rasterarray auf die trockenen aminosilanisierten Deckgläser (siehe Materialtabelle) und warten Sie, bis die Tinte getrocknet ist. Schreiben Sie einen Bezeichner auf das Deckblatt, um die richtige Ausrichtung zu markieren. Legen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer.
      HINWEIS: Das Array sollte aus 16-20 Quadraten bestehen, die ungefähr 4 mm x 4 mm groß sind.
   3. Um die Biotin-PEG-Succinimidylvalerate (Biotin-PEG)/mPEG-Succinimidylvalerat-Lösung (mPEG) herzustellen, entfernen Sie zunächst mPEG und Biotin-PEG (siehe Materialtabelle) aus dem Gefrierschrank und gleichen sie auf RT aus. 153 mg mPEG und 3,9 mg Biotin-PEG (~1:39 Biotin-PEG:mPEG) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und in 609 μL 10 mM NaHCO_{3 durch sanftes} Pipettieren resuspendieren. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min bei RT, um Blasen zu entfernen.
      HINWEIS: Die Hydrolysehalbwertszeit von Succinimidylvalerat in pH 8,5 Puffer beträgt ~30 min. Nachdem Sie den Puffer zu mPEG hinzugefügt haben, fahren Sie so schnell wie möglich mit den folgenden Schritten fort. Dieser Schritt ist entscheidend.
   4. Tragen Sie die Biotin-PEG/mPEG-Lösung auf, um jedes Quadrat in den Deckglas-Arrays vollständig abzudecken, typischerweise 10-15 μL pro Quadrat. Lassen Sie nicht zu, dass Flüssigkeit den definierten Raum überläuft. Lagern Sie die Deckgläser in einer Feuchtigkeitskammer im Dunkeln für 3-4 h bei RT.
   5. Waschen Sie die Deckgläser mit reichlich Wasser, indem Sie sie nacheinander in 3x 250 ml Glasbecher tauchen, die mit ddH₂O für jeweils 10 s gefüllt sind.
   6. Jegliche Feuchtigkeit aus den Deckgläsern mit Stickstoffgas ableiten. Lagern Sie die Coverslips Rücken an Rücken in einem stickstoffgefüllten 50 ml konischen Röhrchen, das mit Dichtfolie umwickelt ist, bei -20 °C.
      HINWEIS: Fahren Sie sofort mit Schritt 2 fort oder lagern Sie Deckgläser bei -20 °C für bis zu 1 Woche vor dem Gebrauch.

2. Herstellung von SiMPull-Lysat

ACHTUNG: Die erforderliche PSA für die verbleibenden Schritte des Protokolls sind Nitrilhandschuhe, Schutzbrillen und Laborkittel.

HINWEIS: Die Lysate wurden aus den adhärenten CHO-Zellen hergestellt, die EGFR-GFP exprimieren. Die Zellen wurden über Nacht in einer 60 mm Gewebekulturschale (TC60) plattiert^12,13. CHO-Zellen wurden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 500 ng / ml Genetisch (siehe Materialtabelle). Andere adhärente Zelllinien oder Suspensionszellen können ebenfalls verwendet werden.

1. Kennzeichnen Sie die Zellen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Waschen Sie die Kulturschale (mit den Zellen) mit 1 ml 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 1x Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 5 Minuten bei 37 ° C, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen mit einer Pipette von der Schale in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
   2. Nehmen Sie 10 μL Trypanblau und mischen Sie mit 10 μL Zellsuspension in einem separaten Zentrifugenröhrchen. Zählen Sie Zellen mit 10 μL der Zellmischung in einem automatischen Zellzähler gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
   3. Platte 8 x 10⁵ Zellen über Nacht in einer TC60 Petrischale. Teller ein Gericht pro Bedingung.
      HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden die Zellen entweder unbehandelt oder mit Pervanadat und EGF behandelt, wie in Schritt 2.4.1 beschrieben.
2. Bereiten Sie die folgenden Lösungen für die Zelllysatpräparation vor.
   1. Eiskalt 1x PBS (pH 7,4) zubereiten.
   2. Es ist ein Lysepuffer herzustellen, eine Lösung aus 1% nichtionischem, nicht degenerierendem Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) und 150 mM NaCl, ergänzt mit Protease/Phosphatase-Inhibitor (PPI) (1:100 ab Lager). Tube auf einen Nutator legen und Puffer für 15 min mischen lassen. Bewahren Sie die vorbereitete Lösung auf Eis auf.
   3. Bereiten Sie den Puffer des Tyrods für eine Endkonzentration von 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH_7,2), 20 mM Glukose und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) vor (siehe Materialtabelle). Die Lösung auf 37 °C erwärmen.
3. Bereiten Sie die Positivkontrolle für die Phosphorylierung vor - 1 mM Pervanadatbehandlung.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Pervandat ist die peroxidierte Form von Vanadat - einem Inhibitor der Proteintyrosinphosphatasen¹⁶. Die Verhinderung der Proteindephosphorylierung durch Hemmung der Phosphataseaktivität führt zu einer stark phosphorylierten Probe.
   1. Bereiten Sie einen 200-mM-Vorrat an aktiviertem Natriumorthovanadat (Na₃VO₄) vor.
      1. Zur Herstellung einer 100 ml Lösung werden 3,89 g_Na3VO₄ (siehe Materialtabelle) in 90 ml ddH₂O gegeben und unter Rühren gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 10 ein, indem Sie HCl oder NaOH tropfenweise hinzufügen. Durch das Hinzufügen von HCl wird die Lösung gelb.
      2. Bringen Sie das Volumen auf 100 ml mit ddH 2 O. Kochen Sie die Lösung_,indem Sie sie in der Mikrowelle erhitzen. Nach dem Kochen ist die Lösung farblos.
      3. Kühlen Sie die Lösung auf RT ab und stellen Sie den pH-Wert auf 10 wieder her. Wiederholen Sie das Kochen, Abkühlen und die pH-Einstellung noch zwei bis vier weitere Male, bis sich der pH-Wert bei 10 stabilisiert. Aliquot und bei -20 °C lagern.
   2. Es wird ein Material von 30 mM Pervanadat (PV) hergestellt, indem 20,4 μL 3% H2O2 mit 100 μL₂₀₀mM Na3 VO 4 und 546,8 μL_ddH2O (äquimolare Konzentrationen von_H2O2und aktiviertes_Na3VO4) gemischt werden. 15 min im Dunkeln bei RT inkubieren.
   3. Bereiten Sie 1 mM PV im Puffer von Tyrode vor. Für eine 10-ml-Lösung fügen Sie 0,33 ml 30 mM PV-Material zu 9,67 ml 37 °C Tyrodes Puffer hinzu. Behandeln Sie Zellen sofort.
   4. Waschen Sie die Zellen einmal mit 3 ml Tyrodes Puffer. Fügen Sie 3 ml 1 mM PV in den Puffer der Tyrode zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 min bei 37 °C.
4. Führen Sie die Ligandenstimulation durch.
   1. Stimulieren Sie Zellen mit dem interessierenden Liganden mit geeigneter Konzentration, Zeit und Temperatur. Für eine maximale EGFR-Stimulation inkubieren Sie mit 1 ml von 50 nM epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, siehe Materialtabelle) + 1 mM PV im Tyrode-Puffer für 5 min bei 37 °C.
5. Führen Sie eine Zelllyse durch.
   1. Nach gewünschter Zellbehandlung die Schale auf Eis legen und mit eiskaltem 1x PBS waschen. Entfernen Sie das gesamte PBS-Volumen vollständig mit einer Pipette.
   2. 180 μL Lysepuffer (Schritt 2.2.2) in die Platte geben. Verwenden Sie einen Zellenschaber zum Ziehen des Puffers um die Platte, um die Zellen vollständig abzudecken. Üben Sie festen, gleichmäßigen Druck mit dem Zellenschaber über die gesamte kultivierte Oberfläche aus, um die Zellen vollständig zu lysieren.
      HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers muss auf ein Minimum reduziert werden, um eine hohe Proteinkonzentration zu gewährleisten.
   3. Pipettieren Sie die lysierten Zellen und übertragen Sie sie in eine 1,5-ml-Röhre. Halten Sie die Röhre für 30 min auf Eis. Wirbeln Sie die Lysate alle 5 Minuten ein.
      HINWEIS: Wenn der POI aus mehreren Untereinheiten besteht oder empfindlich auf Dissoziation reagiert, sollten Sie die Lysate nicht umdrehen.
   4. Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen bei 16.000 x g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand mit einer Pipette auf eine neue 1,5-ml-Röhre. Dieser enthält das Gesamtproteinlysat.
   5. Halten Sie 10 μL des Lysats zurück und verdünnen Sie es in 90 μL des Lysepuffers für die bicinchoninische kolorimetrische Assay (BCA)^{Analyse 17}. Lagern Sie das restliche Gesamtproteinlysat bei -80 °C.
   6. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration des Lysats mithilfe der BCA-Analyse (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Gesamtproteinlysate können am Experimenttag hergestellt und frisch verwendet oder als Einwegaliquots bei -80 °C für bis zu 12 Wochen gelagert werden. Nicht einfrieren/auftauen.

3. Funktionalisierung des Arrays mit dem biotinylierten Antikörper

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
   1. T50-Puffer, eine Lösung von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM NaCl. Die Lösung ist bei RT für 1 Monat stabil.
   2. T50-BSA durch Ergänzung des T50-Puffers mit 0,1 mg/ml BSA. Bewahren Sie die vorbereitete Lösung auf Eis auf.
   3. 10 mg/ml Natriumborhydrid (NaBH₄) in 1x PBS. Bereiten Sie dies unmittelbar vor dem Gebrauch vor.
   4. 0,2 mg/ml NeutrAvidin (siehe Materialtabelle) im T50-Puffer.
      ACHTUNG: NaBH₄ ist ein Reduktionsmittel und brennbar. Spülen Sie den Behälter nach Gebrauch immer mit Stickstoffgas aus und lagern Sie ihn in einem Exsikkator.
2. Funktionalisieren Sie das Array mit dem biotinylierten Antikörper.
   1. Entfernen Sie die funktionalisierten PEG-Biotin-Arrays aus dem Gefrierschrank und gleichen Sie das konische Röhrchen vor dem Öffnen mit RT aus. Legen Sie das Deckglas mit dem nach oben ausgerichteten Array auf eine mit Siegelfolie ausgekleidete 100-mm-Gewebekulturschale (TC100).
      HINWEIS: Minimieren Sie die Deckenbeleuchtung. Alle Lösungen sollten sich auf den durch das hydrophobe Array definierten Quadraten "abperlen". Fügen Sie ein geeignetes Lösungsvolumen hinzu, um jedes Quadrat vollständig abzudecken (typischerweise 10-15 μL), und lassen Sie nicht zu, dass Flüssigkeit den definierten Raum überläuft. Um Flüssigkeiten schnell zu entfernen, verwenden Sie eine hauseigene Vakuumleitung, die an einer Vakuumflasche befestigt ist, um Abfälle aufzufangen. Lassen Sie NaBH₄ vor der Entsorgung 1 h lang entgasen, indem Sie das Rohr im chemischen Abzug offen lassen. Die NaBH 4-Behandlung ist notwendig, um die Autofluoreszenz im Hintergrund zu reduzieren und dadurch die Erkennung_{falsch-positiver} Einzelmoleküle zu reduzieren.
   2. Behandeln Sie jedes Quadrat des Arrays mit 10 mg/ml NaBH 4 in 1x PBS für 4 min bei RT_. Dreimal mit PBS waschen.
   3. Inkubieren Sie jedes Quadrat für 5 Minuten mit 0,2 mg / ml NeutrAvidin in T50. Dreimal mit T50-BSA waschen.
      HINWEIS: NeutrAvidin bindet an PEG-Biotin und bietet eine Bindungsstelle für biotinylierte Antikörper^12,13,15.
   4. Inkubieren Sie jedes Quadrat für 10 min mit 2 μg / ml biotinyliertem POI-spezifischem Antikörper in T50-BSA; Dreimal mit T50-BSA waschen.
      HINWEIS: Das vorliegende Protokoll verwendet biotinyliertes Anti-EGFR-IgG (siehe Materialtabelle) zur Erfassung von EGFR-GFP.

4. SiMPull von POI aus ganzzelligen Lysaten

HINWEIS: Stellen Sie die TC100-Schale mit funktionalisierten SiMPull-Arrays für den Rest der SiMPull-Zubereitung auf Eis. Dieser Schritt ist der Pull-Down eines POI aus dem Gesamtproteinlysat. Das Lysat darf nach dem Auftauen nicht wiederverwendet werden.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
   1. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) / 0,1% Glutaraldehyd (GA) in 1x PBS vor.
      ACHTUNG: PFA und GA sind toxische chemische Fixiermittel und potenzielle Karzinogene. Tragen Sie PSA. Entsorgen Sie die Chemikalien als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
   2. Bereiten Sie 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 vor.
2. Tauen und mischen Sie das Lysat, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Bleiben Sie auf Eis.
3. 1 μL des Lysats in 100 μL eiskaltes T50-BSA/PPI verdünnen.
   HINWEIS: Bestimmen Sie bei Bedarf den geeigneten Verdünnungsfaktor des Gesamtproteinlysatsats, indem Sie eine Reihe von Verdünnungen auf das Array anwenden. Die optimale Dichte der SiMPull-Rezeptoren pro Array-Bereich beträgt 0,04-0,08/μm². Lysatverdünnungen können in Schritt 6 (Datenanalyse) beurteilt werden.
4. Inkubieren Sie das Lysat auf dem Array für 10 min; dann viermal mit eiskaltem T50-BSA/PPI waschen.
5. Verdünnen Sie AF647-konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (siehe Materialtabelle) in eiskaltem T50-BSA/PPI und inkubieren Sie auf dem Array für 1 h.
   HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wird ein pan-anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG verwendet, um die phosphorylierte Population von EGFR-GFP zu identifizieren. Durch die Verwendung von direkt markierten Antikörpern entfällt die Notwendigkeit von Sekundärantikörpern, wodurch die Kennzeichnungsmöglichkeiten erweitert und die Konsistenz der Ergebnisse verbessert wird. Fluoreszenzmarkierte Antikörper können aus kommerziellen Quellen gewonnen werden. Wenn sie nicht im Handel erhältlich sind, können Antikörper mit Standard-Biokonjugationstechniken individuell gekennzeichnet werden, und kommerzielle Biokonjugationskits sind verfügbar. Jede Charge fluoreszierend markierter Antikörper muss auf optimale Markierungsbedingungen getestet werden, indem SiMPull durchgeführt wird, um eine Dosiskurve zu messen und den Sättigungspunkt zu finden.
6. Sechsmal mit eiskaltem T50-BSA insgesamt 6-8 min waschen.
7. Zweimal mit eiskaltem 1x PBS waschen.
8. Inkubieren Sie das Array mit 4% PFA/0,1% GA-Lösung für 10 Minuten, um eine Antikörperdissoziation zu verhindern.
9. Waschen Sie zweimal für jeweils 5 Minuten mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 / PBS, um die Fixiermittel zu inaktivieren.
   HINWEIS: Bei Experimenten mit mehr als einem Antikörper (z. B. Nachweis multipler Phosphotyrosinstellen) wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.9. Siehe Schritt 6.2.9 für Informationen zur Bestimmung der sterischen Behinderung zwischen zwei Antikörpern.

5. Bildaufnahme

HINWEIS: Die Einzelmolekül-Bildaufnahme wird mit einem 150-fachen TIRF-Objektiv und einem Bildteiler durchgeführt, der jeden Spektralkanal in einem bestimmten Quadranten der emCCD-Kamera erfasst (siehe Materialtabelle). Kalibrierungsbilder werden zunächst aufgenommen, um eine Kanalregistrierung und Kameraverstärkungskalibrierung mit einem nanostrukturierten Kanalausrichtungsgitter (Nanogrid) zu ermöglichen, das 20 x 20 Arrays von 200 ± 50 nm-Löchern in einem Intrahole-Abstand von 3 ± 1 μm (Gesamtgröße ~ 60 μm × 60 μm) enthält.

1. Führen Sie die Kanalregistrierung mit den folgenden Schritten durch.
   HINWEIS: Eine genaue Kanalregistrierung ist erforderlich, um die Kolokalisierung von Emittern richtig zu berechnen. Dieser Schritt ist entscheidend.
   1. Reinigen Sie das Ölobjektiv und deponieren Sie einen Tropfen Öl auf dem Ziel. Platzieren Sie das Nanogitter zur Bildgebung auf der Bühne. Konzentrieren Sie sich mit durchgelassenem weißem Licht auf das Gittermuster.
      HINWEIS: Bilder mit dem Nanogitter werden mit Durchlicht aufgenommen, das durch das Nanogitter geht und in allen Spektralkanälen detektiert wird. Alternativ kann man multifluoreszierende Perlen verwenden, die die in jedem Kanal detektierte Fluoreszenz emittieren. Die Bildaufnahme muss entsprechend jedem Mikroskop-Setup optimiert werden.
   2. Erwerben Sie eine Serie von 20 Bildern des Rasters. Stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht gesättigt sind. Speichern Sie die Bildserie als "Fiducial".
   3. Defokussieren Sie das Nanogitter, um ein Airy-Muster¹⁸ zu erzeugen. Erfassen Sie eine Serie von 20 Bildern für Verstärkungskalibrierungen. Speichern Sie das Bild unter dem Namen "Gain".
   4. Erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern für den Kamera-Offset, indem Sie verhindern, dass das gesamte Licht zur Kamera gelangt. Speichern Sie das Bild unter dem Motto "Hintergrund".
2. Erfassen Sie SiMPull-Bilder.
   HINWEIS: Bevor Sie das Deckglas-Array abbilden, tauschen Sie die Tris-Lösung gegen T50-BSA aus und gleichen Sie das Array mit RT aus.
   1. Reinigen Sie das Ölobjektiv und deponieren Sie zusätzliches Öl auf dem Ziel. Befestigen Sie das Coverslip-Array auf der Mikroskopstufe.
   2. Optimieren Sie die Anregungsleistung, den TIRF-Winkel und die Kameraintegrationszeit jedes Fluorophors. Ziel ist es, das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen und gleichzeitig die Photobleiche der Probe zu minimieren. Zeichnen Sie die Laserleistung auf, um die Konsistenz bei zukünftigen Messungen zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die vorliegende Studie verwendete 300 ms Belichtungszeit für den fernroten Kanal und 1 s für den grünen Kanal. Der 642-nm-Laser wurde mit einer Laserleistung von etwa 500 μW verwendet, während der 488-nm-Laser mit 860 μW verwendet wurde, gemessen vor der Röhrenlinse.
   3. Erfassen Sie Bilder für jede Probe. Stellen Sie sich zuerst den fernroten Kanal vor, gefolgt von jedem Fluorophor mit niedrigerer Wellenlänge, um die Photobleiche zu reduzieren. Aufgrund des geringen Volumens, das für jede Probe verwendet wird, überprüfen Sie den Pufferstand alle 30-45 Minuten und füllen Sie ihn bei Bedarf auf.

6. Datenanalyse

1. Laden Sie die Demo-Codes herunter.
   HINWEIS: Der bereitgestellte Demo-Code und die Beispieldatensätze veranschaulichen den vollständigen Datenanalyse-Workflow (Supplementary Coding Files 1-4). Die in SiMPullMain.m aufgeführten Systemanforderungen finden Sie in der Supplementary Coding File 1.
   1. Entpacken und Speichern in einem persönlichen Documents/MATLAB (MacOS/Linux)- oder Documents\MATLAB (Windows)-Verzeichnis.
      HINWEIS: Dadurch werden vier neue Ordner generiert: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
   2. Öffnen Sie die Datei "ReadMe_Setup.txt" im Ordner SiMPull_class.
   3. Installieren Sie MATLAB- und MATLAB-Toolboxen: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox und Statistics and Machine Learning Toolbox.
   4. Installieren Sie DipImage¹⁹ gemäß den Download-Anweisungen.
   5. Installieren Sie das "Smite"-Einzelmolekül-Analysepaket wie in ReadMe_setup.txt beschrieben.
      HINWEIS: "smite" ist im GitHub-Repository verfügbar (siehe Materialverzeichnis).
   6. Öffnen Sie die Datei SiMPullMain.m, die sich in SiMPull_class Ordner befindet, indem Sie die Datei in das MATLAB-Fenster ziehen.
   7. Wechseln Sie in das Verzeichnis ...\MATLAB\Sample Data\, indem Sie auf das Symbol Ordner suchen klicken und den Ordner auswählen.
2. Übersicht der Datenverarbeitungsschritte
   1. Führen Sie SiMPullMain.m aus - folgen Sie den Anweisungen für jeden Abschnitt. Führen Sie jeden Abschnitt einzeln aus, indem Sie den Cursor in diesem Abschnitt platzieren und auf das Symbol Abschnitt ausführen klicken.
      HINWEIS: Die allgemeinen Schritte für die Datenanalyse werden in diesem Abschnitt beschrieben. Detaillierte Anweisungen finden Sie im beigefügten SiMPullMain.m-Code.
   2. Führen Sie den Abschnitt "Initialisierung" aus, um den Pfad zum Definieren von Spektralkanälen und Bildgröße festzulegen.
   3. Führen Sie den Abschnitt "Kameraverstärkung und -versatz suchen" aus, um die Kameraverstärkung mithilfe der Verstärkungs- und Hintergrund-Datasets in Photonen umzuwandeln.
   4. Führen Sie den Abschnitt "Kanalregistrierung" aus, um die lokale gewichtete mittlere Transformation zu berechnen, die für die Bildregistrierung verwendet wird.
   5. Formatieren und kuratieren Sie die Daten. Führen Sie den Abschnitt "Sequenzielle Kanäle zu einem Quad-Image verbinden" aus. Führen Sie "Ungültige Frames entfernen" aus.
   6. Führen Sie den Abschnitt "Einzelne Moleküle anpassen und überlappende Moleküle finden" aus.
      HINWEIS: In diesem Abschnitt werden mehrere Funktionen ausgeführt, um einzelne Moleküle in jedem Kanal zu lokalisieren und Kolokalisierungsereignisse zwischen Spektralkanälen zu bestimmen.
   7. Um die minimale Photonenzahl pro echter GFP-Anpassung zu bestimmen, führen Sie den "Optimize Minimum Photon Threshold" aus. Dies ist ein iterativer Prozess.
      1. Stellen Sie zuerst smf ein. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] und führen Sie den Abschnitt aus. Wählen Sie "Leere Daten"-Dateien, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Wiederholen Sie den Vorgang mit den Dateien "CHO-EGFR-GFP".
      2. Wählen Sie einen geeigneten Mindestschwellenwert aus, indem Sie die beiden Histogramme vergleichen. Stellen Sie smf ein. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] und führen Sie den Abschnitt erneut aus.
   8. Führen Sie den Abschnitt "Calculate Percentage of GFP fits Positive for FR Signal" aus, um Hintergrundlokalisierungen zu korrigieren und Endwerte zu berechnen.
   9. Führen Sie Option 1 (Schritt 6.2.10) oder Option 2 (Schritt 6.2.11) entsprechend dem experimentellen Bedarf aus.
   10. Option 1: Korrigieren Sie die Anzahl der Rezeptoren, die an der Plasmamembran für die Ligandenbindung zur Verfügung stehen, wie in Referenz¹⁵ beschrieben.
       1. Erstens, markieren Sie Oberflächenrezeptoren mit gesättigten Konzentrationen von fluoreszierendem NHS-Ester-Farbstoff (NHS-AF647, siehe Materialtabelle). Führen Sie dann ein SiMPull-Experiment durch, um den Prozentsatz der GFP-Lokalisierung zu bestimmen, der mit AF647 kolokalisiert wird.
          HINWEIS: Dies liefert eine Schätzung des Anteils der für die NHS-Markierung verfügbaren Rezeptoren und des Verhältnisses der Rezeptoren auf der Oberfläche (SR).
       2. Wenden Sie die SR-Korrektur in der endgültigen Berechnung an: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, wobei NGFP die korrigierte Anzahl von GFP-Lokalisierungen, NBG die Hintergrundlokalisierungsnummer und NLOC die Gesamtlokalisierungen ist.
          HINWEIS: Im vorliegenden Beispiel wird diese Korrektur nicht angewendet, da Pervanadat^{membrandurchlässig 16} ist und daher die Wirkung der Phosphatasehemmung nicht auf Oberflächenrezeptoren beschränkt ist.
   11. Option 2: Berücksichtigen Sie für Multisite-Phosphorylierungsmessungen das Potenzial für sterische Behinderungen, wenn zwei Antikörper verwendet werden.
       HINWEIS: Sterische Behinderung kann zu einer Verringerung des beobachteten Prozentsatzes phosphorylierter Rezeptoren für Antikörper 1 führen, wenn Antikörper 2 (P12) vorhanden ist, verglichen mit Antikörper 1 allein (P1).
       1. Verwenden Sie SiMPull, um P1 und P12 zu bestimmen und den Korrekturfaktor für sterische Behinderung gemäß der zuvor veröffentlichten Referenz¹⁵ zu berechnen.

Ergebnisse

Ein Cartoon, der den SiMPull-Prozess darstellt, ist in Abbildung 1A dargestellt. Deckgläser werden mit NeutrAvidin als Anker für biotinylierte Anti-EGFR-Antikörper funktionalisiert, um EGFR-GFP aus dem Gesamtprotein Lysate zu gewinnen. Nach dem Abwaschen von ungebundenem Protein werden die phosphorylierten Rezeptoren mit einem Anti-Phosphotyrosin (Anti-PY)^{-Antikörper 15} markiert. Abbildung 1B zeigt ein Bild des hydrophoben Arrays, in ...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um quantitative Messungen der Rezeptorphosphorylierung auf Einzelproteinebene zu ermöglichen. Es wurden mehrere einfache, aber wichtige Modifikationen am SiMPull-Protokoll entwickelt, die die Zuverlässigkeit der Messung für den Phospho-Tyrosin-Nachweis verbesserten, einschließlich der Verringerung der Autofluoreszenz mit NaBH_4-Behandlung und Nachfixierung der Probe, um eine Antikörperdissoziation zu verhindern. Die Verwendung der grünen Kanalmaske zur Iden...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	MTC Bio	C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl			T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish	CELLTREAT	229620	Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous
50 mL conical tube			Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl			Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish	Corning	430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16020	Hazardous
Acetone (C3H6O)	Millipore Sigma	270725	Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin	Leinco Technologies, Inc	E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biotechnology	sc-7020 AF647
Bath-sonicator	Branson	1200
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23227
Biotin-PEG	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin	Gold Biotechnology	A-420-1	Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)	Millipore Sigma	C4901	Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper	Bioworld	30900017-1
Conical Filtering Flask	Fisher Scientific	S15464
Coplin Jar	WHEATON	900470
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5	Electron Microscopy Sciences	63793
DipImage			https://diplib.org/
DMEM	Caisson Labs	DML19-500
emCCD camera	Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima	Bio-Techne	S12450H	Heat Inactivated
Fusion 360 software	Autodesk
Geneticin G418 Disulfate	Caisson Labs	G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)	JT Baker	JTB-9526-01	Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)	Millipore Sigma	D9434	Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78446	Lysis Buffer Component
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)	VWR	BDH7204-1	Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)		HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)	EMD Millipore	HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)	Sigma Aldrich	I8896	Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000
Immersol 518F immersion oil	Zeiss	444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)	MPBio	2191421	Tyrode's Buffer Component
Matlab	Mathworks		Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)	IBIS Scientific	MX0486-1	Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits	Biotium	92245	Suggested conjugation kit
mPEG	Laysan Bio	mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane	UCT United Chemical	A0700	Hazardous
Nanogrid	Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein	Thermo Fisher Scientific	31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA			Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope	Olympus
Parafilm M Sealing Film	The Lab Depot	HS234526C
PBS pH 7.4	Caisson Labs	PBL06
PC-200 Analog Hot Plate	Corning	6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb	Cell Signaling Technology	2236BF
Potassium Chloride (KCl)	Millipore Sigma	529552	Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)	Millipore Sigma	1050330500	Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter	Raise 3D	PMS:2035U/RAL:3028	Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer	Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles	Corning	1395-100	CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter	Photometrics	Model QV2
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides	VWR	10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)	Semrock	LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package			https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	S6014	Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)	Millipore Sigma	452874	Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)	Millipore Sigma	S9625	Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide	VWR	BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Millipore Sigma	S6508	Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)	Millipore Sigma	258105	Hazardous
TetraSpeck Microspheres	Thermo Fisher Scientific	T7279	multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base	Millipore Sigma	T1503
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific	25300120