改善肾去神经支配缓解血管紧张素II.诱导的高血压

摘要

在这里，我们提出了由血管紧张素II输注诱导的高血压小鼠肾交感神经去神经支配（RDN）的方案。该程序可重复，方便，并允许研究RDN对高血压和心脏肥大的调节机制。

摘要

近年来，肾交感神经去神经支配（RDN）对血压的益处已在大量临床试验中得到证实。然而，RDN对高血压的调节机制仍然难以捉摸。因此，在小鼠中建立更简单的RDN模型至关重要。在这项研究中，将充满血管紧张素II的渗透迷你泵植入14周龄的C57BL / 6小鼠中。植入微型渗透泵一周后，使用苯酚对小鼠的双侧肾动脉进行改良的RDN程序。给予年龄性别匹配的小鼠盐水并作为假组。在基线时测量血压，随后每周测量血压，持续21天。然后，收集肾动脉，腹主动脉和心脏，使用H&E和Masson染色进行组织学检查。在这项研究中，我们提出了一种简单、实用、可重复和标准化的RDN模型，可以控制高血压，缓解心脏肥大。该技术可以去神经支配周围肾交感神经，而不会造成肾动脉损伤。与以前的模型相比，改进的RDN有助于研究高血压的病理生物学和病理生理学。

引言

高血压是全世界主要的慢性心血管疾病。不受控制的高血压可能会损害靶器官并导致心力衰竭、中风和慢性肾脏疾病¹，^2，3。1991年至2007年间，中国的高血压患病率从20%上升到31%。在最近修订高血压诊断标准（130/80 mmHg^）4后，中国成人高血压患者人数可能会翻一番。高血压可以通过药物控制，然而，大约20%的患者无法控制他们的高血压，即使以最大耐受剂量接受至少三种抗高血压药物（包括一种利尿剂），这可能导致耐药性高血压^{的发展5。}

肾交感神经去神经支配（RDN）已被证明是高血压的潜在治疗方法。2009年，Krum及其同事首次报告了使用RDN进行难治性高血压治疗。结果发现经皮肾动脉消融术可有效引起患者持续性血压降低⁶.然而，Symplicity Hypertension 3 （HTN-3） 试验的失败阻碍了 RDN 7 的应用，使 RDN^成为一种有争议的疗法。然而，RDN的前景尚未被排除。最近的临床试验，包括RADIANCE-HTN SOLO，SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED和SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal已经证实了RDN对高血压8，9^，10，^11，12的疗效。因此，需要进行更详细的机理研究来探索RDN的影响。

本研究的总体目的是证明如何修改小鼠中的RDN以产生更简单，更稳定的手术。大量的实验研究了RDN的各种方法，如血管内冷冻消融，体外超声和化学或神经毒素在不同动物模型中的局部应用¹³，¹⁴，¹⁵，^16，17。使用苯酚化学消融生成的RDN模型是研究交感神经激活对高血压发病机制的成熟实验模型。该模型是通过使用棉签10%苯酚/乙醇溶液对肾交感神经进行化学腐蚀而产生的¹⁸。一方面，常规RDN潜在地抑制肾交感神经活性，从而减少肾素分泌和钠重吸收，并增加肾血流量。另一方面，它抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统¹⁹。因此，RDN对高血压有有益的作用。然而，化学消融生成的RDN模型缺乏消融标准和消融时间，实验过程的细节尚不清楚。此外，没有可用的技术报告。在本报告中，我们描述了一种使用称重纸在血管紧张素II（Ang II）诱导的C57BL / 6小鼠高血压中用苯酚生成RDN模型的手术方案。我们用含有苯酚的称量纸包裹肾动脉并统一消融时间，这有助于建立更可重复、更可靠的 RDN 模型。该实验模型旨在评估RDN对高血压的影响。

研究方案

所有动物实验程序均符合实验动物护理和使用的相关伦理指南（NIH出版物编号85-23，2011年修订），并得到复旦大学附属华东医院动物研究委员会的批准。将14周龄雄性C57BL/6小鼠（28-30g）随机分为4组:假鼠组、假+Ang II组、RDN组、RDN+Ang II组，每组n = 6。所有动物均在24±1°C的温度受控室中在特定封闭的无病原体条件下饲养，光照/黑暗循环12小时，并随意获得标准啮齿动物食物和水。

1. 操作场的准备

1. 用70%乙醇消毒操作台。将加热垫温度调节至37°C。
2. 确保所有手术器械在手术前在121°C下灭菌30分钟或通过其他方法。该手术需要微型手术剪刀、两个细直钳、两个细弯曲镊子、止血钳、无菌纱布和称重纸。

2.血管紧张素II.诱导的高血压

1. 在麻醉诱导前不久向C57BL / 6小鼠提供美洛昔康（0.5mg / kg，SC）。然后，如前所述使用戊巴比妥钠注射液麻醉小鼠^20，21。如果愿意，也可以使用异氟醚。用负脚趾捏反射确认麻醉深度。
2. 用剃须刀去除背部的头发。在眼睛上涂抹兽医软膏以防止麻醉时干燥。
3. 将动物放在背部位置的手术台上。用聚维酮碘擦拭并擦拭剃光区域，然后用 70% 乙醇擦拭三片。
4. 使用垂直于尾巴的无菌手术刀刀片在前腿肩胛骨的耳朵后面做一个 1 厘米的切口。
5. 使用无菌止血器在皮下建立皮下隧道并为泵²²创建一个口袋。将充满血管紧张素 II （1，000 ng/kg/min） 的渗透泵轻轻插入口袋。确保有足够的自由空间缝合伤口，而不会拉伸皮肤。
6. 用中断的6-0 Vicryl缝合线缝合肌肉，并用中断的4-0尼龙缝合线闭合皮肤。用聚维酮碘擦拭并擦拭伤口部位。对对照组使用等体积的盐水进行相同的手术。
7. 将所有手术器械放入灭菌器中10秒，并在手术之间更换无菌手套。监测所有小鼠，直到完全恢复。
8. 在第一周内每天至少两次密切监测和观察小鼠的伤口愈合情况，随后每天一次，包括发红，肿胀和感染。如果小鼠在Ang II输注期间死亡，请立即进行解剖。
9. 在基线和每周用有意识的小鼠的尾袖体积描记法²³ 输注Ang II后测量血压。确保血压测量实验在22±2°C的安静区域进行，在实验开始前将小鼠适应1小时。在基线血压测量之前习惯小鼠至少连续5天^23，24。

3.双侧肾去神经支配

1. 选择血压（BP）升高≥140 / 90mmHg或收缩压/舒张压升高25%的小鼠，输注Ang II后1周。
2. 术前记录动物体重，并选择最小体重为24g的动物进行肾去神经支配手术。
3. 使用戊巴比妥钠麻醉小鼠。用负脚趾捏反射确认麻醉深度。
4. 用剃须刀去除腹部的毛发。仔细彻底地执行此过程，以避免任何手术污染。
5. 将小鼠放在手术台上，保持腹部向上并用胶带固定其四肢。用聚维酮碘消毒腹部皮肤，然后用70%乙醇擦拭三片。
6. 使用手术刀刀片做一个 2 cm 的腹侧中线腹部切口。用浸泡在37°C盐水中的纱布拉回肠道，露出左肾动脉。使用弯曲的镊子仔细而直截了当地将脂肪从肾动脉中解剖出来。（图 1A-C）。
7. 用无菌锋利的剪刀将称重纸切成与肾动脉大小相同的矩形。作为参考，将称量纸切成 与图1C虚线所示相同的尺寸。
   注意:这是手术的关键部分，尝试一次切几张称重纸以保持相同的形状。
8. 将称量纸浸入10%苯酚/乙醇溶液中至少30秒。覆盖左肾动脉表面并用称重纸包裹血管，保持2分钟（图1D）。使用纱布保护周围组织，避免称量纸接触周围的肾脏和肠道。
   注意:苯酚溶液在塑料管中稳定，但在玻璃小瓶中不稳定。因此，必须为每个实验¹⁸新鲜制备溶液。
9. 对右肾动脉执行相同的程序。用浸入盐水中的称量纸进行假手术。
10. 将肌肉重新定位到其初始位置，并在中断缝合中用6-0 Vicryl缝合线关闭腹膜。然后，用中断的4-0尼龙缝合线闭合皮肤。监测所有小鼠，直到完全恢复。

4. 术后护理

1. 将聚维酮碘涂抹在切口上，并将动物放在加热的电热毯中以进行恢复和术后监测。
2. 每天监测小鼠两次，以评估发红，肿胀，疼痛或腹部感染。在RDN手术前约1小时和之后约24小时向所有小鼠提供美洛昔康（0.5mg / kg，SC）。

结果

统计学
所有数据均表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析用于具有三个或更多条件的实验，然后进行Bonferroni事后检验以比较各个组。将等于或小于 0.05 的 p 值视为显著性。使用商业软件进行所有统计分析。

RDN后，Ang II引起的血压升高减弱
在输注Ang II后1周观察到收缩压（SBP）显着升高。与Sham + Ang II组相比，RDN + Ang II组在RDN手术后21天显示SBP?...

讨论

自症状性HTN-3^试验7，25的阴性结果发表以来，RDN是否可以降低血压一直存在争议。然而，几项临床试验和动物实验已经证明了RDN对高血压^{人和动物的积极}有效结果9，¹⁰，¹¹，¹²，¹³，^14，15，¹⁶

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sangon Biotech	CAS:4474-91-3	To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody	Abcam	ab137869	To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure Analysis	Visitech Systems	BP-2000	Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pump	DURECT Corporation	CA 95014	To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA Kit	Abcam	ab287789	to measure renal norepinephrine levels
Phenol	Sangon Biotech	CAS:108-95-2	Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paper	Sangon Biotech	F512112	To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112.