JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает пробоподготовку и анализ данных для количественной оценки фосфорилирования белка с использованием улучшенного анализа вытягивания одной молекулы (SiMPull).

Аннотация

Фосфорилирование является необходимой посттрансляционной модификацией, которая регулирует функцию белка и направляет результаты передачи сигналов клетками. Современные методы измерения фосфорилирования белка не могут сохранить гетерогенность фосфорилирования в отдельных белках. Анализ одномолекулярного вытягивания (SiMPull) был разработан для исследования состава макромолекулярных комплексов путем иммунопреципитации белков на стеклянном покровном листе с последующей одномолекулярной визуализацией. Современный метод представляет собой адаптацию SiMPull, которая обеспечивает надежную количественную оценку состояния фосфорилирования полноразмерных мембранных рецепторов на уровне одной молекулы. Визуализация тысяч отдельных рецепторов таким образом позволяет количественно оценить паттерны фосфорилирования белка. Настоящий протокол детализирует оптимизированную процедуру SiMPull, от подготовки образца до визуализации. Оптимизация препаратов стекла и протоколов фиксации антител еще больше повышает качество данных. Текущий протокол предоставляет код для анализа одномолекулярных данных, который вычисляет фракцию рецепторов, фосфорилированных в образце. Хотя эта работа фокусируется на фосфорилировании рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), протокол может быть обобщен на другие мембранные рецепторы и цитозольные сигнальные молекулы.

Введение

Мембранно-ассоциированная сигнализация настраивается комбинацией активации мембранных рецепторов, индуцированной лигандами, и рекрутирования последующих вспомогательных белков, которые распространяют сигнал. Фосфорилирование ключевых тирозинов в рецепторных цитоплазматических хвостах имеет решающее значение для инициирования образования сигнальных комплексов, или сигналосом 1,2. Поэтому важным вопросом в биологии является то, как создаются и поддерживаются паттерны фосфорилирования для привлечения сигнальных партнеров и диктовки клеточных результатов. Это включает в себя понимание гетерогенности фосфорилирования рецепторов, как в изобилии, так и в специфических паттернах фосфотирозина, которые могут обеспечить средство манипулирования сигнальными выходами путем диктовки составасигналосомы 3,4,5,6,7. Тем не менее, существуют ограничения в современных методах опроса фосфорилирования белка. Западный блот-анализ отлично подходит для описания тенденций фосфорилирования белка, но является полуколичественным8 и не дает информации о неоднородности системы, потому что тысячи и миллионы рецепторов усредняются вместе. В то время как западные пятна позволяют исследовать образец с использованием фосфоспецифических антител к специфическим тирозинам, они не могут предоставить информацию о многосайтовых моделях фосфорилирования в пределах одного белка. Количественная фосфопротеомика сообщает об изобилии фосфотирозина, но существуют ограничения на обнаружение многосайтового фосфорилирования, поскольку интересующие остатки должны быть расположены в пределах того же пептида (обычно 7-35 аминокислот), который генерируется ферментативным сбраживанием 9,10,11.

Чтобы преодолеть ограничения, упомянутые выше, анализ одномолекулярного вытягивания (SiMPull) был адаптирован для количественной оценки состояний фосфорилирования интактных рецепторов на уровне одной молекулы. SiMPull был впервые продемонстрирован в качестве мощного инструмента для опроса макромолекулярных комплексов Jain et al.12,13. В SiMPull макромолекулярные комплексы были иммунопреципитированы (IP) на стеклянных покровах, функционализированных антителами, а затем проанализированы с помощью одномолекулярной микроскопии для определения числа субъединиц белка и co-IP со сложными компонентами12. Модификация Kim et al.14, получившая название SiMBlot, была первой, которая использовала вариацию SiMPull для анализа фосфорилирования денатурированных белков. Протокол SiMBlot основан на захвате биотинилированных белков клеточной поверхности с использованием покрытых NeutrAvidin покровных пластинок, которые затем исследуются на предмет фосфорилирования с маркировкой фосфоспецифических антител14. Несмотря на эти достижения, необходимы улучшения, чтобы сделать количественную оценку посттрансляционной модификации более надежной и применимой к более широкому спектру белков.

Настоящий протокол описывает оптимизированный подход SiMPull, который использовался для количественной оценки паттернов фосфорилирования интактного рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в ответ на ряд лигандных состояний и онкогенных мутаций15. Хотя эта работа сосредоточена на EGFR, этот подход может быть применен к любому мембранному рецептору и представляющим интерес цитозольным белкам (POI), для которых доступны качественные антитела. Протокол включает в себя шаги по снижению автофлуоресценции образца, конструкцию массива образцов, которая требует минимального объема образца с одновременной подготовкой до 20 образцов, а также оптимизацию условий маркировки и фиксации антител. Разработаны алгоритмы анализа данных для обнаружения одной молекулы и количественной оценки фосфорилированных белков.

протокол

1. Подготовка чехла

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага необходимо надеть средства индивидуальной защиты (СИЗ), которые включают в себя двойной слой нитриловых перчаток, защитные очки или лицевой щиток, а также лабораторный халат.

  1. Выполните травление пираньи, чтобы удалить органический мусор из стекла.
    ВНИМАНИЕ: Раствор пираньи является сильным окислителем, который является коррозионным и высокореакционноспособным при контакте с органическими материалами. Реакция с органическим мусором является экзотермической и потенциально взрывоопасной. Таким образом, процедура должна выполняться в химическом вытяжном шкафу с опущенной створкой. Стеклянная посуда Pyrex необходима для обработки раствора пираньи.
    1. Подготовьте рабочее пространство внутри химического вытяжного шкафа. Расположите крышки без перекрытия в нижней части 4-литрового стеклянного стакана, «реакционного» стакана, и поместите реакционный стакан на конфорку с мягким нагревом. Дайте стеклянной посуде нагреться в течение 10 минут. Поместите «отработанный» стеклянный стакан объемом 1 л с 500 мл ddH2O проксимально к реакционному стакану.
    2. Медленно добавляйте 49 мл 12 N серной кислоты (H2SO4) в реакционный стакан со стеклянной серологической пипеткой. Промыть пипетку в стакане для отходов перед утилизацией.
    3. Добавьте 21 мл 30% перекиси водорода (H2O2) по каплям со стеклянной серологической пипеткой в реакционный стакан. Медленно распределите каплиH2O2 равномерно по дну реакционной колбы, чтобы предотвратить локализованное закаливание реакции травления пираний. Промыть пипетку в стакане для отходов перед утилизацией.
      ВНИМАНИЕ: Всегда добавляйте H2O2 в H2SO4, и никогда наоборот.
    4. Пираньи травят крышки в течение 30 минут. Осторожно перемешивайте содержимое реакционного стакана каждые 5 мин.
    5. Погасите раствор пираньи, вылив содержимое отработанного стакана в реакционный стакан. Медленно перенесите жидкость вниз по стенке реакционного стакана, чтобы свести к минимуму брызги. Снимите реакционный стакан с конфорки.
    6. Когда реакцию закалят и охладят, вылейте раствор пираньи обратно в стакан для отходов для нейтрализации, не снимая травленые крышки из реакционного стакана.
    7. Нейтрализуют раствор пираньи с постепенным добавлением слабого основания. Например, используют чрезмерную массу 20 г бикарбоната натрия (NaHCO3)/100 мл раствора пираньи.
      ВНИМАНИЕ: Не храните растворы пираньи в герметичных контейнерах для отходов. Раствор всегда должен быть нейтрализован перед утилизацией. Реакция нейтрализации производит энергичные пузырьки и может быть взрывоопасной, если не контролироваться постепенным добавлением слабого основания.
    8. Нейтрализованный раствор перемешайте стеклянным стержнем и дайте ему вступить в реакцию в течение 2 ч. Поднимите рН до >4 и утилизируйте раствор.
    9. Между добавлением слабого основания к раствору пираньи перекладывают травленые крышки из реакционного стакана в воронку Бюхнера со стеклянным стержнем перемешивания и промывают в течение 5 мин в процессе ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно переходите к следующему шагу или храните травленые крышки пираньи до 2 недель в ddH2Oв запечатанной стеклянной банке или чашке Петри (оберните герметизирующей пленкой, см. Таблицу материалов).
  2. Обтекайте крышки органическими растворителями ультразвуком, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Поместите крышки в стеклянную банку Коплина (см. Таблицу материалов) и накройте метанолом (CH3OH). Закройте крышку банки герметизирующей пленкой и на 10 мин. Осторожно вылейте метанол из банки Коплина в стеклянную бутылку для хранения.
    2. Наполните банку Коплина ацетоном (C3H6O), закройте крышку и втирайте ультразвуком в течение 10 минут. Осторожно вылейте ацетон из банки Коплина в стеклянную бутылку для хранения.
      ВНИМАНИЕ: Метанол легковоспламеняется и остро токсичен. Используйте в химическом вытяжном шкафу. Ацетон является легковоспламеняющимся и раздражителем. Поэтому обрабатывайте и храните его в стекле, а также используйте его в химическом вытяжном шкафу. Утилизировать как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол и ацетон могут быть повторно использованы до пяти раз каждый.
  3. Активируйте поверхность крышки для функционализации силана.
    1. Ванна-ультразвук с 1 М гидроксида калия (KOH) в течение 20 мин. Осторожно вылейте KOH из банки Coplin в коническую трубку объемом 50 мл для повторного использования.
      ВНИМАНИЕ: KOH является коррозионным и раздражающим фактором. Используйте в химическом вытяжном шкафу и не храните в стекле. Храните его в полипропиленовых тубах. Утилизировать как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: KOH можно повторно использовать до пяти раз.
    2. Дважды промойте ddH2O. Стейте ddH2O с облицовочных пластинок, а затем нагрейте каждый покров, размахивая пламенем горелки Бунзена, чтобы отогнать всю поверхностную влагу. Поместите крышки в сухую банку Coplin.
  4. Выполняют аминосиланизацию покрова.
    1. Готовят раствор аминосилана, смешивая 69,4 мл метанола с 3,6 мл уксусной кислоты (CH3COOH) в конической колбе. Добавьте 720 мкл N-(2-аминоэтил)-3-аминопропилтриметоксисилана (аминосилана) и хорошо перемешайте (см. Таблицу материалов).
      ВНИМАНИЕ: Уксусная кислота является легковоспламеняющейся и коррозионной. Обработайте стеклянными пипетками и храните в стекле. Работа с уксусной кислотой в химическом вытяжном шкафу. Аминосилан является остротоксичной опасностью для вдыхания, сенсибилизатором и раздражителем. Вреден для водной флоры и фауны. Используйте в химическом вытяжном шкафу. Утилизируйте химические вещества как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аминосилан является светочувствительным и быстро гидролизуется в воде. Все этапы с этим реагентом должны выполняться в условиях минимальной освещенности, чтобы сохранить активность. Продувите баллон газообразным азотом и нанесите уплотнительную пленку перед хранением в темном осушителе. Заменяйте каждые 6-9 месяцев.
    2. Немедленно добавьте раствор аминосилана в банку Коплина. Накройте крышкой и нанесите уплотнительную пленку, продолжая защищать от света.
    3. Инкубировать покровы в растворе аминосилана в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре (RT). Ванно-ультразвуком в течение 1 мин, а затем инкубировать еще 10 мин. Осторожно вылейте раствор аминосилана в контейнер для отходов, предназначенный для CH3OH со следами аминосилана и CH3COOH.
    4. Промойте крышки метанолом и вылейте раствор в контейнер для отходов, предназначенный для метанола.
    5. Промойте крышки три раза в течение 2 мин каждый с ddH2O. Слейте крышки, смойте лишнюю влагу и полностью высушите на воздухе в течение 10 минут.
  5. Выполните подготовку массива/функционализацию покрытий биотин-ПЭГ.
    1. Готовят 1 М NaHCO3 (рН 8,5) рабочего материала, растворяя 84,5 мг NaHCO3 в 1 мл ddH2O. Для получения конечной концентрации 10 мМ NaHCO3 разбавляют 1 М NaHCO3 в ddH2O(1:100).
    2. Нарисуйте массив сетки на сухих аминосиланизированных покровных листах гидрофобным барьерным пером (см. Таблицу материалов) и дождитесь высыхания чернил. Запишите идентификатор на обложке, чтобы отметить правильную ориентацию. Поместите крышки в увлажненную камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Массив должен состоять из 16-20 квадратов, размером примерно 4 мм х 4 мм.
    3. Чтобы получить раствор биотина-ПЭГ сукцинимидила валерата (биотин-ПЭГ)/mPEG сукцинимидил валерат (mPEG), сначала удалите mPEG и биотин-PEG (см. Таблицу материалов) из морозильной камеры и уравновесьте до RT. Добавьте 153 мг mPEG и 3,9 мг биотина-PEG (~1:39 биотин-PEG:mPEG) в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и повторно суспендируйте в 609 мкл 10 мМ NaHCO3 путем бережного пипетирования. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин при РТ для удаления пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Период полураспада сукцинимидила валерата в буфере рН 8,5 составляет ~30 мин. После добавления буфера в mPEG выполните следующие действия как можно быстрее. Этот шаг имеет решающее значение.
    4. Применяют раствор биотин-ПЭГ/мПЕГ, чтобы полностью покрыть каждый квадрат в покровных массивах, обычно 10-15 мкл на квадрат. Не позволяйте жидкости переполнять определенное пространство. Храните крышки в камере влажности в темноте в течение 3-4 ч при РТ.
    5. Промойте крышки обильным количеством воды, последовательно погружая их в стеклянные стаканы объемом 3x 250 мл, заполненные ddH2O на 10 с каждый.
    6. Отгоните всю влагу из обшивки газообразным азотом. Храните крышки спиной к спине в заполненной азотом конической трубке объемом 50 мл, обернутой уплотнительной пленкой при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно перейдите к шагу 2 или храните крышки при температуре -20 °C в течение 1 недели перед использованием.

