L’amélioration de la dénervation rénale a atténué l’hypertension induite par la perfusion d’angiotensine II

Résumé

Nous présentons ici un protocole de dénervation sympathique rénale (RDN) chez les souris souffrant d’hypertension induite par la perfusion d’angiotensine II. La procédure est reproductible, pratique et permet d’étudier les mécanismes de régulation des RDN sur l’hypertension et l’hypertrophie cardiaque.

Résumé

Les bénéfices de la dénervation sympathique rénale (RDN) sur la pression artérielle ont été prouvés dans un grand nombre d’essais cliniques au cours des dernières années. Cependant, le mécanisme de régulation de la RDN sur l’hypertension reste insaisissable. Il est donc essentiel d’établir un modèle RDN plus simple chez la souris. Dans cette étude, des mini-pompes osmotiques remplies d’angiotensine II ont été implantées chez des souris C57BL/6 âgées de 14 semaines. Une semaine après l’implantation de la mini-pompe osmotique, une procédure RDN modifiée a été réalisée sur les artères rénales bilatérales des souris à l’aide de phénol. Les souris appariées selon l’âge et le sexe ont reçu une solution saline et ont servi de groupe fictif. La pression artérielle a été mesurée au départ et chaque semaine par la suite pendant 21 jours. Ensuite, l’artère rénale, l’aorte abdominale et le cœur ont été prélevés pour un examen histologique à l’aide de la coloration H & E et Masson. Dans cette étude, nous présentons un modèle RDN simple, pratique, reproductible et standardisé, qui peut contrôler l’hypertension et soulager l’hypertrophie cardiaque. La technique peut dénerver les nerfs sympathiques rénaux périphériques sans endommager les artères rénales. Par rapport aux modèles précédents, le RDN modifié facilite l’étude de la pathobiologie et de la physiopathologie de l’hypertension.

Introduction

L’hypertension est une maladie cardiovasculaire chronique majeure dans le monde. L’hypertension non contrôlée pourrait endommager les organes cibles et contribuer à l’insuffisance cardiaque, aux accidents vasculaires cérébraux et aux maladies rénales chroniques ^1,2,3. La prévalence de l’hypertension est passée de 20 % à 31 % entre 1991 et 2007 en Chine. Le nombre d’adultes souffrant d’hypertension en Chine pourrait doubler à la suite d’une récente révision des critères diagnostiques de l’hypertension (130/80 mmHg)⁴. L’hypertension peut être contrôlée par la médecine, cependant, environ 20% des patients sont incapables de contrôler leur hypertension, même lorsqu’ils reçoivent au moins trois médicaments antihypertenseurs (dont un diurétique) à la dose maximale tolérée, ce qui peut conduire au développement d’une hypertension pharmacorésistante⁵.

La dénervation sympathique rénale (RDN) s’est avérée être un traitement potentiel de l’hypertension. En 2009, Krum et ses collègues ont signalé pour la première fois un traitement de l’hypertension résistante utilisant le RDN. Il a été constaté que l’ablation percutanée de l’artère rénale peut effectivement provoquer une réduction persistante de la pression artérielle chez les patients⁶. Cependant, l’échec de l’essai Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) a entravé l’application du RDN⁷, transformant le RDN en une thérapie controversée. Néanmoins, la perspective de RDN n’a pas encore été exclue. Des essais cliniques récents, dont RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED et SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal, ont confirmé l’efficacité du RDN sur l’hypertension 8,9,10,11,12. Ainsi, des recherches mécanistiques plus détaillées doivent être effectuées pour explorer les effets du RDN.

Le but global de cette étude est de démontrer comment le RDN chez la souris peut être modifié pour produire une chirurgie plus simple et plus stable. Un grand nombre d’expériences ont étudié diverses approches de RDN, telles que la cryoablation intravasculaire, l’échographie extracorporelle et l’application locale d’un produit chimique ou d’une neurotoxine dans différents modèles animaux 13,14,15,16,17. Le modèle RDN généré par ablation chimique au phénol est un modèle expérimental bien établi pour étudier la pathogenèse de l’activation sympathique sur l’hypertension. Ce modèle est généré par corrosion chimique des nerfs sympathiques rénaux avec une solution de phénol/éthanol à 10% à l’aide d’un coton-tige¹⁸. D’une part, le RDN conventionnel inhibe potentiellement l’activité sympathique rénale, ce qui diminue alors la sécrétion de rénine et la réabsorption de sodium, et augmente le flux sanguin rénal. D’autre part, il supprime le système rénine-angiotensine-aldostérone¹⁹. Ainsi, RDN a un effet bénéfique sur l’hypertension. Cependant, le modèle RDN généré par ablation chimique manque de critères d’ablation et de temps d’ablation et les détails de la procédure expérimentale ne sont pas encore clairs. De plus, aucun rapport technique n’est disponible. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole chirurgical pour la génération d’un modèle RDN avec du phénol en utilisant du papier de pesée dans l’hypertension induite par l’angiotensine II (Ang II) chez des souris C57BL / 6. Nous enveloppons l’artère rénale avec du papier de pesée contenant du phénol et unifions le temps d’ablation, ce qui aide à établir un modèle RDN plus reproductible et fiable. Ce modèle expérimental vise à évaluer l’effet des RDN sur l’hypertension.

Protocole

Toutes les procédures d’expérimentation animale étaient conformes au Guide éthique pertinent pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication des NIH n ° 85-23, révisée en 2011) et ont été approuvées par les comités de recherche animale de l’hôpital de Huadong affilié à l’Université Fudan. Des souris C57BL/6 mâles âgées de quatorze semaines (28-30g) ont été divisées au hasard en quatre groupes : groupe Sham, groupe Sham + Ang II, groupe RDN, groupe RDN + Ang II, n = 6 dans chaque groupe. Tous les animaux ont été maintenus dans des conditions fermées spécifiques exemptes d’agents pathogènes dans une pièce à température contrôlée à 24 ± 1 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à la norme de rongeurs et à l’eau ad libitum.

1. Préparation du champ d’opération

1. Désinfectez la table d’opération avec de l’éthanol à 70%. Réglez la température du coussin chauffant à 37 °C.
2. S’assurer que tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés avant la chirurgie à 121 °C pendant 30 minutes ou par d’autres méthodes. Cette procédure nécessite des ciseaux microchirurgicaux, deux pinces droites fines, deux pinces fines incurvées, des pinces hémostatiques, des gazes stériles et des papiers de pesée.

2. Hypertension induite par l’angiotensine II

1. Fournir du méloxicam (0,5 mg/kg, SC) aux souris C57BL/6 peu avant l’induction de l’anesthésie. Ensuite, anesthésier les souris en utilisant l’injection de pentobarbital sodique comme décrit précédemment^20,21. L’isoflurane peut également être utilisé, si vous préférez. Confirmez la profondeur de l’anesthésie avec un réflexe de pincement négatif des orteils.
2. Enlevez les poils sur le dos avec un rasoir. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Placez l’animal sur une table d’opération en position dorsale. Écouvillonner et essuyer la zone rasée avec de la povidone iodée suivie de trois lingettes contenant de l’éthanol à 70%.
4. Faites une incision de 1 cm à l’aide d’une lame de scalpel stérile, perpendiculaire à la queue, derrière l’oreille sur l’omoplate de la patte avant.
5. Utilisez un hémostatique stérile pour faire un tunnel sous-cutané sous la peau et créer une poche pour la pompe²². Insérez doucement une pompe osmotique remplie d’angiotensine II (1 000 ng/kg/min) dans la poche. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace libre pour suturer la plaie sans étirer la peau.
6. Suturer le muscle avec des sutures en Vicryl 6-0 interrompues et fermer la peau avec des sutures en nylon 4-0 interrompues. Écouvillonner et essuyer le site de la plaie avec de la povidone iodée. Effectuer la même chirurgie avec un volume égal de solution saline pour le groupe témoin.
7. Placez tous les instruments chirurgicaux dans un stérilisateur pendant 10 s et replacez les gants stériles entre les chirurgies. Surveillez toutes les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies.
8. Surveillez de près et observez la cicatrisation des plaies chez la souris au moins deux fois par jour pendant la première semaine et une fois par jour par la suite, y compris la rougeur, l’enflure et l’infection. Effectuer la dissection immédiatement si les souris meurent pendant la perfusion d’Ang II.
9. Mesurer la pression artérielle au départ et chaque semaine après la perfusion d’Ang II avec la méthode de pléthysmographie de la coiffe^{de queue 23} chez des souris conscientes. S’assurer que les expériences de mesure de la pression artérielle sont menées dans un endroit calme, à 22 ± 2 °C, où les souris sont acclimatées pendant 1 h avant le début de l’expérience. Habituer les souris pendant au moins 5 jours consécutifs avant les mesures de pression artérielle de base^23,24.

3. Dénervation rénale bilatérale

1. Sélectionnez les souris présentant une pression artérielle élevée (TA) ≥140/90 mmHg ou une augmentation de 25 % de la PA systolique/PA diastolique, 1 semaine après la perfusion d’Ang II.
2. Enregistrer le poids des animaux avant la chirurgie et choisir des animaux d’un poids minimum de 24 g pour la chirurgie de dénervation rénale.
3. Anesthésier les souris à l’aide de pentobarbital sodique. Confirmez la profondeur de l’anesthésie avec un réflexe de pincement négatif des orteils.
4. Enlevez les poils sur l’abdomen avec un rasoir. Effectuez cette procédure avec soin et minutie pour éviter toute contamination chirurgicale.
5. Placez les souris sur la table d’opération, en maintenant l’abdomen en place et fixez ses membres avec du ruban adhésif. Désinfecter la peau abdominale avec de la povidone iodée suivie de trois lingettes avec de l’éthanol à 70%.
6. Faites une incision abdominale médiane ventrale de 2 cm à l’aide d’une lame de scalpel. Retirez l’intestin avec de la gaze imbibée d’une solution saline à 37 °C pour exposer l’artère rénale gauche. Disséquez soigneusement mais carrément la graisse loin de l’artère rénale à l’aide d’une pince à épiler incurvée. (Figure 1A-C).
7. Coupez le papier de pesée en un rectangle de la même taille que l’artère rénale avec des ciseaux tranchants stériles. Pour référence, coupez le papier de pesée dans la même taille que celle indiquée par la ligne pointillée de la figure 1C.
   REMARQUE: C’est une partie critique de la chirurgie, essayez de couper plusieurs morceaux de papier de pesée à la fois pour garder la même forme.
8. Trempez le papier de pesage dans une solution phénol/éthanol à 10 % pendant au moins 30 s. Couvrir la surface de l’artère rénale gauche et envelopper le vaisseau avec le papier de pesée, conserver pendant 2 min (Figure 1D). Utilisez de la gaze pour protéger les tissus environnants afin d’éviter que le papier de pesée ne touche le rein et l’intestin environnants.
   REMARQUE: La solution de phénol est stable dans les tubes en plastique mais pas dans les flacons en verre. Par conséquent, la solution doit être fraîchement préparée pour chaque expérience¹⁸.
9. Effectuez la même procédure pour l’artère rénale droite. Effectuez la chirurgie fictive avec du papier de pesée immergé dans une solution saline.
10. Repositionnez les muscles dans leur position initiale et fermez le péritoine avec des sutures de Vicryl 6-0 dans une suture interrompue. Ensuite, fermez la peau avec des sutures en nylon 4-0 interrompues. Surveillez toutes les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies.

4. Soins postopératoires

1. Appliquez de la povidone iodée sur l’incision et placez l’animal dans une couverture chauffante pour la récupération et la surveillance postopératoire.
2. Surveillez les souris deux fois par jour pour évaluer la rougeur, l’enflure et la douleur ou l’infection abdominale. Fournir du méloxicam (0,5 mg/kg, SC) à toutes les souris environ 1 h avant et 24 h après la procédure RDN.

Résultats

Statistiques
Toutes les données sont exprimées sous forme de moyenne ± d’écart-type. L’ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour des expériences avec trois conditions ou plus, suivies de tests post-hoc de Bonferroni pour les comparaisons entre les groupes individuels. Considérez une valeur de p égale ou inférieure à 0,05 comme significative. Un logiciel commercial a été utilisé pour effectuer toutes les analyses statistiques.

L’augmentation de...

Discussion

La question de savoir si le RDN pourrait abaisser la tension artérielle est devenue controversée depuis la publication du résultat négatif de l’essai de symplicité HTN-3 ^7,25. Cependant, plusieurs essais cliniques et expériences sur des animaux ont démontré des résultats positifs et efficaces de RDN sur les humains et les animaux hypertendus 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sangon Biotech	CAS:4474-91-3	To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody	Abcam	ab137869	To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure Analysis	Visitech Systems	BP-2000	Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pump	DURECT Corporation	CA 95014	To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA Kit	Abcam	ab287789	to measure renal norepinephrine levels
Phenol	Sangon Biotech	CAS:108-95-2	Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paper	Sangon Biotech	F512112	To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112.