JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإزالة التعصيب الودي الكلوي (RDN) في الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم الناجم عن تسريب الأنجيوتنسين الثاني. الإجراء قابل للتكرار ومريح ويسمح بدراسة الآليات التنظيمية ل RDN على ارتفاع ضغط الدم وتضخم القلب.

Abstract

تم إثبات فوائد إزالة التعصيب الودي الكلوي (RDN) على ضغط الدم في عدد كبير من التجارب السريرية في السنوات الأخيرة. ومع ذلك ، فإن الآلية التنظيمية ل RDN على ارتفاع ضغط الدم لا تزال بعيدة المنال. وبالتالي ، من الضروري إنشاء نموذج RDN أبسط في الفئران. في هذه الدراسة ، تم زرع مضخات صغيرة تناضحية مملوءة بالأنجيوتنسين II في فئران C57BL / 6 عمرها 14 أسبوعا. بعد أسبوع واحد من زرع المضخة التناضحية المصغرة ، تم إجراء RDN المعدل على الشرايين الكلوية الثنائية للفئران باستخدام الفينول. أعطيت الفئران المتطابقة مع العمر والجنس محلول ملحي وعملت كمجموعة صورية. تم قياس ضغط الدم عند خط الأساس وكل أسبوع بعد ذلك لمدة 21 يوما. بعد ذلك ، تم جمع الشريان الكلوي والشريان الأورطي البطني والقلب للفحص النسيجي باستخدام تلطيخ H&E و Masson. في هذه الدراسة ، نقدم نموذج RDN بسيطا وعمليا وقابلا للتكرار وموحدا ، والذي يمكنه التحكم في ارتفاع ضغط الدم وتخفيف تضخم القلب. يمكن لهذه التقنية أن تزيل الأعصاب الكلوية الطرفية دون تلف الشريان الكلوي. بالمقارنة مع النماذج السابقة ، يسهل RDN المعدل دراسة علم الأمراض والفيزيولوجيا المرضية لارتفاع ضغط الدم.

Introduction

ارتفاع ضغط الدم هو أحد أمراض القلب والأوعية الدموية المزمنة الرئيسية في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي ارتفاع ضغط الدم غير المنضبط إلى تلف الأعضاء المستهدفة والمساهمة في قصور القلب والسكتة الدماغية وأمراض الكلى المزمنة1،2،3. ارتفع معدل انتشار ارتفاع ضغط الدم من 20٪ إلى 31٪ بين عامي 1991 و 2007 في الصين. يمكن أن يتضاعف عدد البالغين المصابين بارتفاع ضغط الدم في الصين بعد مراجعة حديثة لمعايير تشخيص ارتفاع ضغط الدم (130/80 مم زئبق)4. يمكن السيطرة على ارتفاع ضغط الدم عن طريق الدواء ، ومع ذلك ، فإن ما يقرب من 20 ٪ من المرضى غير قادرين على السيطرة على ارتفاع ضغط الدم ، حتى عند تلقي ما لا يقل عن ثلاثة أدوية خافضة للضغط (بما في ذلك مدر للبول واحد) بأقصى جرعة يمكن تحملها ، مما قد يؤدي إلى تطوير ارتفاع ضغط الدم المقاوم للأدوية5.

ثبت أن إزالة التعصيب الودي الكلوي (RDN) هو علاج محتمل لارتفاع ضغط الدم. في عام 2009 ، أبلغ كروم وزملاؤه عن علاج ارتفاع ضغط الدم المقاوم باستخدام RDN لأول مرة. وقد وجد أن استئصال الشريان الكلوي عن طريق الجلد يمكن أن يسبب بشكل فعال انخفاض ضغط الدم المستمر في المرضى6. ومع ذلك ، فإن فشل تجربة ارتفاع ضغط الدم التماثلي 3 (HTN-3) أعاق تطبيق RDN7 ، مما حول RDN إلى علاج مثير للجدل. ومع ذلك ، لم يتم استبعاد احتمال RDN بعد. أكدت التجارب السريرية الحديثة ، بما في ذلك RADIANCE-HTN SOLO ، SPYRAL HTN-OFF MED / ON MED ، و SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal فعالية RDN على ارتفاع ضغط الدم8،9،10،11،12. وبالتالي ، يجب إجراء بحث ميكانيكي أكثر تفصيلا لاستكشاف تأثيرات RDN.

الغرض العام من هذه الدراسة هو توضيح كيف يمكن تعديل RDN في الفئران لإنتاج جراحة أبسط وأكثر استقرارا. درس عدد كبير من التجارب طرقا مختلفة ل RDN ، مثل الاستئصال بالتبريد داخل الأوعية ، والموجات فوق الصوتية خارج الجسم والتطبيق المحلي لمادة كيميائية أو سم عصبي في نماذج حيوانية مختلفة13،14،15،16،17. نموذج RDN الذي تم إنشاؤه باستخدام الاجتثاث الكيميائي مع الفينول هو نموذج تجريبي راسخ لدراسة التسبب في التنشيط الودي على ارتفاع ضغط الدم. يتم إنشاء هذا النموذج عن طريق التآكل الكيميائي للأعصاب الودية الكلوية مع محلول الفينول / الإيثانول بنسبة 10٪ باستخدام قطعة قطن18. من ناحية ، من المحتمل أن يمنع RDN التقليدي النشاط الودي الكلوي ، مما يقلل من إفراز الرينين وإعادة امتصاص الصوديوم ، ويزيد من تدفق الدم الكلوي. من ناحية أخرى ، فإنه يقمع نظام الرينين أنجيوتنسين-الألدوستيرون19. وبالتالي ، فإن RDN له تأثير مفيد على ارتفاع ضغط الدم. ومع ذلك ، فإن نموذج RDN الناتج عن الاجتثاث الكيميائي يفتقر إلى معايير الاجتثاث ووقت الاجتثاث وتفاصيل الإجراء التجريبي غير واضحة بعد. أيضا ، لا توجد تقارير فنية متاحة. في هذا التقرير ، وصفنا بروتوكولا جراحيا لتوليد نموذج RDN مع الفينول باستخدام ورق الوزن في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين II (Ang II) في الفئران C57BL / 6. نقوم بلف الشريان الكلوي بورق وزن يحتوي على الفينول ونوحد وقت الاجتثاث ، مما يساعد على إنشاء نموذج RDN أكثر قابلية للتكرار وموثوقية. يهدف هذا النموذج التجريبي إلى تقييم تأثير RDN على ارتفاع ضغط الدم.

Protocol

امتثلت جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات للدليل الأخلاقي ذي الصلة لرعاية واستخدام المختبر (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 85-23 ، المنقح 2011) وتمت الموافقة عليها من قبل لجان البحوث الحيوانية في مستشفى هوادونغ التابع لجامعة فودان. تم تقسيم ذكور C57BL / 6 الفئران البالغة من العمر أربعة عشر أسبوعا (28-30 جم) عشوائيا إلى أربع مجموعات: مجموعة الشام ، مجموعة Sham + Ang II ، مجموعة RDN ، مجموعة RDN + Ang II ، n = 6 في كل مجموعة. تم الحفاظ على جميع الحيوانات في ظل ظروف مغلقة محددة خالية من مسببات الأمراض في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 24 ± 1 درجة مئوية مع دورة ضوئية / مظلمة لمدة 12 ساعة وحرية الوصول إلى طعام القوارض القياسي والمياه حسب الطلب.

1. إعداد مجال العملية

  1. تطهير طاولة التشغيل مع 70 ٪ من الإيثانول. اضبط درجة حرارة وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية.
  2. تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو بطرق أخرى. يتطلب هذا الإجراء مقصا جراحيا دقيقا ، وملقطين مستقيمين دقيقين ، وملقطين منحنيين دقيقين ، وملقط مرقئ ، وشاش معقم ، وأوراق وزن.

2. ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين الثاني

  1. توفير ميلوكسيكام (0.5 ملغم / كغم ، SC) للفئران C57BL / 6 قبل وقت قصير من تحريض التخدير. ثم تخدير الفئران باستخدام حقن بنتوباربيتال الصوديوم كما هو موضح سابقا20,21. يمكن أيضا استخدام إيزوفلوران ، إذا كنت تفضل ذلك. تأكد من عمق التخدير بمنعكس قرصة إصبع القدم السلبي.
  2. إزالة الشعر على الظهر مع ماكينة حلاقة. ضع مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  3. ضع الحيوان على طاولة العمليات في الوضع الظهري. امسحي وامسحي المنطقة المحلوقة بالبوفيدون واليود متبوعا بثلاث مناديل تحتوي على 70٪ من الإيثانول.
  4. قم بعمل شق 1 سم باستخدام شفرة مشرط معقمة ، عمودية على الذيل ، خلف الأذن فوق لوح الكتف في الساق الأمامية.
  5. استخدم مرقئ معقم لعمل نفق تحت الجلد وإنشاء جيب للمضخة22. أدخل مضخة تناضحية مملوءة بالأنجيوتنسين II (1000 نانوغرام / كجم / دقيقة) في الجيب برفق. تأكد من وجود مساحة خالية كافية لخياطة الجرح دون شد الجلد.
  6. خياطة العضلات مع الغرز Vicryl المتقطعة 6-0 وإغلاق الجلد مع الغرز النايلون 4-0 متقطعة. مسحة ومسح موقع الجرح مع البوفيدون اليود. قم بإجراء نفس الجراحة بحجم متساو من المحلول الملحي للمجموعة الضابطة.
  7. ضع جميع الأدوات الجراحية في معقم لمدة 10 ثوان واستبدل القفازات المعقمة بين العمليات الجراحية. راقب جميع الفئران حتى تتعافى تماما.
  8. راقب عن كثب وراقب التئام الجروح في الفئران مرتين يوميا على الأقل خلال الأسبوع الأول ومرة كل يوم بعد ذلك ، بما في ذلك الاحمرار والتورم والعدوى. إجراء تشريح على الفور إذا ماتت الفئران أثناء ضخ Ang II.
  9. قم بقياس ضغط الدم عند خط الأساس وكل أسبوع بعد تسريب Ang II باستخدام طريقة تخطيط حجم الكفة23 في الفئران الواعية. تأكد من إجراء تجارب قياس ضغط الدم في منطقة هادئة ، عند 22 ± 2 درجة مئوية ، حيث تتأقلم الفئران لمدة 1 ساعة قبل بدء التجربة. تعويد الفئران لمدة 5 أيام متتالية على الأقل قبل قياسات ضغط الدم الأساسية23,24.

3. إزالة التعصيب الكلوي الثنائي

  1. حدد الفئران ذات ضغط الدم المرتفع (BP) ≥140/90mmHg أو زيادة بنسبة 25٪ في ضغط الدم الانقباضي / ضغط الدم الانبساطي ، بعد أسبوع واحد من تسريب Ang II.
  2. سجل وزن الحيوان قبل الجراحة واختر الحيوانات التي لا يقل وزنها عن 24 جم لجراحة إزالة التعصيب الكلوي.
  3. تخدير الفئران باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم. تأكد من عمق التخدير بمنعكس قرصة إصبع القدم السلبي.
  4. إزالة الشعر على البطن مع ماكينة حلاقة. نفذ هذا الإجراء بعناية ودقة لتجنب أي تلوث جراحي.
  5. ضع الفئران على طاولة العمليات ، مع الحفاظ على البطن وإصلاح أطرافه بشريط. تطهير جلد البطن مع البوفيدون اليود تليها ثلاث مناديل مع 70 ٪ من الإيثانول.
  6. قم بعمل شق بطني في خط الوسط البطني بطول 2 سم باستخدام شفرة مشرط. اسحب الأمعاء للخلف بشاش منقوع في محلول ملحي 37 درجة مئوية لكشف الشريان الكلوي الأيسر. قم بتشريح الدهون بعناية وبصراحة بعيدا عن الشريان الكلوي باستخدام ملاقط منحنية. (الشكل 1 أ - ج).
  7. قطع ورقة الوزن إلى مستطيل من نفس حجم الشريان الكلوي مع مقص حاد معقمة. كمرجع ، قم بقص ورق الوزن بنفس الحجم كما هو موضح في الخط المنقط في الشكل 1C.
    ملاحظة: إنه جزء مهم من الجراحة ، حاول قطع عدة قطع من ورق الوزن في وقت واحد للحفاظ على نفس الشكل.
  8. اغمس ورق الوزن في محلول فينول / إيثانول بنسبة 10٪ لمدة 30 ثانية على الأقل. قم بتغطية سطح الشريان الكلوي الأيسر ولف الوعاء بورق الوزن ، واحتفظ به لمدة 2 دقيقة (الشكل 1 د). استخدم الشاش لحماية الأنسجة المحيطة لتجنب لمس ورق الوزن للكلى والأمعاء المحيطة.
    ملاحظة: محلول الفينول مستقر في الأنابيب البلاستيكية ولكن ليس في القوارير الزجاجية. لذلك ، يجب إعداد الحل حديثا لكل تجربة18.
  9. نفذ نفس الإجراء للشريان الكلوي الأيمن. قم بإجراء الجراحة الوهمية باستخدام ورق وزن مغمور في محلول ملحي.
  10. أعد وضع العضلات في موضعها الأولي وأغلق الصفاق بخيوط 6-0 Vicryl في خياطة متقطعة. ثم أغلق الجلد بخيوط نايلون متقطعة 4-0. راقب جميع الفئران حتى تتعافى تماما.

4. رعاية ما بعد الجراحة

  1. ضع البوفيدون اليود على الشق وضع الحيوان في بطانية كهربائية دافئة للتعافي والمراقبة بعد الجراحة.
  2. راقب الفئران مرتين في اليوم لتقييم الاحمرار والتورم والألم أو عدوى البطن. توفير ميلوكسيكام (0.5 مجم / كجم ، SC) لجميع الفئران قبل حوالي 1 ساعة و 24 ساعة بعد إجراء RDN.

النتائج

الاحصاءات
يتم التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه للتجارب مع ثلاثة أو أكثر من الحالات تليها اختبارات Bonferroni posthoc للمقارنات بين المجموعات الفردية. ضع في اعتبارك أن القيمة p تساوي أو تقل عن 0.05 على أنها مهمة. تم استخدام برنامج تجاري لإجرا...

Discussion

أصبح ما إذا كان RDN يمكن أن يخفض ضغط الدم مثيرا للجدل منذ نشر النتيجة السلبية لتجربة HTN-3 التماثلية 7,25. ومع ذلك ، فقد أظهرت العديد من التجارب السريرية والتجارب على الحيوانات نتائج إيجابية وفعالة من RDN على البشر والحيوانات ارتفاع ضغط الدم9،10،

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح ، مالي أو غير ذلك ، كما أعلن المؤلفون.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81770420) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا التابعة لبلدية شنغهاي (20140900600) ، ومختبر شنغهاي الرئيسي لطب الشيخوخة السريري (13dz2260700) ، والتخصص السريري الرئيسي لبلدية شنغهاي (shslczdzk02801) ومركز مرض الشريان التاجي للشيخوخة ، مستشفى هوادونغ التابع لجامعة فودان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Angiotensin IISangon BiotechCAS:4474-91-3To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibodyAbcamab137869To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure AnalysisVisitech SystemsBP-2000Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pumpDURECT CorporationCA 95014To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA KitAbcamab287789to measure renal norepinephrine levels
PhenolSangon BiotechCAS:108-95-2Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paperSangon BiotechF512112To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 

References

  1. Messerli, F. H., Rimoldi, S. F., Bangalore, S. The transition from hypertension to heart failure: Contemporary update. JACC Heart Failure. 5 (8), 543-551 (2017).
  2. Lackland, D. T., et al. Implications of recent clinical trials and hypertension guidelines on stroke and future cerebrovascular research. Stroke. 49 (3), 772-779 (2018).
  3. Rossignol, P., et al. The double challenge of resistant hypertension and chronic kidney disease. The Lancet. 386 (10003), 1588-1598 (2015).
  4. Du, X., Patel, A., Anderson, C. S., Dong, J., Ma, C. Epidemiology of cardiovascular disease in China and opportunities for improvement. JACC International. Journal of the American College of Cardiology. 73 (24), 3135-3147 (2019).
  5. Valenzuela, P. L., et al. Lifestyle interventions for the prevention and treatment of hypertension. Nature Review Cardiology. 18 (4), 251-275 (2021).
  6. Krum, H., et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study. The Lancet. 373 (9671), 1275-1281 (2009).
  7. Bhatt, D. L., et al. A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension. The New England Journal of Medicine. 370 (15), 1393-1401 (2014).
  8. Kjeldsen, S. E., Narkiewicz, K., Burnier, M., Oparil, S. Renal denervation achieved by endovascular delivery of ultrasound in RADIANCE-HTN SOLO or by radiofrequency energy in SPYRAL HTN-OFF and SPYRAL-ON lowers blood pressure. Blood Press. 27 (4), 185-187 (2018).
  9. Böhm, M., et al. Efficacy of catheter-based renal denervation in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal): a multicentre, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 395 (10234), 1444-1451 (2020).
  10. Azizi, M., et al. Endovascular ultrasound renal denervation to treat hypertension (RADIANCE-HTN SOLO): a multicentre, international, single-blind, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 391 (10137), 2335-2345 (2018).
  11. Kandzari, D. E., et al. Effect of renal denervation on blood pressure in the presence of antihypertensive drugs: 6-month efficacy and safety results from the SPYRAL HTN-ON MED proof-of-concept randomised trial. The Lancet. 391 (10137), 2346-2355 (2018).
  12. Townsend, R. R., et al. Catheter-based renal denervation in patients with uncontrolled hypertension in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED): a randomised, sham-controlled, proof-of-concept trial. The Lancet. 390 (10108), 2160-2170 (2017).
  13. Sun, X., et al. Renal denervation restrains the inflammatory response in myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Research in Cardiology. 115 (2), 15 (2020).
  14. Sharp, T. E., et al. Renal denervation prevents heart failure progression via inhibition of the renin-angiotensin system. Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2609-2621 (2018).
  15. Wang, H., et al. Renal denervation attenuates progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice independent of blood pressure lowering. Hypertension. 65 (4), 758-765 (2015).
  16. Chen, H., et al. Renal denervation mitigates atherosclerosis in ApoE-/- mice via the suppression of inflammation. American Journal of Translational Research. 12 (9), 5362-5380 (2020).
  17. Wang, Y., et al. Renal denervation promotes atherosclerosis in hypertensive apolipoprotein E-deficient mice infused with Angiotensin II. Frontiers in Physiology. 8, 215 (2017).
  18. Eriguchi, M., Tsuruya, K. Renal sympathetic denervation in rats. Methods in Molecular Biology. 1397, 45-52 (2016).
  19. Thukkani, A. K., Bhatt, D. L. Renal denervation therapy for hypertension. Circulation. 128 (20), 2251-2254 (2013).
  20. Zhang, Y. J., et al. NAD(+) administration decreases microvascular damage following cardiac ischemia/reperfusion by restoring autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 115 (5), 57 (2020).
  21. Wang, M., et al. Long-term renal sympathetic denervation ameliorates renal fibrosis and delays the onset of hypertension in spontaneously hypertensive rats. American Journal of Translational Research. 10 (12), 4042-4053 (2018).
  22. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e53191 (2015).
  23. Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
  24. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1291 (2009).
  25. Esler, M. Illusions of truths in the Symplicity HTN-3 trial: generic design strengths but neuroscience failings. Journal of the American Society of Hypertension. 8 (8), 593-598 (2014).
  26. Han, W., et al. Low-dose sustained-release deoxycorticosterone acetate-induced hypertension in Bama miniature pigs for renal sympathetic nerve denervation. Journal of the American Society of Hypertension. 11 (5), 314-320 (2017).
  27. Han, W., et al. The safety of renal denervation as assessed by optical coherence tomography: pre- and post-procedure comparison with multi-electrode ablation catheter in animal experiment. Hellenic Journal of Cardiology. 61 (3), 190-196 (2020).
  28. Cai, X., et al. Noninvasive stereotactic radiotherapy for renal denervation in a swine model. Journal of the American College of Cardiology. 74 (13), 1697-1709 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183 RDN II

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved