Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Resumo

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Resumo

A fosforilação é uma modificação pós-transinal necessária que regula a função proteica e direciona os resultados da sinalização celular. Os métodos atuais para medir a fosforilação proteica não podem preservar a heterogeneidade na fosforilação entre proteínas individuais. O ensaio de tração única de moléculas (SiMPull) foi desenvolvido para investigar a composição de complexos macromoleculares através da imunoprecipitação de proteínas em um deslizamento de vidro seguido de imagem de molécula única. A técnica atual é uma adaptação do SiMPull que fornece quantificação robusta do estado de fosforilação de receptores de membrana de comprimento total no nível de molécula única. A imagem de milhares de receptores individuais dessa forma permite quantificar padrões de fosforilação de proteínas. O presente protocolo detalha o procedimento SiMPull otimizado, desde a preparação da amostra até a imagem. A otimização dos protocolos de preparação de vidro e fixação de anticorpos melhora ainda mais a qualidade dos dados. O protocolo atual fornece código para a análise de dados de molécula única que calcula a fração de receptores fosforilados dentro de uma amostra. Enquanto este trabalho se concentra na fosforilação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), o protocolo pode ser generalizado para outros receptores de membrana e moléculas de sinalização citostónica.

Introdução

A sinalização associada à membrana é ajustada por uma combinação de ativação do receptor de membrana induzida por ligante e recrutamento de proteínas acessórias a jusante que propagam o sinal. A fosforilação das tyrosinas-chave nas caudas citoplasmáticas receptoras é fundamental para iniciar a formação de complexos de sinalização, ou signalossomos ^1,2. Portanto, uma questão importante na biologia é como os padrões de fosforilação são criados e mantidos para recrutar parceiros de sinalização e ditar resultados celulares. Isso inclui compreender a heterogeneidade da fosforilação receptora, tanto em abundância quanto nos padrões específicos de fosfotimosina que podem fornecer um meio de manipular saídas de sinalização ditando a composição do sinalosome 3,4,5,6,7. No entanto, existem limitações nos métodos atuais para interrogar a fosforilação proteica. A análise de manchas ocidentais é excelente para descrever tendências de fosforilação proteica, mas é semi-quantitativa⁸ e não fornece informações sobre a heterogeneidade do sistema porque milhares a milhões de receptores são mediados juntos. Embora as manchas ocidentais permitam sondar uma amostra usando anticorpos específicos do fosfo para tirasinas específicas, elas não podem fornecer informações sobre padrões de fosforilação multisite dentro da mesma proteína. A fosfoproteômica quantitativa relata a abundância de fosfotyrosina, mas há limitações para detectar fosforilação multisite, pois os resíduos de interesse precisam estar localizados dentro do mesmo peptídeo (tipicamente 7-35 aminoácidos) que é gerado pela digestão enzimática ^9,10,11.

Para superar as limitações mencionadas acima, o ensaio de uma única molécula pull-down (SiMPull) foi adaptado para quantificar os estados de fosforilação de receptores intactos no nível de molécula única. O SiMPull foi demonstrado pela primeira vez como uma poderosa ferramenta para interrogar complexos macromoleculares por Jain et ^al.12,13. No SiMPull, os complexos macromoleculares foram imunoprecipitados (IP) em tampas de vidro funcionalizadas por anticorpos e, em seguida, analisados através de microscopia de molécula única para número de subunidade proteica e co-IP com componentes complexos¹². Uma modificação de Kim et ^al.14, denominada SiMBlot, foi a primeira a usar uma variação de SiMPull para analisar a fosforilação de proteínas desnaturadas. O protocolo SiMBlot baseia-se na captura de proteínas de superfície celular biotinilada usando tampas revestidas de NeutrAvidin, que são então sondadas para fosforilação com rotulagem de anticorpos específicos do fosfo¹⁴. Apesar desses avanços, foram necessárias melhorias para tornar a quantificação da modificação pós-transinal mais robusta e aplicável a uma gama mais ampla de proteínas.

O presente protocolo descreve uma abordagem simpull otimizada que foi usada para quantificar padrões de fosforilação do receptor de fator de crescimento epidérmico intacto (EGFR) em resposta a uma série de condições de ligantes e mutações oncogênicas¹⁵. Embora este trabalho se concentre no EGFR, essa abordagem pode ser aplicada a qualquer receptor de membrana e proteínas citosóicas de interesse (POI), para as quais anticorpos de qualidade estão disponíveis. O protocolo inclui etapas para reduzir a autofluorescência da amostra, um projeto de matriz de amostra que requer volume mínimo de amostra com preparação simultânea de até 20 amostras e otimização das condições de rotulagem e fixação de anticorpos. Algoritmos de análise de dados foram desenvolvidos para detecção e quantificação de proteínas fosfoiladas.

Protocolo

1. Preparação do deslizamento de cobertura

NOTA: Para esta etapa, é preciso usar equipamentos de proteção individual (EPI), que inclui uma camada dupla de luvas de nitrito, óculos de segurança ou escudo facial, e um jaleco.

1. Realize a gravura de piranha para remover detritos orgânicos do vidro.
   ATENÇÃO: A solução piranha é um agente oxidante forte que é corrosivo e altamente reativo quando em contato com materiais orgânicos. A reação com detritos orgânicos é exotérmica e potencialmente explosiva. Assim, o procedimento deve ser realizado em um capô de fumaça química com a faixa abaixada. O vidro Pyrex é necessário para lidar com a solução piranha.
   1. Prepare o espaço de trabalho dentro de um capô de fumaça química. Disponha tampas sem sobreposição no fundo de um copo de vidro 4 L, o béquer "reação" e coloque o béquer de reação em uma placa quente com calor suave. Deixe os vidros aquecerem por 10 minutos. Coloque um béquer de vidro "desperdício" 1 L com 500 mL de ddH₂O proximal ao béquer de reação.
   2. Adicione 49 mL de ácido sulfúrico de 12 N (H₂SO₄) lentamente ao béquer de reação com uma pipeta sorológica de vidro. Enxágüe a pipeta no béquer antes do descarte.
   3. Adicione 21 mL de peróxido de hidrogênio de 30% (H₂O₂) dropwise com uma pipeta sorológica de vidro ao béquer de reação. Distribua lentamente as gotículas H₂O₂ uniformemente através da parte inferior do frasco de reação para evitar a sacieda localizada da reação de gravação de piranha. Enxágüe a pipeta no béquer antes do descarte.
      ATENÇÃO: Adicione sempre H₂O₂ no H₂SO₄, e nunca vice-versa.
   4. Piranha grava as tampas por 30 min. Agitar suavemente o conteúdo do béquer de reação a cada 5 minutos.
   5. Sacie a solução de piranha despejando o conteúdo do béquer de resíduos no béquer de reação. Transfira o líquido lentamente pela parede do béquer de reação para minimizar o espirro. Remova o béquer de reação da placa de aquecimento.
   6. Quando a reação for saciada e resfriada, despeje a solução de piranha de volta no béquer para neutralização sem remover as tampas gravadas do béquer de reação.
   7. Neutralizar a solução de piranha com a adição gradual de uma base fraca. Por exemplo, use uma massa excessiva de 20 g de bicarbonato de sódio (NaHCO₃)/100 mL solução de piranha.
      ATENÇÃO: Não armazene soluções de piranha em recipientes de resíduos lacrados. A solução deve ser sempre neutralizada antes do descarte. A reação de neutralização produz bolhas vigorosas e pode ser explosiva se não controlada pela adição gradual da base fraca.
   8. Mexa a solução neutralizada com uma haste de vidro e deixe-a reagir por 2h. Levante o pH para >4 e descarte a solução.
   9. Entre as adições de base fraca à solução piranha, transfira os clipes gravados do béquer de reação para um funil Buchner com uma haste de vidro e enxágue por 5 minutos na execução ddH₂O.
      NOTA: Prossiga imediatamente para o próximo passo ou armazene as tampas gravadas por piranha por até 2 semanas em ddH₂O em um frasco de vidro selado ou placa de Petri (enrole com filme de vedação, veja Tabela de Materiais).
2. Sonicar as tampas em solventes orgânicos seguindo os passos abaixo.
   1. Coloque as tampas em um frasco de vidro Coplin (ver Tabela de Materiais) e cubra com metanol (CH₃OH). Sele a tampa do frasco com filme de vedação e sonicato de banho por 10 minutos. Despeje cuidadosamente o metanol do frasco coplin em uma garrafa de armazenamento de vidro.
   2. Encha o frasco de Coplin com acetona (C₃H₆O), sele a tampa e sônica de banho por 10 minutos. Despeje cuidadosamente a acetona do frasco Coplin em uma garrafa de armazenamento de vidro.
      ATENÇÃO: O metanol é inflamável e extremamente tóxico. Use em um capuz de fumaça química. Acetona é inflamável e irritante. Portanto, manuseie com e guarde em vidro, e use-o em um capô de fumaça química. Descarte como resíduos perigosos de acordo com as normas e diretrizes locais.
      NOTA: Metanol e acetona podem ser reutilizados até cinco vezes cada.
3. Ative a superfície de deslizamento de tampa para a funcionalização do silano.
   1. Sonicato de banho com hidróxido de potássio de 1 M (KOH) por 20 min. Despeje cuidadosamente o KOH do Frasco de Coplin em um tubo cônico de 50 mL para reutilização.
      ATENÇÃO: KOH é corrosivo e irritante. Use em um capô de fumaça química e não guarde em vidro. Guarde-o em tubos de polipropileno. Descarte como resíduos perigosos de acordo com as normas e diretrizes locais.
      NOTA: O KOH pode ser reutilizado em até cinco vezes.
   2. Enxágüe duas vezes com ddH₂O. Drene ddH₂O das tampas e, em seguida, aqueça cada mancha de cobertura acenando através da chama de um queimador de Bunsen para afastar toda a umidade da superfície. Coloque as tampas em um frasco de Coplin seco.
4. Executar coberturalip aminosilanização.
   1. Prepare a solução de aminosilano misturando 69,4 mL de metanol com 3,6 mL de ácido acético (CH₃COOH) em um frasco cônico. Adicione 720 μL de N-(2-aminoetil)-3-aminopropyltrimethoxysilane (aminosilano) e misture bem (ver Tabela de Materiais).
      ATENÇÃO: O ácido acético é inflamável e corrosivo. Manuseie com pipetas de vidro e armazene em vidro. Trabalhe com ácido acético em um capô de fumaça química. Aminosilano é um risco de inalação agudamente tóxico, um sensibilizador e um irritante. É prejudicial à vida aquática. Use em um capuz de fumaça química. Descarte os produtos químicos como resíduos perigosos de acordo com as normas e diretrizes locais.
      NOTA: Aminosilano é fotossensíveis e hidrólises rapidamente na água. Todas as etapas com este reagente precisam ser executadas sob condições mínimas de luz para reter a atividade. Limpe a garrafa com gás nitrogênio e aplique filme de vedação antes de armazenar em um desiccator escuro. Substitua a cada 6-9 meses.
   2. Adicione imediatamente a solução de aminosilano ao frasco de Coplin. Cubra e aplique o filme de vedação, continuando a proteger da luz.
   3. Incubar as tampas na solução de aminosilano por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente (RT). Sonicato de banho por 1 min e depois incubar por mais 10 minutos. Despeje cuidadosamente a solução de aminosilano em um recipiente de resíduos designado para CH₃OH com aminosilano de traço e CH₃COOH.
   4. Enxágüe as tampas com metanol e despeje a solução em um recipiente de resíduos designado para metanol.
   5. Enxágüe as tampas três vezes por 2 min cada com ddH₂O. Escorra as tampas, destrua o excesso de umidade e o ar seque completamente por 10 minutos.
5. Realize a preparação do array/a funcionalidade biotin-PEG das tampas.
   1. Prepare 1 M NaHCO₃ (pH 8.5) de estoque de trabalho dissolvendo 84,5 mg de NaHCO₃ em 1 mL de ddH₂O. Para concentração final de 10 mM NaHCO₃, diluir 1 M NaHCO₃ em ddH₂O (1:100).
   2. Desenhe uma matriz de grade nas tampas aminosilanizadas secas com uma caneta de barreira hidrofóbica (ver Tabela de Materiais) e aguarde que a tinta seque. Escreva um identificador no deslizamento de tampas para marcar a orientação adequada. Coloque as tampas em uma câmara umidificada.
      NOTA: A matriz deve ser composta por 16-20 quadrados, aproximadamente 4 mm x 4 mm de tamanho.
   3. Para fazer a solução de valerate de succinimidyl biotina-PEG (biotin-PEG)/mPEG succinimidyl valerate (mPEG), primeiro, remova mPEG e biotin-PEG (ver Tabela de Materiais) do congelador e equilibre-se à RT. Adicione 153 mg de mPEG e 3,9 mg de biotin-PEG (~1:39 biotin-PEG:mPEG) a um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e resuspenque em 609 μL de 10 mM NaHCO₃ por tubulação suave. Centrifugar a 10.000 x g por 1 min no RT para remover bolhas.
      NOTA: A meia-vida hidrolise de valerate de succinimidyl em pH 8,5 tampão é ~30 min. Depois de adicionar o buffer ao mPEG, proceda com as seguintes etapas o mais rápido possível. Este passo é crítico.
   4. Aplique a solução biotin-PEG/mPEG para cobrir completamente cada quadrado nas matrizes de deslizamento de cobertura, tipicamente de 10-15 μL por quadrado. Não permita que o líquido transborde o espaço definido. Armazene as tampas em uma câmara de umidade no escuro por 3-4 h no RT.
   5. Lave as tampas com quantidades abundantes de água mergulhando-as sequencialmente em 3x 250 mL de bicos de vidro preenchidos com ddH₂O por 10 s cada.
   6. Retire toda a umidade das tampas com gás nitrogênio. Armazene as tampas de costas para trás em um tubo cônico de 50 mL cheio de nitrogênio embrulhado com filme de vedação a -20 °C.
      NOTA: Proceda imediatamente para a etapa 2 ou as tampas da loja deslizes a -20 °C por até 1 semana antes do uso.

2. Preparação de SiMPull lysate

ATENÇÃO: Os EPI necessários para as etapas restantes do protocolo são luvas de nitrito, óculos de segurança e jalecos.

NOTA: Os lises foram preparados a partir das células CHO aderentes expressando EGFR-GFP. As células foram banhadas em um prato de cultura tecidual de 60 mm (TC60) durante a noite^{de 12,13}. As células CHO foram cultivadas em DMEM suplementadas com 10% de soro bovino fetal, 1% L-glutamina, 1% penicilina-estreptomicina e 500 ng/mL de geneticina (ver Tabela de Materiais). Outras linhas de células aderentes ou células de suspensão também podem ser usadas.

1. Emplaque as células seguindo os passos abaixo.
   1. Lave o prato de cultura (contendo as células) com 1 mL de 1x PBS. Adicione 1 mL de trippsina 1x e incubar por 5 min a 37 °C para desprender as células. Usando uma pipeta, transfira as células separadas do prato para um tubo centrífuga de 1,5 mL.
   2. Pegue 10 μL de azul trypan e misture com 10 μL de suspensão celular em um tubo de centrífuga separado. Conte as células usando 10 μL da mistura celular em um contador automático de células, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   3. Placa 8 x 10⁵ células durante a noite em uma placa de petri TC60. Prato um prato por condição.
      NOTA: Para o presente estudo, as células não foram tratadas ou tratadas com Pervanadate e EGF, conforme descrito na etapa 2.4.1.
2. Prepare as seguintes soluções para a preparação do lise celular.
   1. Prepare o 1x PBS gelado (pH 7.4).
   2. Prepare o tampão de lise, uma solução de 1% detergente não iônico e não degenerador (ver Tabela de Materiais) em 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) e 150 mM NaCl complementado com Inibidor de Protease/Fosfattase (PPI) (1:100 de estoque). Coloque o tubo em um nutador e deixe o tampão misturar por 15 minutos. Mantenha a solução preparada no gelo.
   3. Prepare o tampão do Tyrode para uma concentração final de 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM de glicose e 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA) (ver Tabela de Materiais). Aqueça a solução a 37 °C.
3. Prepare o controle positivo para fosforilação - 1 mM de tratamento pervanadate.
   NOTA: Esta etapa é opcional. Pervandate é a forma peroxidizada de vanadate-an inibidor de fosfates de proteína tyrosina¹⁶. Prevenir a desfosforilação proteica inibindo a atividade fosfatase resulta em uma amostra altamente fosfoilada.
   1. Prepare um estoque de 200 mM de ortovanadate de sódio ativado (Na₃VO₄).
      1. Para preparar a solução de 100 mL, adicione 3,89 g de Na₃VO₄ (ver Tabela de Materiais) a 90 mL de ddH₂O e dissolva enquanto mexe. Ajuste o pH para 10 adicionando HCl ou NaOH dropwise. Adicionar HCl vai tornar a solução amarela.
      2. Leve o volume para 100 mL com ddH₂O. Ferva a solução aquecendo-a no micro-ondas. Depois de ferver, a solução será incolor.
      3. Esfrie a solução para RT e reajuste o pH para 10. Repita o ajuste de ebulição, resfriamento e pH de duas a quatro vezes, até que o pH se estabilize em 10. Aliquot e armazenar a -20 °C.
   2. Prepare um estoque de 30 mM pervanadate (PV) misturando 20,4 μL de 3% H₂O₂ com 100 μL de 200 mM Na₃VO₄ e 546,8 μL de ddH₂O (concentrações equimolar de H₂O₂ e ativada na_{VO 34}). Incubar no escuro em RT por 15 minutos.
   3. Prepare 1 mM PV no buffer de Tyrode. Para a solução de 10 mL, adicione 0,33 mL de estoque PV de 30 mM a 9,67 mL de 37 °C Tyrode tampão. Trate as células imediatamente.
   4. Lave células uma vez com 3 mL de tampão de Tyrode. Adicione 3 mL de 1 mM PV no tampão do Tyrode às células e incubar por 15 min a 37 °C.
4. Realize a estimulação de ligas.
   1. Estimule as células com o ligante de interesse usando concentração, tempo e temperatura adequadas. Para estimulação máxima de EGFR, incubar com 1 mL de 50 nM Epidérmico Growth Factor (EGF, ver Tabela de Materiais) + 1 mM de PV no buffer de Tyrode por 5 min a 37 °C.
5. Faça lise celular.
   1. Após o tratamento celular desejado, coloque o prato no gelo e lave com 1x PBS gelado. Remova completamente o volume total de PBS usando uma pipeta.
   2. Adicione 180 μL de tampão de lise (passo 2.2.2) à placa. Use um raspador de célula para puxar o tampão ao redor da placa para cobrir as células completamente. Aplique pressão firme e consistente com o raspador de células em toda a superfície cultivada para lise totalmente as células.
      NOTA: O volume de tampão de lise precisa ser mantido no mínimo para garantir uma alta concentração proteica.
   3. Pipeta as células lísedas e transferi-las para um tubo de 1,5 mL. Mantenha o tubo no gelo por 30 minutos. Vórtice os lises a cada 5 minutos.
      NOTA: Se o POI for composto por múltiplas subunidades ou for sensível à dissociação, não faça o vórtice dos lises.
   4. Centrifugar as células líssedas a 16.000 x g por 20 min a 4 °C. Transfira o supernatante para um novo tubo de 1,5 mL usando uma pipeta. Este contém o total de proteínas lysate.
   5. Reserve 10 μL do liseto e dilua-o em 90 μL do tampão de lise para análise de ensaio colorimétrico bicinchonínico (BCA)¹⁷. Armazene o restante da proteína total a -80 °C.
   6. Determine a concentração total de proteínas por meio da análise de BCA (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Os lisatos totais de proteína podem ser preparados no dia do experimento e usados frescos ou armazenados como alíquotas de uso único a -80 °C por até 12 semanas. Não congele/descongele.

3. Funcionalização da matriz com o anticorpo biotinilado

1. Prepare as seguintes soluções.
   1. T50 Buffer, uma solução de 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 50 mM NaCl. A solução é estável por 1 mês na RT.
   2. T50-BSA suplementando tampão T50 com 0,1 mg/mL de BSA. Mantenha a solução preparada no gelo.
   3. 10 mg/mL de boroidido de sódio (NaBH₄) em 1x PBS. Prepare isso imediatamente antes de usar.
   4. 0,2 mg/mL de NeutrAvidin (ver Tabela de Materiais) no buffer T50.
      ATENÇÃO: O NaBH₄ é um agente redutor e é inflamável. Limpe sempre o recipiente com gás nitrogênio após o uso e armazene-o em um desiccador.
2. Funcionalize a matriz com o anticorpo biotinilado.
   1. Remova as matrizes funcionalizadas PEG-biotin do congelador e equilibre o tubo cônico para RT antes de abrir. Coloque o deslizamento com a matriz orientada para um filme de vedação forrado de 100 mm de cultura tecidual (TC100).
      NOTA: Minimizar a iluminação aérea. Todas as soluções devem "subir" nos quadrados definidos pela matriz hidrofóbica. Adicione um volume apropriado de solução para cobrir completamente cada quadrado (tipicamente de 10-15 μL) e não permita que o líquido transborde o espaço definido. Para remover rapidamente os líquidos, use uma linha de vácuo interna presa a um frasco de vácuo para capturar resíduos. Deixe naBH₄ para degas por 1 h antes de descarte, deixando o tubo aberto no capô da fumaça química. O tratamento naBH₄ é necessário para reduzir a autofluorescência de fundo, reduzindo assim detecções de moléculas simples falsas e positivas.
   2. Trate cada quadrado da matriz com 10 mg/mL de NaBH₄ em 1x PBS por 4 min na RT. Lave três vezes com PBS.
   3. Incubar cada quadrado por 5 min com 0,2 mg/mL de NeutrAvidin em T50. Lave três vezes com T50-BSA.
      NOTA: NeutrAvidin se liga ao PEG-biotina e fornece um local de ligação para anticorpos biotinylated 12,13,15.
   4. Incubar cada quadrado por 10 min com 2 μg/mL de anticorpo específico poi biotinilado em T50-BSA; lavar três vezes com T50-BSA.
      NOTA: O presente protocolo usa o IgG anti-EGFR biotinilado (ver Tabela de Materiais) para capturar EGFR-GFP.

4. SiMPull de POI de lises de células inteiras

NOTA: Coloque o prato TC100 de matrizes simpull funcionalizadas no gelo para o restante da preparação do SiMPull. Este passo é a retirada de um POI do total de proteínas lysate. O lise não deve ser reutilizado após o descongelamento.

1. Prepare as seguintes soluções.
   1. Prepare 4% de paraformaldeído (PFA)/0,1% glutaraldeído (GA) em 1x PBS.
      ATENÇÃO: PFA e GA são fixadores químicos tóxicos e potenciais cancerígenos. Use EPI. Descarte os produtos químicos como resíduos perigosos de acordo com as normas e diretrizes locais.
   2. Prepare 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
2. Descongele e misture o lise por tubos suavemente para cima e para baixo. Mantenha-se no gelo.
3. Diluir 1 μL do lysate em 100 μL de gelo-frio T50-BSA/PPI.
   NOTA: Se necessário, determine o fator de diluição adequado do liseto proteico total, aplicando uma série de diluições à matriz. A densidade ideal dos receptores SiMPull por área de matriz é de 0,04-0,08/μm². As diluições de lise podem ser avaliadas na etapa 6 (análise de dados).
4. Incubar o lysate na matriz por 10 min; em seguida, lave quatro vezes com T50-BSA/PPI gelado.
5. Diluir o anticorpo antifosfotyrosina conjugado AF647 (ver Tabela de Materiais) no frio do gelo T50-BSA/PPI e incubar na matriz por 1h.
   NOTA: No presente protocolo, um Pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG é usado para identificar a população fosfoilada de EGFR-GFP. O uso de anticorpos diretamente rotulados elimina a necessidade de anticorpos secundários, aumentando as opções de rotulagem e melhorando a consistência dos resultados. Anticorpos fluorescentes podem ser obtidos de fontes comerciais. Se não estiverem disponíveis comercialmente, os anticorpos podem ser rotulados sob medida usando técnicas padrão de bioconjugação e kits de bioconjugação comercial. Cada lote de anticorpos fluorescentes rotulados precisa ser testado para condições ideais de rotulagem, realizando SiMPull para medir uma curva de dose e encontrar o ponto de saturação.
6. Lave seis vezes com T50-BSA gelada para um total de 6-8 min.
7. Lave duas vezes com 1x PBS gelado.
8. Incubar a matriz com solução PFA/0,1% GA de 4% por 10 minutos para evitar a dissociação de anticorpos.
9. Lave duas vezes por 5 min cada com 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS para inativar os fixativos.
   NOTA: Para experimentos que utilizam mais de um anticorpo ( por exemplo, detectando vários sítios de fosforosclerose), repita as etapas 4.5-4.9. Consulte o passo 6.2.9 para obter informações sobre como determinar o obstáculo estérico entre dois anticorpos.

5. Aquisição de imagens

NOTA: A aquisição de imagem de molécula única é realizada usando um objetivo TIRF de 150x e um divisor de imagens que captura cada canal espectral em um quadrante específico da câmera emCCD (ver Tabela de Materiais). As imagens de calibração são adquiridas pela primeira vez para permitir o registro do canal e a calibração do ganho da câmera com uma grade de alinhamento de canal nanopatada (nanogrid) que contém 20 x 20 matrizes de 200 ± buracos de 50 nm a uma distância intrahole de 3 ± 1 μm (tamanho total ~60 μm × 60 μm).

1. Realize o registro do canal seguindo as etapas abaixo.
   NOTA: É necessário um registro preciso do canal para calcular adequadamente a colocalização dos emissores. Este passo é crítico.
   1. Limpe o objetivo do óleo e deposite uma gota de óleo no objetivo. Coloque a nanogrid no palco para imagens. Usando luz branca transmitida, concentre-se no padrão da grade.
      NOTA: As imagens com a nanogrid são adquiridas usando luz transmitida, que passa pela nanogrid e é detectada em todos os canais espectrais. Alternativamente, pode-se usar contas multifluorescentes que emitem fluorescência detectada em cada canal. A aquisição de imagens precisará ser otimizada de acordo com cada configuração de microscópio.
   2. Adquira uma série de 20 imagens da grade. Certifique-se de que os pixels não estão saturados. Salve a série de imagens como "Fiducial".
   3. Desfoque a nanogrid para criar um padrão^{arejado 18}. Adquira uma série de 20 imagens para obter calibrações. Salve a imagem como "Ganho".
   4. Adquira uma série de 20 imagens para a câmera compensada bloqueando toda a luz de ir para a câmera. Salve a imagem como "Fundo".
2. Adquira imagens SiMPull.
   NOTA: Antes de imaginar o array de deslizamento de cobertura, troque a solução Tris por T50-BSA e equilibre a matriz para RT.
   1. Limpe o objetivo do óleo e deposite óleo adicional no objetivo. Fixar a matriz de deslizamento de tampas no estágio do microscópio.
   2. Otimize o poder de excitação de cada fluoróforo, o ângulo TIRF e o tempo de integração da câmera. O objetivo é alcançar o maior sinal-ruído, minimizando o fotobleaching da amostra. Regisso laser para consistência em medições futuras.
      NOTA: O presente estudo utilizou 300 ms tempo de exposição para o canal vermelho distante e 1 s para o canal verde. O laser de 642 nm foi usado a aproximadamente 500 μW de potência laser, enquanto o laser de 488 nm foi usado a 860 μW, medido antes da lente do tubo.
   3. Adquira imagens para cada amostra. Imagem o canal vermelho primeiro, seguido por cada fluorophore de comprimento de onda inferior para reduzir o fotobleaching. Devido ao baixo volume utilizado para cada amostra, verifique o nível do buffer a cada 30-45 min e reponha conforme necessário.

6. Análise de dados

1. Baixe os códigos de demonstração.
   NOTA: Os conjuntos de dados de demo e exemplo fornecidos demonstram o fluxo de trabalho completo de análise de dados (Arquivos de Codificação Suplementar 1-4). Os requisitos do sistema listados no SiMPullMain.m são encontrados no Arquivo de Codificação Suplementar 1.
   1. Descompactar e salvar em um diretório de Documentos/MATLAB pessoais (MacOS/Linux) ou Documentos\MATLAB (Windows).
      NOTA: Isso gera quatro novas pastas: SiMPull_class, smite, Dados de Amostra, Saídas de Análise de Amostras.
   2. Abra o arquivo "ReadMe_Setup.txt" encontrado na pasta SiMPull_class.
   3. Instale caixas de ferramentas MATLAB e MATLAB: Caixa de ferramentas de ajuste de curvas, caixa de ferramentas de computação paralela e caixa de ferramentas estatísticas e machine learning.
   4. Instale o DipImage¹⁹ de acordo com as instruções de download.
   5. Instale o pacote de análise de molécula única "smite", conforme descrito em ReadMe_setup.txt.
      NOTA: "smite" está disponível no repositório do GitHub (ver Tabela de Materiais).
   6. Abra o SiMPullMain.m, encontrado em SiMPull_class pasta, arrastando o arquivo para a janela MATLAB.
   7. Alterar diretório para ...\MATLAB\Sample Data\ clicando no ícone Procurar pasta e selecionando a pasta.
2. Visão geral das etapas de processamento de dados
   1. Execute SiMPullMain.m - seguindo instruções para cada seção. Execute cada seção individualmente colocando o cursor nessa seção e clicando no ícone Executar seção.
      NOTA: As etapas gerais para análise de dados estão descritas nesta seção. Instruções detalhadas são encontradas no código SiMPullMain.m que acompanha.
   2. Execute a seção "Inicialização" para definir o caminho para definir canais espectrais e tamanho da imagem.
   3. Execute a seção "Encontre ganho de câmera e deslocamento" para converter ganho de câmera em fótons usando os conjuntos de dados Gain and Background.
   4. Execute a seção "Registro de Canal" para calcular a transformação média ponderada local usada para registro de imagem.
   5. Formate e faça a curadoria dos dados. Execute a seção "Junte canais sequenciais em uma imagem quádrupla". Execute "Remova quadros ruins".
   6. Execute a seção "Ajuste moléculas simples e encontre moléculas sobrepostas".
      NOTA: Esta seção executa múltiplas funções para localização de moléculas únicas em cada canal e determina eventos de colocalização entre canais espectrais.
   7. Para determinar a contagem mínima de fótons por ajuste GFP verdadeiro, execute o "Optimize Minimum Photon Threshold". Este é um processo iterativo.
      1. Primeiro, coloque a SMF. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] e executar a seção. Selecione arquivos "Dados em branco" quando solicitado. Repita com os arquivos "CHO-EGFR-GFP".
      2. Selecione um valor mínimo de limite apropriado comparando os dois histogramas. Definir smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] e executar a seção novamente.
   8. Execute a seção "Porcentagem de cálculo do GFP se encaixa positivo para sinal FR" para corrigir as localizações de fundo e calcular os valores finais.
   9. Execute a Opção 1 (etapa 6.2.10) ou a Opção 2 (etapa 6.2.11) conforme necessidade experimental.
   10. Opção 1: Corrija o número de receptores disponíveis na membrana plasmática para ligação de ligas, conforme descrito na Referência¹⁵.
       1. Primeiro, rotular receptores de superfície com níveis saturados de corante NHS Ester fluorescente (NHS-AF647, ver Tabela de Materiais). Em seguida, realize um experimento de SiMPull para determinar a porcentagem de localização do GFP que se colocalize com AF647.
          NOTA: Isso fornece uma estimativa da fração de receptores disponíveis para rotulagem do NHS e a razão de receptores na superfície (RS).
       2. Aplique a correção de RS no cálculo final: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, onde o NGFP é o número corrigido de localizações de GFP, NBG é o número de localização em segundo plano, e NLOC é localizações totais.
          NOTA: No presente exemplo, essa correção não é aplicada porque Pervanadate é permeável à membrana¹⁶ e, portanto, a ação da inibição da fosfatase não se limita aos receptores superficiais.
   11. Opção 2: Para medições de fosforilação multisite, considere o potencial de obstáculo estérico quando dois anticorpos são usados.
       NOTA: O empecilho estérico pode causar uma redução no percentual observado de receptores fosforilalatados para anticorpo 1 quando na presença de Anticorpo 2 (P12), em comparação com o anticorpo 1 sozinho (P1).
       1. Use o SiMPull para determinar P1 e P12 e calcular o fator de correção para impedimento estérico, seguindo a referência¹⁵ publicada anteriormente.

Resultados

Um desenho animado retratando o processo SiMPull é mostrado na Figura 1A. As manchas são funcionalizadas usando NeutrAvidin como uma âncora para anticorpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisatos totais de proteínas. Após a lavagem da proteína não ligada, os receptores fosforilalatados são rotulados com um anticorpo anti-fosfotyrosina (anti-PY)¹⁵. A Figura 1B mostra uma imagem da matriz hidrofóbica, onde várias ...

Discussão

O protocolo descrito aqui foi otimizado para permitir medições quantitativas de fosforilação receptora no nível único da proteína. Várias modificações simples, mas importantes no protocolo SiMPull foram desenvolvidas que melhoraram a confiabilidade da medição para detecção de fosfo-tyrosina, incluindo redução da autofluorescência com tratamento NaBH₄ e pós-fixação da amostra para evitar a dissociação de anticorpos. O uso da máscara de canal verde para identificar os locais do receptor pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	MTC Bio	C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl			T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish	CELLTREAT	229620	Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous
50 mL conical tube			Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl			Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish	Corning	430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16020	Hazardous
Acetone (C3H6O)	Millipore Sigma	270725	Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin	Leinco Technologies, Inc	E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biotechnology	sc-7020 AF647
Bath-sonicator	Branson	1200
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23227
Biotin-PEG	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin	Gold Biotechnology	A-420-1	Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)	Millipore Sigma	C4901	Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper	Bioworld	30900017-1
Conical Filtering Flask	Fisher Scientific	S15464
Coplin Jar	WHEATON	900470
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5	Electron Microscopy Sciences	63793
DipImage			https://diplib.org/
DMEM	Caisson Labs	DML19-500
emCCD camera	Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima	Bio-Techne	S12450H	Heat Inactivated
Fusion 360 software	Autodesk
Geneticin G418 Disulfate	Caisson Labs	G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)	JT Baker	JTB-9526-01	Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)	Millipore Sigma	D9434	Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78446	Lysis Buffer Component
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)	VWR	BDH7204-1	Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)		HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)	EMD Millipore	HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)	Sigma Aldrich	I8896	Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000
Immersol 518F immersion oil	Zeiss	444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)	MPBio	2191421	Tyrode's Buffer Component
Matlab	Mathworks		Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)	IBIS Scientific	MX0486-1	Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits	Biotium	92245	Suggested conjugation kit
mPEG	Laysan Bio	mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane	UCT United Chemical	A0700	Hazardous
Nanogrid	Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein	Thermo Fisher Scientific	31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA			Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope	Olympus
Parafilm M Sealing Film	The Lab Depot	HS234526C
PBS pH 7.4	Caisson Labs	PBL06
PC-200 Analog Hot Plate	Corning	6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb	Cell Signaling Technology	2236BF
Potassium Chloride (KCl)	Millipore Sigma	529552	Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)	Millipore Sigma	1050330500	Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter	Raise 3D	PMS:2035U/RAL:3028	Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer	Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles	Corning	1395-100	CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter	Photometrics	Model QV2
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides	VWR	10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)	Semrock	LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package			https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	S6014	Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)	Millipore Sigma	452874	Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)	Millipore Sigma	S9625	Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide	VWR	BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Millipore Sigma	S6508	Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)	Millipore Sigma	258105	Hazardous
TetraSpeck Microspheres	Thermo Fisher Scientific	T7279	multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base	Millipore Sigma	T1503
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific	25300120