Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Anjiyotensin II infüzyonu ile indüklenen hipertansiyonu olan farelerde renal sempatik denervasyon (RDN) için bir protokol sunuyoruz. Prosedür tekrarlanabilir, kullanışlıdır ve RDN'nin hipertansiyon ve kardiyak hipertrofi üzerindeki düzenleyici mekanizmalarını incelemeye izin verir.

Özet

Renal sempatik denervasyonun (RDN) kan basıncı üzerindeki faydaları son yıllarda çok sayıda klinik çalışmada kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, RDN'nin hipertansiyon üzerindeki düzenleyici mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, farelerde daha basit bir RDN modeli oluşturmak çok önemlidir. Bu çalışmada, Anjiyotensin II ile doldurulmuş ozmotik mini pompalar 14 haftalık C57BL/6 farelere implante edildi. Mini ozmotik pompanın implantasyonundan bir hafta sonra, fenol kullanılarak farelerin bilateral renal arterlerine modifiye RDN prosedürü uygulandı. Yaş-cinsiyet eşleştirilmiş farelere salin verildi ve sahte grup olarak görev yaptı. Kan basıncı başlangıçta ve daha sonra her hafta 21 gün boyunca ölçüldü. Daha sonra renal arter, abdominal aort ve kalp H&E ve Masson boyama kullanılarak histolojik inceleme için toplandı. Bu çalışmada, hipertansiyonu kontrol edebilen ve kardiyak hipertrofiyi hafifletebilen basit, pratik, tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış bir RDN modeli sunulmuştur. Bu teknik, renal arter hasarı olmadan periferik renal sempatik sinirleri denervate edebilir. Önceki modellerle karşılaştırıldığında, modifiye RDN, hipertansiyonun patobiyolojisi ve patofizyolojisinin incelenmesini kolaylaştırır.

Giriş

Hipertansiyon tüm dünyada önemli bir kronik kardiyovasküler hastalıktır. Kontrolsüz hipertansiyon hedef organlara zarar verebilir ve kalp yetmezliği, felç ve kronik böbrek hastalıklarına katkıda bulunabilir 1,2,3. Çin'de hipertansiyon prevalansı 1991-2007 yılları arasında %20'den %31'e yükselmiştir. Çin'de hipertansiyonu olan yetişkinlerin sayısı, hipertansiyon tanı kriterlerinin yakın zamanda gözden geçirilmesini takiben iki katına çıkabilir (130/80 mmHg)4. Hipertansiyon ilaçla kontrol edilebilir, ancak hastaların yaklaşık% 20'si, maksimum tolere edilen dozda en az üç antihipertansif ilaç (bir idrar söktürücü dahil) alırken bile hipertansiyonlarını kontrol edememektedir, bu da ilaca dirençli hipertansiyonun gelişmesine yol açabilir5.

Renal sempatik denervasyonun (RDN) hipertansiyon için potansiyel bir tedavi olduğu kanıtlanmıştır. 2009 yılında, Krum ve meslektaşları ilk kez RDN kullanarak dirençli hipertansiyon tedavisi bildirdiler. Perkütan renal arter ablasyonunun hastalarda kalıcı kan basıncı azalmasına etkili bir şekilde neden olabileceği bulunmuştur6. Bununla birlikte, Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) çalışmasının başarısızlığı, RDN7'nin uygulanmasını engelledi ve RDN'yi tartışmalı bir tedaviye dönüştürdü. Bununla birlikte, RDN olasılığı henüz göz ardı edilmemiştir. RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED / ON MED ve SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal dahil olmak üzere son klinik çalışmalar, RDN'nin hipertansiyon üzerindeki etkinliğini doğrulamıştır 8,9,10,11,12. Bu nedenle, RDN'nin etkilerini araştırmak için daha ayrıntılı mekanik araştırmalar yapılmalıdır.

Bu çalışmanın genel amacı, farelerde RDN'nin daha basit ve daha stabil bir cerrahi üretmek için nasıl değiştirilebileceğini göstermektir. Çok sayıda deney, intravasküler kriyoablasyon, ekstrakorporeal ultrason ve farklı hayvan modellerinde kimyasal veya nörotoksinin lokal uygulaması gibi RDN'nin çeşitli yaklaşımlarını incelemiştir 13,14,15,16,17. Fenol ile kimyasal ablasyon kullanılarak oluşturulan RDN modeli, hipertansiyon üzerine sempatik aktivasyonun patogenezini incelemek için iyi kurulmuş bir deneysel modeldir. Bu model, bir pamuklu çubuk18 kullanarak% 10 fenol / etanol çözeltisi ile renal sempatik sinirlerin kimyasal korozyonu ile üretilir. Bir yandan, konvansiyonel RDN potansiyel olarak renal sempatik aktiviteyi inhibe eder, bu da renin sekresyonunu ve sodyum reabsorpsiyonunu azaltır ve böbrek kan akışını arttırır. Öte yandan, renin-anjiyotensin-aldosteron sistemi19'u baskılar. Bu nedenle, RDN'nin hipertansiyon üzerinde yararlı bir etkisi vardır. Bununla birlikte, kimyasal ablasyon üretilen RDN modelinde ablasyon kriterleri ve ablasyon süresi yoktur ve deneysel prosedürün detayları henüz belirsizdir. Ayrıca, teknik rapor bulunmamaktadır. Bu yazıda, C57BL/6 farelerde Anjiyotensin II (Ang II) kaynaklı hipertansiyonda tartım kağıdı kullanılarak fenol ile RDN modelinin oluşturulması için cerrahi bir protokol tanımlanmıştır. Renal arteri fenol içeren tartım kağıdı ile sarıyoruz ve daha tekrarlanabilir, güvenilir bir RDN modeli oluşturmaya yardımcı olan ablasyon süresini birleştiriyoruz. Bu deneysel modelde RDN'nin hipertansiyon üzerine etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

Protokol

Tüm hayvan deney prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için ilgili etik Kılavuza (NIH Yayın no. 85-23, revize edilmiş 2011) uymuş ve Fudan Üniversitesi'ne bağlı Huadong Hastanesi'nin hayvan araştırmaları komiteleri tarafından onaylanmıştır. On dört haftalık erkek C57BL/6 fareler (28-30g) rastgele dört gruba ayrıldı: Sham grubu, Sham + Ang II grubu, RDN grubu, RDN + Ang II grubu, her grupta n = 6. Tüm hayvanlar, 12 saat açık / karanlık döngüsü ve standart kemirgen chow ve su ad libitumuna serbest erişim ile 24 ± 1 ° C'de sıcaklık kontrollü bir odada belirli kapalı patojensiz koşullar altında muhafaza edildi.

1. Operasyon alanının hazırlanması

  1. Ameliyat masasını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Isıtma yastığı sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
  2. Tüm cerrahi aletlerin ameliyattan önce 121 ° C'de 30 dakika veya başka yöntemlerle sterilize edildiğinden emin olun. Bu prosedür mikro cerrahi makas, iki ince düz forseps, iki ince kavisli forseps, hemostatik forseps, steril gazlı bezler ve tartım kağıtları gerektirir.

2. Anjiyotensin II'ye bağlı hipertansiyon

  1. Anestezi indüksiyonundan kısa bir süre önce C57BL / 6 farelere meloksikam (0.5 mg / kg, SC) sağlayın. Daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi sodyum pentobarbital enjeksiyon kullanarak fareleri anestezi altına alın20,21. Tercih edilirse izofluran da kullanılabilir. Anestezi derinliğini negatif bir ayak parmağı sıkışma refleksi ile onaylayın.
  2. Arkadaki saçları tıraş makinesiyle çıkarın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem uygulayın.
  3. Hayvanı sırt pozisyonunda bir ameliyat masasına yerleştirin. Tıraş edilen bölgeyi povidon-iyot ile sürünceme, ardından %70 etanol ile üç mendil silin.
  4. Ön bacağın omuz bıçağı üzerinde kulağın arkasında, kuyruğa dik steril bir neşter bıçağı kullanarak 1 cm'lik bir kesi yapın.
  5. Cildin altında deri altı tüneli oluşturmak için steril bir hemostat kullanın ve pompa22 için bir cep oluşturun. Cebe nazikçe Anjiyotensin II (1.000 ng / kg / dak) ile doldurulmuş bir ozmotik pompa yerleştirin. Cildi germeden yarayı dikmek için yeterli boş alan olduğundan emin olun.
  6. Kesilen 6-0 Vicryl dikişlerle kası dikin ve kesilen 4-0 naylon dikişlerle cildi kapatın. Yara bölgesini povidon-iyot ile silin ve silin. Kontrol grubu için eşit miktarda salin ile aynı ameliyatı yapın.
  7. Tüm cerrahi aletleri 10 sn'lik bir sterilizatöre yerleştirin ve ameliyatlar arasında steril eldivenleri değiştirin. Tamamen iyileşene kadar tüm fareleri izleyin.
  8. Farelerde yara iyileşmesini ilk hafta boyunca günde en az iki kez ve daha sonra kızarıklık, şişlik ve enfeksiyon dahil olmak üzere her gün bir kez yakından izleyin ve gözlemleyin. Ang II infüzyonu sırasında fareler ölürse hemen diseksiyon yapın.
  9. Bilinçli farelerde kuyruk manşeti pletismografi yöntemi23 ile Ang II infüzyonundan sonra başlangıçta ve her hafta kan basıncını ölçün. Kan basıncı ölçüm deneylerinin, deney başlamadan önce farelerin 1 saat boyunca iklimlendirildiği 22 ± 2 ° C'de sessiz bir alanda yapıldığından emin olun. Fareleri, temel kan basıncı ölçümleri23,24'ten önce en az 5 gün üst üste alışkanlık haline getirin.

3. İki taraflı renal denervasyon

  1. Ang II infüzyonundan 1 hafta sonra yüksek kan basıncı (BP) ≥140/90mmHg veya sistolik BP / diyastolik BP'de% 25 artış olan fareleri seçin.
  2. Ameliyattan önce hayvan ağırlığını kaydedin ve böbrek denervasyon ameliyatı için minimum 24 g ağırlığa sahip hayvanları seçin.
  3. Sodyum pentobarbital kullanarak fareleri anestezi altına alın. Anestezi derinliğini negatif bir ayak parmağı sıkışma refleksi ile onaylayın.
  4. Karındaki saçları tıraş makinesiyle çıkarın. Herhangi bir cerrahi kontaminasyonu önlemek için bu prosedürü dikkatli ve kapsamlı bir şekilde uygulayın.
  5. Fareleri ameliyat masasına yerleştirin, karnı yukarıda tutun ve uzuvlarını bantla sabitleyin. Karın derisini povidon-iyot ile dezenfekte edin, ardından %70 etanol ile üç mendil uygulayın.
  6. Neşter bıçağı kullanarak 2 cm'lik ventral orta hat karın kesisi yapın. Sol renal arteri açığa çıkarmak için 37 °C saline batırılmış gazlı bezle bağırsağı geri çekin. Kavisli cımbız kullanarak yağları dikkatli ama açık bir şekilde renal arterden uzaklaştırın. (Şekil 1A-C).
  7. Tartım kağıdını steril keskin makasla renal arterle aynı boyutta bir dikdörtgen halinde kesin. Referans olarak, tartım kağıdını Şekil 1C'deki noktalı çizgide gösterilenle aynı boyutta kesin.
    NOT: Ameliyatın kritik bir parçasıdır, aynı şekli korumak için tartım kağıdının birkaç parçasını aynı anda kesmeye çalışın.
  8. Tartım kağıdını %10 fenol/etanol çözeltisine en az 30 saniye batırın. Sol renal arterin yüzeyini örtün ve damarı tartım kağıdıyla sarın, 2 dakika bekletin (Şekil 1D). Tartım kağıdının çevredeki böbrek ve bağırsağa temas etmesini önlemek için çevredeki dokuları korumak için gazlı bez kullanın.
    NOT: Fenol çözeltisi plastik tüplerde kararlıdır, ancak cam şişelerde stabil değildir. Bu nedenle, çözelti her deney için taze olarak hazırlanmalıdır18.
  9. Sağ renal arter için aynı prosedürü uygulayın. Sahte ameliyatı tuzlu suya batırılmış tartım kağıdıyla gerçekleştirin.
  10. Kasları başlangıç pozisyonlarına yeniden yerleştirin ve peritonu, kesilmiş bir dikişte 6-0 Vicryl sütürle kapatın. Ardından, cildi kesilmiş 4-0 naylon dikişlerle kapatın. Tamamen iyileşene kadar tüm fareleri izleyin.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. Kesiye povidon-iyot uygulayın ve iyileşme ve ameliyat sonrası izleme için hayvanı ısıtılmış bir elektrikli battaniyeye yerleştirin.
  2. Kızarıklık, şişlik ve ağrı veya karın enfeksiyonu açısından değerlendirmek için fareleri günde iki kez izleyin. RDN prosedüründen yaklaşık 1 saat önce ve 24 saat sonra tüm farelere meloksikam (0.5 mg / kg, SC) sağlayın.

Sonuçlar

İstatistik
Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. Üç veya daha fazla koşullu deneyler için tek yönlü ANOVA kullanıldı ve ardından bireysel gruplar arasındaki karşılaştırmalar için Bonferroni posthoc testleri yapıldı. 0,05'e eşit veya daha küçük bir p değerini anlamlı olarak düşünün. Tüm istatistiksel analizleri yapmak için ticari bir yazılım kullanıldı.

Ang II tarafından indüklenen kan basıncındaki artış,...

Tartışmalar

RDN'nin kan basıncını düşürüp düşüremeyeceği, HTN-3 semplikasyon denemesinin negatif sonucunun yayınlanmasından bu yana tartışmalı hale gelmiştir 7,25. Bununla birlikte, çeşitli klinik çalışmalar ve hayvan deneyleri, RDN'nin hipertansif insanlar ve hayvanlar üzerinde olumlu ve etkili sonuçlarını göstermiştir 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Açıklamalar

Yazarlar tarafından beyan edildiği gibi finansal veya başka türlü çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81770420), Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (20140900600), Şangay Anahtar Klinik Geriatrik Tıp Laboratuvarı (13dz2260700), Şangay Belediyesi Anahtar Klinik Uzmanlığı (shslczdzk02801) ve geriatrik koroner arter hastalığı Merkezi, Fudan Üniversitesi'ne Bağlı Huadong Hastanesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Angiotensin IISangon BiotechCAS:4474-91-3To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibodyAbcamab137869To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure AnalysisVisitech SystemsBP-2000Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pumpDURECT CorporationCA 95014To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA KitAbcamab287789to measure renal norepinephrine levels
PhenolSangon BiotechCAS:108-95-2Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paperSangon BiotechF512112To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 

Referanslar

  1. Messerli, F. H., Rimoldi, S. F., Bangalore, S. The transition from hypertension to heart failure: Contemporary update. JACC Heart Failure. 5 (8), 543-551 (2017).
  2. Lackland, D. T., et al. Implications of recent clinical trials and hypertension guidelines on stroke and future cerebrovascular research. Stroke. 49 (3), 772-779 (2018).
  3. Rossignol, P., et al. The double challenge of resistant hypertension and chronic kidney disease. The Lancet. 386 (10003), 1588-1598 (2015).
  4. Du, X., Patel, A., Anderson, C. S., Dong, J., Ma, C. Epidemiology of cardiovascular disease in China and opportunities for improvement. JACC International. Journal of the American College of Cardiology. 73 (24), 3135-3147 (2019).
  5. Valenzuela, P. L., et al. Lifestyle interventions for the prevention and treatment of hypertension. Nature Review Cardiology. 18 (4), 251-275 (2021).
  6. Krum, H., et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study. The Lancet. 373 (9671), 1275-1281 (2009).
  7. Bhatt, D. L., et al. A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension. The New England Journal of Medicine. 370 (15), 1393-1401 (2014).
  8. Kjeldsen, S. E., Narkiewicz, K., Burnier, M., Oparil, S. Renal denervation achieved by endovascular delivery of ultrasound in RADIANCE-HTN SOLO or by radiofrequency energy in SPYRAL HTN-OFF and SPYRAL-ON lowers blood pressure. Blood Press. 27 (4), 185-187 (2018).
  9. Böhm, M., et al. Efficacy of catheter-based renal denervation in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal): a multicentre, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 395 (10234), 1444-1451 (2020).
  10. Azizi, M., et al. Endovascular ultrasound renal denervation to treat hypertension (RADIANCE-HTN SOLO): a multicentre, international, single-blind, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 391 (10137), 2335-2345 (2018).
  11. Kandzari, D. E., et al. Effect of renal denervation on blood pressure in the presence of antihypertensive drugs: 6-month efficacy and safety results from the SPYRAL HTN-ON MED proof-of-concept randomised trial. The Lancet. 391 (10137), 2346-2355 (2018).
  12. Townsend, R. R., et al. Catheter-based renal denervation in patients with uncontrolled hypertension in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED): a randomised, sham-controlled, proof-of-concept trial. The Lancet. 390 (10108), 2160-2170 (2017).
  13. Sun, X., et al. Renal denervation restrains the inflammatory response in myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Research in Cardiology. 115 (2), 15 (2020).
  14. Sharp, T. E., et al. Renal denervation prevents heart failure progression via inhibition of the renin-angiotensin system. Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2609-2621 (2018).
  15. Wang, H., et al. Renal denervation attenuates progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice independent of blood pressure lowering. Hypertension. 65 (4), 758-765 (2015).
  16. Chen, H., et al. Renal denervation mitigates atherosclerosis in ApoE-/- mice via the suppression of inflammation. American Journal of Translational Research. 12 (9), 5362-5380 (2020).
  17. Wang, Y., et al. Renal denervation promotes atherosclerosis in hypertensive apolipoprotein E-deficient mice infused with Angiotensin II. Frontiers in Physiology. 8, 215 (2017).
  18. Eriguchi, M., Tsuruya, K. Renal sympathetic denervation in rats. Methods in Molecular Biology. 1397, 45-52 (2016).
  19. Thukkani, A. K., Bhatt, D. L. Renal denervation therapy for hypertension. Circulation. 128 (20), 2251-2254 (2013).
  20. Zhang, Y. J., et al. NAD(+) administration decreases microvascular damage following cardiac ischemia/reperfusion by restoring autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 115 (5), 57 (2020).
  21. Wang, M., et al. Long-term renal sympathetic denervation ameliorates renal fibrosis and delays the onset of hypertension in spontaneously hypertensive rats. American Journal of Translational Research. 10 (12), 4042-4053 (2018).
  22. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e53191 (2015).
  23. Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
  24. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1291 (2009).
  25. Esler, M. Illusions of truths in the Symplicity HTN-3 trial: generic design strengths but neuroscience failings. Journal of the American Society of Hypertension. 8 (8), 593-598 (2014).
  26. Han, W., et al. Low-dose sustained-release deoxycorticosterone acetate-induced hypertension in Bama miniature pigs for renal sympathetic nerve denervation. Journal of the American Society of Hypertension. 11 (5), 314-320 (2017).
  27. Han, W., et al. The safety of renal denervation as assessed by optical coherence tomography: pre- and post-procedure comparison with multi-electrode ablation catheter in animal experiment. Hellenic Journal of Cardiology. 61 (3), 190-196 (2020).
  28. Cai, X., et al. Noninvasive stereotactic radiotherapy for renal denervation in a swine model. Journal of the American College of Cardiology. 74 (13), 1697-1709 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 183RDNhipertansiyonanjiyotensin IIfenolozmotik pompakardiyak hipertrofi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır