ניתוק עצבים כלייתי משופר יתר לחץ דם מופחת המושרה על ידי עירוי אנגיוטנסין II

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוק עצבים סימפתטי כלייתי (RDN) בעכברים עם יתר לחץ דם המושרה על ידי עירוי אנגיוטנסין II. ההליך הוא חוזר, נוח ומאפשר ללמוד את מנגנוני הרגולציה של RDN על יתר לחץ דם והיפרטרופיה לבבית.

Abstract

היתרונות של ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי (RDN) על לחץ הדם הוכחו במספר רב של ניסויים קליניים בשנים האחרונות. עם זאת, מנגנון הרגולציה של RDN על יתר לחץ דם נשאר חמקמק. לכן, חיוני להקים מודל RDN פשוט יותר בעכברים. במחקר זה, משאבות מיני אוסמוטיות מלאות באנגיוטנסין II הושתלו בעכברי C57BL/6 בני 14 שבועות. שבוע לאחר השתלת המשאבה המיני-אוסמוטית, בוצע הליך RDN שונה על עורקי הכליה הדו-צדדיים של העכברים באמצעות פנול. עכברים תואמי גיל קיבלו תמיסת מלח ושימשו כקבוצת בושה. לחץ הדם נמדד בנקודת ההתחלה ובכל שבוע לאחר מכן במשך 21 יום. לאחר מכן, עורק הכליה, אבי העורקים הבטני והלב נאספו לבדיקה היסטולוגית באמצעות מכתים H&E ו- Masson. במחקר זה אנו מציגים מודל RDN פשוט, מעשי, חוזר וסטנדרטי, שיכול לשלוט ביתר לחץ דם ולהקל על היפרטרופיה לבבית. הטכניקה יכולה לנטרל עצבים סימפתטיים כלייתיים היקפיים ללא נזק לעורק הכליה. בהשוואה למודלים קודמים, ה- RDN המתוקן מקל על חקר הפתוביולוגיה והפתופיזיולוגיה של יתר לחץ דם.

Introduction

יתר לחץ דם הוא מחלה כרונית כרונית קרדיווסקולרית גדולה ברחבי העולם. יתר לחץ דם בלתי מבוקר עלול לפגוע באיברי המטרה ולתרום לאי ספיקת לב, שבץ ומחלות כליות כרוניות ^1,2,3. שכיחות יתר לחץ דם עלתה מ -20% ל -31% בין 1991 ל -2007 בסין. מספר המבוגרים עם יתר לחץ דם בסין עשוי להכפיל את עצמו בעקבות עדכון שנערך לאחרונה בקריטריוני האבחון ליתר לחץ דם (130/80 מ"מ כספית)⁴. יתר לחץ דם יכול להיות נשלט על ידי תרופות, עם זאת, כ 20% מהחולים אינם מסוגלים לשלוט יתר לחץ דם שלהם, גם כאשר מקבלים לפחות שלוש תרופות נגד יתר לחץ דם (כולל משתן אחד) במינון נסבל מקסימלית, אשר עשוי להוביל לפיתוח של יתר לחץ דם עמיד לתרופות⁵.

ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי (RDN) הוכח כטיפול פוטנציאלי ליתר לחץ דם. בשנת 2009, קרום ועמיתיו דיווחו לראשונה על טיפול עמיד ביתר לחץ דם באמצעות RDN. נמצא כי אבלציה מלעורית של עורק הכליה יכולה לגרום ביעילות לירידה מתמשכת בלחץ הדם בחולים⁶. עם זאת, הכישלון של ניסוי יתר לחץ דם סימפליסיטי 3 (HTN-3) עיכב את היישום של RDN⁷, והפך RDN לטיפול שנוי במחלוקת. עם זאת, האפשרות של RDN עדיין לא נשללה. ניסויים קליניים אחרונים, כולל RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED, ו- SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal אישרו את היעילות של RDN על יתר לחץ דם 8,9,10,11,12. לפיכך, מחקר מכניסטי מפורט יותר צריך להתבצע כדי לחקור את ההשפעות של RDN.

המטרה הכוללת של מחקר זה היא להדגים כיצד ניתן לשנות את ה-RDN בעכברים כדי לייצר ניתוח פשוט ויציב יותר. מספר רב של ניסויים חקרו גישות שונות של RDN, כגון קריואבלציה תוך-וסקולרית, אולטרסאונד חוץ-גופי ויישום מקומי של כימיקל או נוירוטוקסין במודלים שונים של בעלי חיים 13,14,15,16,17. מודל RDN שנוצר באמצעות אבלציה כימית עם פנול הוא מודל ניסיוני מבוסס היטב לחקר הפתוגנזה של הפעלה סימפתטית על יתר לחץ דם. מודל זה נוצר על ידי קורוזיה כימית של העצבים הסימפתטיים הכלייתיים עם 10% תמיסת פנול/אתנול באמצעות צמר גפן¹⁸. מצד אחד, ה-RDN הקונבנציונלי עלול לעכב פעילות סימפתטית כלייתית, מה שמפחית את הפרשת הרנין ואת ספיגת הנתרן מחדש, ומגביר את זרימת הדם הכלייתית. מצד שני, הוא מדכא את מערכת רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון¹⁹. ובכך, RDN יש השפעה מועילה על יתר לחץ דם. עם זאת, מודל האבלציה הכימית שנוצר על ידי RDN חסר קריטריונים לאבלציה וזמן אבלציה ופרטי ההליך הניסיוני עדיין אינם ברורים. כמו כן, אין דוחות טכניים זמינים. בדו"ח זה אנו מתארים פרוטוקול כירורגי ליצירת מודל RDN עם פנול באמצעות נייר שקילה באנגיוטנסין II (Ang II) המושרה יתר לחץ דם בעכברי C57BL/6. אנו עוטפים את עורק הכליה בנייר שקילה המכיל פנול ומאחדים את זמן האבלציה, מה שעוזר להקים מודל RDN אמין יותר לשחזור. מודל ניסיוני זה נועד להעריך את ההשפעה של RDN על יתר לחץ דם.

Protocol

כל הליכי הניסויים בבעלי חיים עמדו במדריך האתי הרלוונטי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסום NIH מס' 85-23, תוקן ב-2011) ואושרו על ידי הוועדות לחקר בעלי חיים של בית החולים Huadong המסונף לאוניברסיטת פודאן. עכברי C57BL/6 זכרים בני 14 שבועות (28-30 גרם) חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת שאם, קבוצת שאם+אנג II, קבוצת RDN, קבוצת RDN+אנג II, n = 6 בכל קבוצה. כל בעלי החיים הוחזקו בתנאים סגורים ספציפיים ללא פתוגנים בחדר מבוקר טמפרטורה בטמפרטורה של 24 ± 1 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית לצ'או מכרסם סטנדרטי ולמים ad libitum.

1. הכנת שדה הניתוח

1. יש לחטא את שולחן הניתוחים ב-70% אתנול. כוונן את טמפרטורת כרית החימום ל-37°C.
2. ודא כי כל כלי הניתוח מעוקרים לפני הניתוח ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בשיטות אחרות. הליך זה דורש מספריים מיקרו-כירורגיים, שני מלקחיים ישרים עדינים, שני מלקחיים מעוקלים עדינים, מלקחיים המוסטטיים, גזה סטרילית וניירות שקילה.

2. אנגיוטנסין II המושרה יתר לחץ דם

1. ספק מלוקסיקם (0.5 מ"ג/ק"ג, SC) לעכברי C57BL/6 זמן קצר לפני השראת ההרדמה. לאחר מכן, הרדימו את העכברים באמצעות הזרקת נתרן פנטוברביטל כפי שתואר קודם לכן^20,21. ניתן להשתמש גם באיזופלוראן, אם מעדיפים. אשר את עומק ההרדמה עם רפלקס צביטה שלילי בבוהן.
2. הסר את השיער על הגב עם מכונת גילוח. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
3. מניחים את החיה על שולחן ניתוחים בתנוחה הגבית. מטושים ומנגבים את האזור המגולח עם פובידון-יוד ואחריו שלושה מגבונים עם 70% אתנול.
4. בצע חתך של 1 ס"מ באמצעות להב אזמל סטרילי, בניצב לזנב, מאחורי האוזן מעל להב הכתף של הרגל הקדמית.
5. השתמש hemostat סטרילי לעשות מנהרה תת עורית מתחת לעור וליצור כיס עבור המשאבה²². הכנס משאבה אוסמוטית מלאה אנגיוטנסין II (1,000 ננוגרם/ק"ג/דקה) לכיס בעדינות. ודא שיש מספיק מקום פנוי כדי לתפור את הפצע מבלי למתוח את העור.
6. לתפור את השריר עם תפרי ויקריל מופרעים 6-0 ולסגור את העור עם תפרים 4-0 ניילון מופרעים. ספוגית ולנגב את אתר הפצע עם פובידון-יוד. בצע את אותו ניתוח עם נפח שווה של מלח עבור קבוצת הביקורת.
7. מכניסים את כל כלי הניתוח לתוך חומר מעקר למשך 10 שניות ומחליפים את הכפפות הסטריליות בין הניתוחים. נטר את כל העכברים עד להחלמה מלאה.
8. לעקוב מקרוב ולעקוב אחר ריפוי פצעים בעכברים לפחות פעמיים ביום במהלך השבוע הראשון ופעם בכל יום לאחר מכן, כולל אדמומיות, נפיחות וזיהום. בצע דיסקציה מיד אם העכברים מתים במהלך עירוי אנג II.
9. יש למדוד את לחץ הדם בנקודת ההתחלה ובכל שבוע לאחר עירוי Ang II בשיטת הפלתיסמוגרפיה של שרוול הזנב²³ בעכברים מודעים. ודא כי ניסויי מדידת לחץ הדם נערכים באזור שקט, בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס, שבו העכברים מתאקלמים במשך שעה אחת לפני תחילת הניסוי. יש להרגיל עכברים במשך 5 ימים רצופים לפחות לפני מדידת לחץ דם^{בסיסית של 23,24.}

3. ניתוק עצבים כלייתי דו-צדדי

1. בחר את העכברים עם לחץ דם גבוה (BP) ≥140/90mmHg או עלייה של 25% ב- BP סיסטולי / BP דיאסטולי, שבוע לאחר עירוי Ang II.
2. רשום משקל בעלי חיים לפני הניתוח ובחר בעלי חיים עם משקל מינימלי של 24 גרם לניתוח ניתוק עצבים כלייתי.
3. הרדמת העכברים באמצעות נתרן פנטוברביטל. אשר את עומק ההרדמה עם רפלקס צביטה שלילי בבוהן.
4. הסר את השיער על הבטן עם מכונת גילוח. בצע הליך זה בזהירות וביסודיות כדי למנוע כל זיהום כירורגי.
5. מניחים את העכברים על שולחן הניתוחים, שומרים על הבטן למעלה ומקבעים את איבריה בנייר דבק. יש לחטא את עור הבטן עם פובידון-יוד ואחריו שלושה מגבונים עם 70% אתנול.
6. בצע חתך בטני גחוני של 2 ס"מ באמצעות להב אזמל. למשוך בחזרה את המעי עם גזה ספוג 37 מעלות צלזיוס מלוחים כדי לחשוף את עורק הכליה השמאלי. יש לנתח בזהירות אך בבוטות את השומן הרחק מעורק הכליה באמצעות פינצטה מעוקלת. (איור 1A-C).
7. חותכים את נייר השקילה למלבן בגודל זהה לעורק הכליה עם מספריים חדים סטריליים. לעיון, חתכו את נייר השקילה באותו גודל כפי שמוצג על-ידי הקו המקווקו באיור 1C.
   הערה: זהו חלק קריטי של הניתוח, נסה לחתוך כמה חתיכות של נייר שקילה בכל פעם כדי לשמור על אותה צורה.
8. טבלו את נייר השקילה בתמיסת פנול/אתנול של 10% למשך 30 שניות לפחות. כסו את פני השטח של עורק הכליה השמאלי ועטפו את כלי הדם בנייר השקילה, שמרו למשך 2 דקות (איור 1D). השתמש גזה כדי להגן על הרקמות שמסביב כדי למנוע מנייר השקילה לגעת בכליה ובמעי שמסביב.
   הערה: תמיסת הפנול יציבה בצינורות פלסטיק אך לא בבקבוקוני זכוכית. לכן, הפתרון חייב להיות מוכן טרי לכל ניסוי¹⁸.
9. בצע את אותו הליך עבור עורק הכליה הימני. בצע את ניתוח הבושה עם נייר שקילה שקוע במי מלח.
10. מקם מחדש את השרירים למקומם הראשוני וסגור את הצפק עם 6-0 תפרי ויקריל בתפר מופרע. לאחר מכן, סגור את העור עם תפרים ניילון 4-0 מופרעים. נטר את כל העכברים עד להחלמה מלאה.

4. טיפול לאחר הניתוח

1. יש למרוח פובידון-יוד על החתך ולהניח את בעל החיים בשמיכה חשמלית מחוממת להתאוששות ולניטור לאחר הניתוח.
2. עקוב אחר העכברים פעמיים ביום כדי להעריך אדמומיות, נפיחות וכאבים או זיהום בבטן. ספק מלוקסיקם (0.5 מ"ג/ק"ג, SC) לכל העכברים כשעה לפני ו-24 שעות לאחר הליך RDN.

תוצאות

סטטיסטיקה
כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. ANOVA חד-כיווני שימש לניסויים עם שלושה תנאים או יותר ואחריהם מבחני בונפרוני פוסט-הוק להשוואות בין קבוצות בודדות. שקול ערך p שווה או קטן מ- 0.05 כמשמעותי. תוכנה מסחרית שימשה לביצוע כל הניתוחים הסטטיסטיים.

עלייה בלחץ ה...

Discussion

האם RDN יכול להוריד את לחץ הדם הפך שנוי במחלוקת מאז פרסום התוצאה השלילית של ניסוי HTN-3 הסימטריה ^7,25. עם זאת, מספר ניסויים קליניים וניסויים בבעלי חיים הראו תוצאות חיוביות ויעילות של RDN על יתר לחץ דם בבני אדם ובבעלי חיים 9,10,11,12,13,14,15,16,17

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sangon Biotech	CAS:4474-91-3	To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody	Abcam	ab137869	To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure Analysis	Visitech Systems	BP-2000	Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pump	DURECT Corporation	CA 95014	To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA Kit	Abcam	ab287789	to measure renal norepinephrine levels
Phenol	Sangon Biotech	CAS:108-95-2	Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paper	Sangon Biotech	F512112	To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112.