2. Приготовление лизата SiMPull

ВНИМАНИЕ: Необходимыми СИЗ для остальных этапов протокола являются нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторные халаты.

ПРИМЕЧАНИЕ: Лизаты получали из адгезивных CHO-клеток, экспрессирующих EGFR-GFP. Клетки покрывали в 60-миллиметровой чашке для культуры тканей (TC60) в течение12,13. Клетки CHO культивировали в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 500 нг/мл генетикина (см. Таблицу материалов). Также могут использоваться другие адгезивные клеточные линии или суспензионные ячейки.

  1. Разбейте ячейки, выполнив следующие действия.
    1. Посуду для культивирования (содержащую клетки) вымыть 1 мл 1x PBS. Добавьте 1 мл 1x трипсина и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C для отделения клеток. С помощью пипетки перенесите отсоединенные ячейки из чашки в центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    2. Взять 10 мкл трипана синего и смешать с 10 мкл клеточной суспензии в отдельной центрифужной трубке. Подсчитывайте ячейки с помощью 10 мкл клеточной смеси в автоматическом счетчике ячеек, согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
    3. Пластина 8 х 105 клеток на ночь в чашке Петри TC60. Накройте по одному блюду для каждого условия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования клетки либо не лечили, либо обрабатывали перванадатом и EGF, как описано на этапе 2.4.1.
  2. Подготовьте следующие растворы для приготовления клеточного лизата.
    1. Приготовьте ледяной 1x PBS (pH 7,4).
    2. Готовят лизисный буфер, раствор 1% неионного, недегенеративного детергента (см. Таблицу материалов) в 50 мМ Tris-HCl (рН 7,2) и 150 мМ NaCl с добавлением ингибитора протеазы/фосфатазы (PPI) (1:100 из запаса). Поместите пробирку на нутатор и дайте буферу перемешаться в течение 15 мин. Выдержать приготовленный раствор на льду.
    3. Подготовьте буфер тирода к конечной концентрации 135 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 0,4 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 10 мМ HEPES (рН 7,2), 20 мМ глюкозы и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (см. Таблицу материалов). Нагреть раствор до 37 °C.
  3. Подготовьте положительный контроль для фосфорилирования – 1 мМ перванадата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Первандат является перокисленной формой ванадата - ингибитора белка тирозинфосфатаз16. Предотвращение дефосфорилирования белка путем ингибирования активности фосфатазы приводит к получению высокофосфорилированного образца.
    1. Подготовьте 200 мМ активированного ортованадата натрия (Na3VO4).
      1. Для приготовления 100 мл раствора добавляют 3,89 г Na3VO4 (см. Таблицу материалов) до 90 мл ddH2Oи растворяют при перемешивании. Отрегулируйте pH до 10, добавив HCl или NaOH по каплям. Добавление HCl сделает раствор желтым.
      2. Доведите объем до 100 мл с ddH2O. Отварите раствор, нагрев его в микроволновой печи. После кипячения раствор будет бесцветным.
      3. Охладите раствор до RT и отрегулируйте рН до 10. Повторите кипячение, охлаждение и регулировку pH еще два-четыре раза, пока рН не стабилизируется на уровне 10. Аликвотировать и хранить при -20 °C.
    2. Готовят запас 30 мМ перванадата (ПВ) путем смешивания 20,4 мкл 3%H2O2 со 100 мкл 200 мМ Na3VO4 и 546,8 мкл ddH2O(эквимолярные концентрацииH2O2и активированныеNa3VO4). Инкубировать в темноте при RT в течение 15 мин.
    3. Подготовьте 1 мМ PV в буфере Tyrode. Для раствора 10 мл добавьте 0,33 мл фотоэлектрического материала 30 мМ к 9,67 мл буфера Tyrode 37 °C. Немедленно обработайте клетки.
    4. Промывайте ячейки один раз 3 мл буфера Tyrode. Добавьте 3 мл 1 мМ PV в буфер Тирода к клеткам и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C.
  4. Выполните стимуляцию лиганда.
    1. Стимулируйте клетки интересующим лигандом, используя соответствующую концентрацию, время и температуру. Для максимальной стимуляции EGFR инкубируют с 1 мл эпидермального фактора роста 50 нМ (EGF, см. Таблицу материалов) + 1 мМ PV в буфере Tyrode в течение 5 мин при 37 °C.
  5. Выполняют лизис клеток.
    1. После желаемой клеточной обработки поместите блюдо на лед и вымойте ледяным 1x PBS. Полностью удалите весь объем PBS с помощью пипетки.
    2. Добавьте на пластину 180 мкл лизисного буфера (этап 2.2.2). Используйте скребок для ячеек, чтобы потянуть буфер вокруг пластины, чтобы полностью покрыть ячейки. Нанесите твердое, постоянное давление с помощью клеточного скребка по всей культивируемой поверхности, чтобы полностью лизировать клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем лизисного буфера должен быть сведен к минимуму для обеспечения высокой концентрации белка.
    3. Пипетка лизированных клеток и перенос их в трубку объемом 1,5 мл. Держите трубку на льду в течение 30 минут. Вихрь лизатов каждые 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если POI состоит из нескольких субъединиц или чувствителен к диссоциации, не вихряйте лизаты.
    4. Центрифугируйте лизированные ячейки при 16 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую трубку объемом 1,5 мл с помощью пипетки. Он содержит общий белок лизат.
    5. Зарезервировать 10 мкл лизата и разбавить его в 90 мкл лизисного буфера для анализа бицинхониновой колориметрической пробы (БЦА)17. Хранить оставшийся общий лизат белка при -80 °C.
    6. Определение общей концентрации лизата белка с помощью анализа BCA (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общие белковые лизаты могут быть приготовлены в день эксперимента и использованы в свежем виде или хранятся в виде одноразовых аликвот при -80 °C в течение 12 недель. Не замораживать/не оттаивать.

3. Функционализация массива биотинилированным антителом

  1. Подготовьте следующие решения.
    1. T50 Buffer, раствор 10 мМ Tris-HCl (рН 8,0) и 50 мМ NaCl. Раствор стабилен в течение 1 месяца при РТ.
    2. T50-BSA путем дополнения буфера T50 0,1 мг/мл BSA. Выдержать приготовленный раствор на льду.
    3. 10 мг/мл боргидрида натрия (NaBH4) в 1x PBS. Подготовьте его непосредственно перед использованием.
    4. 0,2 мг/мл НейтрАвидина (см. Таблицу материалов) в буфере Т50.
      ВНИМАНИЕ: NaBH4 является восстановителем и легковоспламеняющимся. Всегда продувайте контейнер газообразным азотом после использования и храните его в осушителе.
  2. Функционализируйте массив биотинилированным антителом.
    1. Извлеките функционализированные массивы ПЭГ-биотина из морозильной камеры и уравновешивайте коническую трубку до RT перед открытием. Поместите крышку с массивом, ориентированным вверх, на уплотнительную пленку, выстланную 100 мм тканевой культуры (TC100).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизируйте верхнее освещение. Все растворы должны «подниматься» на квадратах, определенных гидрофобным массивом. Добавьте соответствующий объем раствора, чтобы полностью покрыть каждый квадрат (обычно 10-15 мкл) и не позволяйте жидкости переполнять определенное пространство. Для быстрого удаления жидкостей используйте собственную вакуумную линию, прикрепленную к вакуумной колбе, для улавливания отходов. Дайте NaBH4 дегазировать в течение 1 ч перед утилизацией, оставив трубку открытой в химическом вытяжном шкафу. Лечение NaBH4 необходимо для снижения фоновой автофлуоресценции, тем самым уменьшая ложноположительные обнаружения одиночных молекул.
    2. Обработайте каждый квадрат массива 10 мг/мл NaBH4 в 1x PBS в течение 4 мин при RT. Промыть три раза PBS.
    3. Инкубировать каждый квадрат в течение 5 мин с 0,2 мг/мл НейтрАвидина в Т50. Промыть три раза с T50-BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: НейтрАвидин связывается с ПЭГ-биотином и обеспечивает сайт связывания биотинилированных антител 12,13,15.
    4. Инкубировать каждый квадрат в течение 10 мин с 2 мкг/мл биотинилированного POI-специфического антитела в T50-BSA; трижды промыть T50-BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол использует биотинилированный анти-EGFR IgG (см. Таблицу материалов) для захвата EGFR-GFP.

4. SiMPull POI из цельноклеточных лизатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите блюдо TC100 из функционализированных массивов SiMPull на лед на оставшуюся часть приготовления SiMPull. Этот шаг представляет собой извлечение POI из общего лизата белка. Лизат не должен использоваться повторно после размораживания.

  1. Подготовьте следующие решения.
    1. Приготовьте 4% параформальдегида (PFA) / 0,1% глутаральдегида (GA) в 1x PBS.
      ВНИМАНИЕ: PFA и GA являются токсичными химическими фиксаторами и потенциальными канцерогенами. Носите СИЗ. Утилизируйте химические вещества как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
    2. Готовят 10 мМ Tris-HCl, рН 7,4.
  2. Разморозьте и перемешайте лизат, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Держитесь на льду.
  3. Развести 1 мкл лизата в 100 мкл ледяного T50-BSA/PPI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости определите соответствующий коэффициент разбавления общего лизата белка, применив к массиву ряд разбавлений. Оптимальная плотность рецепторов SiMPull на площадь массива составляет 0,04-0,08/мкм2. Разбавления лизата могут быть оценены на этапе 6 (Анализ данных).
  4. Инкубировать лизат на массиве в течение 10 мин; затем четыре раза промыть ледяным T50-BSA/PPI.
  5. Разбавляют AF647-конъюгированное антифосфотирозиновое антитело (см. Таблицу материалов) в ледяном T50-BSA/PPI и инкубируют на массиве в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе пан-анти-pTyr (PY99)-AF647 IgG используется для идентификации фосфорилированной популяции EGFR-GFP. Использование непосредственно меченых антител устраняет необходимость во вторичных антителах, увеличивая варианты маркировки и улучшая согласованность результатов. Флуоресцентно меченые антитела могут быть получены из коммерческих источников. Если антитела не являются коммерчески доступными, они могут быть индивидуально маркированы с использованием стандартных методов биоконъюгации, и доступны коммерческие наборы биоконъюгации. Каждая партия флуоресцентно меченых антител должна быть проверена на оптимальные условия маркировки путем выполнения SiMPull для измерения кривой дозы и нахождения точки насыщения.
  6. Промыть шесть раз ледяным T50-BSA в общей сложности 6-8 мин.
  7. Дважды промыть ледяным 1x PBS.
  8. Инкубируйте массив с 4% раствором PFA/0,1% GA в течение 10 мин для предотвращения диссоциации антител.
  9. Промывайте дважды в течение 5 мин каждый с 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4 / PBS для инактивации фиксаторов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с использованием более чем одного антитела (например, обнаружение нескольких участков фосфотирозина) повторите шаги 4.5-4.9. Информацию об определении стерического препятствия между двумя антителами см. на этапе 6.2.9.

5. Получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение одномолекулярного изображения осуществляется с использованием объектива 150x TIRF и разветвителя изображения, который захватывает каждый спектральный канал в определенном квадранте камеры emCCD (см. Таблицу материалов). Калибровочные изображения сначала получаются для регистрации каналов и калибровки усиления камеры с помощью наноструктурированной сетки выравнивания каналов (наносетки), которая содержит 20 x 20 массивов по 200 ± 50 нм отверстий на внутриотрезном расстоянии 3 ± 1 мкм (общий размер ~ 60 мкм × 60 мкм).

  1. Выполните регистрацию канала, выполнив следующие действия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точная регистрация каналов необходима для правильного расчета колокализации излучателей. Этот шаг имеет решающее значение.
    1. Очистите цель масла и нанесите каплю нефти на цель. Поместите наносеть на сцену для визуализации. Используя передаваемый белый свет, сосредоточьтесь на рисунке сетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения с наносетью получаются с использованием проходящего света, который проходит через наносетку и обнаруживается во всех спектральных каналах. В качестве альтернативы можно использовать мультифлуоресцентные шарики, которые излучают флуоресценцию, обнаруженную в каждом канале. Сбор изображений должен быть оптимизирован в соответствии с настройкой каждого микроскопа.
    2. Получите серию из 20 изображений сетки. Убедитесь, что пиксели не насыщены. Сохраните серию изображений как «Fiducial».
    3. Расфокусируйте наносеть, чтобы создать рисунокAiry 18. Получите серию из 20 изображений для калибровки усиления. Сохраните изображение как "Gain".
    4. Получите серию из 20 изображений для смещения камеры, блокируя весь свет от попадания на камеру. Сохраните изображение как «Фон».
  2. Получение изображений SiMPull.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед созданием изображения массива coverslip замените решение Tris на T50-BSA и уравновесьте массив до RT.
    1. Очистите цель масла и нанесите дополнительное масло на цель. Закрепите массив чехла на ступени микроскопа.
    2. Оптимизируйте мощность возбуждения каждого флуорофора, угол TIRF и время интеграции камеры. Цель состоит в том, чтобы достичь наивысшего уровня сигнал-шум при минимизации фотоотбеливания образца. Запишите мощность лазера для согласованности в будущих измерениях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовалось время экспозиции 300 мс для дальнего красного канала и 1 с для зеленого канала. Лазер 642 нм использовался при мощности лазера примерно 500 мкВт, в то время как лазер 488 нм использовался при 860 мкВт, измеренной перед ламповой линзой.
    3. Получение изображений для каждого образца. Сначала изобразите дальний красный канал, а затем каждый флуорофор с более низкой длиной волны, чтобы уменьшить фотоотбеливание. Из-за небольшого объема, используемого для каждого образца, проверяйте уровень буфера каждые 30-45 минут и пополняйте по мере необходимости.

6. Анализ данных

  1. Загрузите демо-коды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный демонстрационный код и примеры наборов данных демонстрируют полный рабочий процесс анализа данных (Дополнительные файлы кодирования 1-4). Системные требования, перечисленные в SiMPullMain.m, приведены в файле дополнительного кодирования 1.
    1. Распакуйте и сохраните в личный каталог Документы/MATLAB (MacOS/Linux) или Документы\MATLAB (Windows).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это создает четыре новые папки: SiMPull_class, smite, Образцы данных, Выходные данные анализа образцов.
    2. Откройте файл "ReadMe_Setup.txt", найденный в папке SiMPull_class.
    3. Установите наборы инструментов MATLAB и MATLAB: набор инструментов для подгонки кривых, набор инструментов для параллельных вычислений и набор инструментов для статистики и машинного обучения.
    4. Установите DipImage19 в соответствии с инструкциями по загрузке.
    5. Установите пакет анализа одной молекулы "smite", как описано в ReadMe_setup.txt.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "smite" доступен в репозитории GitHub (см. Таблицу материалов).
    6. Откройте файл SiMPullMain.m, найденный в SiMPull_class папке, перетащив файл в окно MATLAB.
    7. Измените каталог на ...\MATLAB\Sample Data\, щелкнув значок Обзор папки и выбрав папку.
  2. Обзор этапов обработки данных
    1. Запустите SiMPullMain.m - следуя инструкциям для каждого раздела. Выполните каждый раздел по отдельности, поместив курсор в этот раздел и щелкнув значок Выполнить раздел.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общие шаги по анализу данных описаны в этом разделе. Подробные инструкции приведены в сопроводительном коде SiMPullMain.m.
    2. Запустите раздел «Инициализация», чтобы задать путь для определения спектральных каналов и размера изображения.
    3. Запустите раздел «Найти усиление и смещение камеры», чтобы преобразовать усиление камеры в фотоны с помощью наборов данных «Усиление» и «Фон».
    4. Запустите раздел «Регистрация каналов», чтобы рассчитать локально взвешенное среднее преобразование, используемое для регистрации изображений.
    5. Форматирование и курирование данных. Запустите раздел «Объединение последовательных каналов в четырехобразное изображение». Запустите "Удалить плохие кадры".
    6. Запустите раздел «Подгонка отдельных молекул и поиск перекрывающихся молекул».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел выполняет несколько функций для локализации отдельных молекул в каждом канале и определения событий колокализации между спектральными каналами.
    7. Чтобы определить минимальное количество фотонов на истинное соответствие GFP, выполните команду «Оптимизировать минимальное пороговое значение фотона». Это итеративный процесс.
      1. Во-первых, установите smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] и запустите раздел. Выберите «Пустые файлы данных» при появлении запроса. Повторите с файлами "CHO-EGFR-GFP".
      2. Выберите соответствующее минимальное пороговое значение, сравнив две гистограммы. Установить smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] и снова запустите раздел.
    8. Запустите раздел «Рассчитать процент GFP, подходящего для положительного значения для сигнала FR», чтобы исправить фоновые локализации и вычислить конечные значения.
    9. Выполните вариант 1 (шаг 6.2.10) или вариант 2 (шаг 6.2.11) в соответствии с экспериментальной необходимостью.
    10. Вариант 1: Правильно для количества рецепторов, доступных в плазматической мембране для связывания лигандов, как описано в ссылке15.
      1. Во-первых, маркируют поверхностные рецепторы насыщенными уровнями флуоресцентного красителя NHS Ester (NHS-AF647, см. Таблицу материалов). Затем выполните эксперимент SiMPull, чтобы определить процент локализации GFP, который колокализуется с AF647.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это дает оценку доли рецепторов, доступных для маркировки NHS, и соотношения рецепторов на поверхности (SR).
      2. Примените поправку SR в конечном расчете: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, где NGFP - скорректированное число локализаций GFP, NBG - номер фоновой локализации, а NLOC - общие локализации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем примере эта коррекция не применяется, поскольку перванадат является мембранопроницаемым16 и, следовательно, действие ингибирования фосфатазы не ограничивается поверхностными рецепторами.
    11. Вариант 2: Для многосайтовых измерений фосфорилирования рассмотрите возможность стерического препятствия при использовании двух антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерическое препятствие может вызвать снижение наблюдаемого процента фосфорилированных рецепторов для антитела 1 в присутствии антитела 2 (P12) по сравнению с одним только антителом 1 (P1).
      1. Используйте SiMPull для определения P1 и P12 и расчета поправочного коэффициента для стерического препятствия в соответствии с ранее опубликованной ссылкой15.

Результаты

Карикатура, изображающая процесс SiMPull, показана на рисунке 1A. Покровные листы функционализируются с использованием NeutrAvidin в качестве якоря для биотинилированных антител против EGFR для захвата EGFR-GFP из общих белковых лизатов. После вымывания несвязанного белка фосфорили?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для проведения количественных измерений фосфорилирования рецепторов на уровне одного белка. Было разработано несколько простых, но важных модификаций протокола SiMPull, которые повысили надежность измерения для обнаружения фосфо-тирозина, в?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения R35GM126934, R01AI153617 и R01CA248166 для DSL. EMB поддерживался в рамках программы ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) и JAR в рамках программы UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Мы с благодарностью отмечаем использование общего ресурса флуоресцентной микроскопии Комплексного онкологического центра Университета Нью-Мексико, поддерживаемого NIH P30CA118100. Мы хотим отметить докторов Анкура Джайна и Тхэкиджипа Ха, чья оригинальная разработка SiMPull вдохновила эту работу.
ES-C нынешний адрес: Группа иммунодинамики, Лаборатория интегративной иммунологии рака, Центр исследований рака, Национальный институт рака, Bethesda

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaClT50 Buffer
100 mm Tissue Culture dishCELLTREAT229620Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710Hazardous
50 mL conical tubeFunctionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaClLysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dishCorning430166
8% Glutaraldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16020Hazardous
Acetone (C3H6O)Millipore Sigma270725Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albuminGold BiotechnologyA-420-1Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
Cell ScraperBioworld30900017-1
Conical Filtering FlaskFisher ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Electron Microscopy Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
emCCD cameraAndor iXon
Fetal Bovine Serum, OptimaBio-TechneS12450HHeat Inactivated
Fusion 360 softwareAutodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)VWRBDH7204-1Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)Sigma AldrichI8896Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F immersion oilZeiss444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling KitsBiotium92245Suggested conjugation kit
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaneUCT United ChemicalA0700Hazardous
NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDALook for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MicroscopeOlympus
Parafilm M Sealing FilmThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Analog Hot PlateCorning6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAbCell Signaling Technology2236BF
Potassium Chloride (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)Millipore Sigma1050330500Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameterRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printerRaise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottlesCorning1395-100CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image SplitterPhotometricsModel QV2
Refrigerated centrifugeEppendorfEP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting SlidesVWR10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis packagehttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma AldrichS6014Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)Millipore SigmaS9625Activate by successive heat and pH cycling
Sodium HydroxideVWRBDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)Millipore SigmaS6508Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)Millipore Sigma258105Hazardous
TetraSpeck MicrospheresThermo Fisher ScientificT7279multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) baseMillipore SigmaT1503
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120

Ссылки

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены