JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол почечной симпатической денервации (RDN) у мышей с гипертонией, вызванной инфузией ангиотензина II. Процедура повторяема, удобна и позволяет изучить регуляторные механизмы РДН при гипертонии и гипертрофии сердца.

Аннотация

Преимущества почечной симпатической денервации (RDN) на артериальное давление были доказаны в большом количестве клинических испытаний в последние годы. Однако регуляторный механизм RDN по гипертонии остается неуловимым. Таким образом, важно установить более простую модель RDN на мышах. В этом исследовании осмотические мини-насосы, заполненные ангиотензином II, были имплантированы 14-недельным мышам C57BL/6. Через неделю после имплантации мини-осмотического насоса на двусторонних почечных артериях мышей с использованием фенола была проведена модифицированная процедура RDN. Мышам, соответствующим половому признаку, давали физиологический раствор и служили в качестве фиктивной группы. Артериальное давление измеряли на исходном уровне и каждую неделю впоследствии в течение 21 дня. Затем почечная артерия, брюшная аорта и сердце были собраны для гистологического исследования с использованием окрашивания H&E и Masson. В этом исследовании мы представляем простую, практичную, повторяемую и стандартизированную модель RDN, которая может контролировать гипертонию и облегчать гипертрофию сердца. Методика позволяет денервировать периферические почечные симпатические нервы без повреждения почечной артерии. По сравнению с предыдущими моделями, модифицированный RDN облегчает изучение патобиологии и патофизиологии гипертонии.

Введение

Гипертония является основным хроническим сердечно-сосудистым заболеванием во всем мире. Неконтролируемая гипертония может повредить органы-мишени и способствовать сердечной недостаточности, инсульту и хроническим заболеваниям почек 1,2,3. Распространенность гипертонии увеличилась с 20% до 31% в период с 1991 по 2007 год в Китае. Число взрослых с гипертонией в Китае может удвоиться после недавнего пересмотра диагностических критериев гипертонии (130/80 мм рт.ст.)4. Гипертонию можно контролировать медикаментозно, однако примерно 20% пациентов не в состоянии контролировать свою гипертензию даже при приеме не менее трех гипотензивных препаратов (в том числе одного мочегонного) в максимально переносимой дозе, что может привести к развитию лекарственно-устойчивой гипертензии5.

Было доказано, что почечная симпатическая денервация (RDN) является потенциальным средством лечения гипертонии. В 2009 году Крум и его коллеги впервые сообщили о лечении резистентной гипертонии с использованием RDN. Установлено, что чрескожная абляция почечной артерии может эффективно вызывать стойкое снижение артериального давления у пациентов6. Однако неудача исследования Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) препятствовала применению RDN7, превращая RDN в спорную терапию. Тем не менее, перспектива РДН пока не исключена. Недавние клинические испытания, в том числе RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED и SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal подтвердили эффективность RDN при гипертонии 8,9,10,11,12. Таким образом, необходимо провести более подробные механистические исследования для изучения эффектов RDN.

Общая цель этого исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать, как RDN у мышей может быть модифицирован для получения более простой и стабильной операции. В большом количестве экспериментов изучались различные подходы РДН, такие как внутрисосудистая криоабляция, экстракорпоральное ультразвуковое исследование и местное применение химического вещества или нейротоксина на разных животных моделях 13,14,15,16,17. Модель RDN, сгенерированная с использованием химической абляции фенолом, является хорошо зарекомендовавшей себя экспериментальной моделью для изучения патогенеза симпатической активации при гипертонии. Данная модель генерируется химической коррозией почечных симпатических нервов 10% раствором фенола/этанола с использованием ватного тампона18. С одной стороны, обычный RDN потенциально ингибирует симпатическую активность почек, что затем уменьшает секрецию ренина и реабсорбцию натрия, а также увеличивает почечный кровоток. С другой стороны, он подавляет ренин-ангиотензин-альдостероновую систему19. Таким образом, РДН благотворно влияет на гипертонию. Однако в модели RDN, генерируемой химической абляцией, отсутствуют критерии абляции и время абляции, а детали экспериментальной процедуры пока неясны. Кроме того, отсутствуют технические отчеты. В этом отчете мы описываем хирургический протокол для генерации модели RDN с фенолом с использованием весовой бумаги в ангиотензине II (Ang II), индуцированной гипертонией у мышей C57BL/6. Мы оборачиваем почечную артерию бумагой для взвешивания, содержащей фенол, и унифицируем время абляции, что помогает установить более воспроизводимую, надежную модель RDN. Данная экспериментальная модель направлена на оценку влияния RDN на гипертонию.

протокол

Все экспериментальные процедуры на животных соответствовали соответствующему этическому руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию (публикация NIH No 85-23, пересмотрена в 2011 году) и были одобрены комитетами по исследованиям на животных больницы Хуадун, связанной с Фуданьским университетом. Четырнадцатинедельные самцы мышей C57BL/6 (28-30 г) были случайным образом разделены на четыре группы: группа Sham, группа Sham+Ang II, группа RDN, группа RDN+Ang II, n = 6 в каждой группе. Все животные содержались в определенных закрытых условиях без патогенов в помещении с контролируемой температурой при 24 ± 1 ° C с 12-часовым циклом света / темноты и свободным доступом к стандартному чау-чау грызунов и воде ad libitum.

1. Подготовка операционного поля

  1. Продезинфицируйте операционный стол 70% этанолом. Отрегулируйте температуру грелки до 37 °C.
  2. Убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизованы перед операцией при 121 °C в течение 30 минут или другими методами. Для этой процедуры требуются микрохирургические ножницы, два тонких прямых щипца, два тонких изогнутых щипца, гемостатические щипцы, стерильные марли и бумаги для взвешивания.

2. Ангиотензин II индуцированная гипертония

  1. Обеспечивают мелоксикам (0,5 мг/кг, SC) мышам C57BL/6 незадолго до индукции анестезии. Затем обезболивают мышей с помощью инъекций пентобарбитала натрия, как описано ранее20,21. Изофлуран также может быть использован, если это предпочтительно. Подтвердите глубину анестезии отрицательным рефлексом защемления пальца ноги.
  2. Удалите волосы на спине бритвой. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Поместите животное на операционный стол в спинное положение. Смазать и протереть выбритый участок повидоном-йодом с последующим тремя салфетками с 70% этанолом.
  4. Сделайте разрез 1 см с помощью стерильного лезвия скальпеля, перпендикулярного хвосту, за ухом над лопаткой передней ноги.
  5. Используйте стерильный гемостат, чтобы сделать подкожный туннель под кожей и создать карман для насоса22. Осторожно вставьте осмотический насос, наполненный ангиотензином II (1000 нг/кг/мин), в карман. Убедитесь, что есть достаточно свободного места для зашивания раны, не растягивая кожу.
  6. Зашить мышцу прерванными 6-0 викрильными швами и закрыть кожу прерванными 4-0 нейлоновыми швами. Процедить и протереть место раны повидоном-йодом. Выполните ту же операцию с равным объемом физиологического раствора для контрольной группы.
  7. Поместите все хирургические инструменты в стерилизатор на 10 секунд и замените стерильные перчатки между операциями. Контролируйте всех мышей до полного выздоровления.
  8. Внимательно следите и наблюдайте за заживлением ран у мышей, по крайней мере, два раза в день в течение первой недели и один раз в день впоследствии, включая покраснение, отек и инфекцию. Немедленно выполните рассечение, если мыши погибают во время инфузии Ang II.
  9. Измеряют артериальное давление на исходном уровне и каждую неделю после инфузии Ang II с помощью метода плетизмографии хвостовой манжеты23 у сознательных мышей. Убедитесь, что эксперименты по измерению артериального давления проводятся в тихом месте, при 22 ± 2 °C, где мыши акклиматизируются в течение 1 часа до начала эксперимента. Привыкайте мышей в течение не менее 5 дней подряд до измерения исходного артериального давления23,24.

3. Двусторонняя почечная денервация

  1. Выберите мышей с повышенным артериальным давлением (АД) ≥140/90 мм рт.ст. или 25% увеличением систолического АД/диастолического АД через 1 неделю после инфузии Ang II.
  2. Запишите вес животных перед операцией и выберите животных с минимальным весом 24 г для операции по почечной денервации.
  3. Обезболивают мышей с помощью пентобарбитала натрия. Подтвердите глубину анестезии отрицательным рефлексом защемления пальца ноги.
  4. Удалите волосы на животе бритвой. Выполняйте эту процедуру осторожно и тщательно, чтобы избежать хирургического загрязнения.
  5. Поместите мышей на операционный стол, держа брюшко вверх и зафиксируйте его конечности скотчем. Продезинфицируйте кожу живота повидоном-йодом с последующим тремя салфетками с 70% этанолом.
  6. Сделайте 2-сантиметровый вентральный разрез средней линии живота с помощью лезвия скальпеля. Оттяните кишечник марлей, пропитанной физиологическим раствором при 37 °C, чтобы обнажить левую почечную артерию. Осторожно, но тупо рассекают жир от почечной артерии с помощью изогнутого пинцета. (Рисунок 1А-С).
  7. Разрежьте бумагу для взвешивания на прямоугольник такого же размера, как почечная артерия, стерильными острыми ножницами. Для справки вырежьте бумагу для взвешивания в том же размере, что показано пунктирной линией на рисунке 1С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это важная часть операции, попробуйте разрезать несколько кусочков бумаги для взвешивания за раз, чтобы сохранить одинаковую форму.
  8. Окуните бумагу для взвешивания в 10% раствор фенола/этанола на срок не менее 30 с. Накройте поверхность левой почечной артерии и оберните сосуд бумагой для взвешивания, держите в течение 2 мин (рисунок 1D). Используйте марлю для защиты окружающих тканей, чтобы бумага для взвешивания не касалась окружающих почек и кишечника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор фенола стабилен в пластиковых тубах, но не в стеклянных флаконах. Поэтому раствор должен быть свежеприготовленным для каждого эксперимента18.
  9. Выполните ту же процедуру для правой почечной артерии. Выполните фиктивную операцию с помощью бумаги для взвешивания, погруженной в физиологический раствор.
  10. Переведите мышцы в исходное положение и закройте брюшину 6-0 викрильным швом в прерванном шве. Затем закройте кожу прерванными 4-0 нейлоновыми швами. Контролируйте всех мышей до полного выздоровления.

4. Послеоперационный уход

  1. Нанесите повидон-йод на разрез и поместите животное в подогретое электрическое одеяло для восстановления и послеоперационного наблюдения.
  2. Контролируйте мышей два раза в день, чтобы оценить покраснение, отек и боль или абдоминальную инфекцию. Назначают мелоксикам (0,5 мг/кг, SC) всем мышам примерно за 1 ч до и 24 ч после процедуры RDN.

Результаты

Статистика
Все данные выражаются как среднее ± стандартного отклонения. Односторонняя ANOVA использовалась для экспериментов с тремя или более условиями, за которыми следовали тесты Bonferroni posthoc для сравнения между отдельными группами. Рассмотрим p-значение, равное или меньшее 0...

Обсуждение

Вопрос о том, может ли RDN снизить артериальное давление, стал спорным с момента публикации отрицательного результата исследования симплицитности HTN-3 7,25. Тем не менее, несколько клинических испытаний и экспериментов на животных продемонстрировали положи...

Раскрытие информации

Не существует конфликта интересов, финансовых или иных, как заявлено авторами.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81770420), Комиссией по науке и технике муниципалитета Шанхая (20140900600), Шанхайской ключевой лабораторией клинической гериатрической медицины (13dz2260700), Шанхайской муниципальной ключевой клинической специальностью (shslczdzk02801) и Центром гериатрической болезни коронарной артерии больницы Хуадун, аффилированной с Фуданьским университетом.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Angiotensin IISangon BiotechCAS:4474-91-3To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibodyAbcamab137869To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure AnalysisVisitech SystemsBP-2000Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pumpDURECT CorporationCA 95014To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA KitAbcamab287789to measure renal norepinephrine levels
PhenolSangon BiotechCAS:108-95-2Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paperSangon BiotechF512112To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 

Ссылки

  1. Messerli, F. H., Rimoldi, S. F., Bangalore, S. The transition from hypertension to heart failure: Contemporary update. JACC Heart Failure. 5 (8), 543-551 (2017).
  2. Lackland, D. T., et al. Implications of recent clinical trials and hypertension guidelines on stroke and future cerebrovascular research. Stroke. 49 (3), 772-779 (2018).
  3. Rossignol, P., et al. The double challenge of resistant hypertension and chronic kidney disease. The Lancet. 386 (10003), 1588-1598 (2015).
  4. Du, X., Patel, A., Anderson, C. S., Dong, J., Ma, C. Epidemiology of cardiovascular disease in China and opportunities for improvement. JACC International. Journal of the American College of Cardiology. 73 (24), 3135-3147 (2019).
  5. Valenzuela, P. L., et al. Lifestyle interventions for the prevention and treatment of hypertension. Nature Review Cardiology. 18 (4), 251-275 (2021).
  6. Krum, H., et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study. The Lancet. 373 (9671), 1275-1281 (2009).
  7. Bhatt, D. L., et al. A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension. The New England Journal of Medicine. 370 (15), 1393-1401 (2014).
  8. Kjeldsen, S. E., Narkiewicz, K., Burnier, M., Oparil, S. Renal denervation achieved by endovascular delivery of ultrasound in RADIANCE-HTN SOLO or by radiofrequency energy in SPYRAL HTN-OFF and SPYRAL-ON lowers blood pressure. Blood Press. 27 (4), 185-187 (2018).
  9. Böhm, M., et al. Efficacy of catheter-based renal denervation in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal): a multicentre, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 395 (10234), 1444-1451 (2020).
  10. Azizi, M., et al. Endovascular ultrasound renal denervation to treat hypertension (RADIANCE-HTN SOLO): a multicentre, international, single-blind, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 391 (10137), 2335-2345 (2018).
  11. Kandzari, D. E., et al. Effect of renal denervation on blood pressure in the presence of antihypertensive drugs: 6-month efficacy and safety results from the SPYRAL HTN-ON MED proof-of-concept randomised trial. The Lancet. 391 (10137), 2346-2355 (2018).
  12. Townsend, R. R., et al. Catheter-based renal denervation in patients with uncontrolled hypertension in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED): a randomised, sham-controlled, proof-of-concept trial. The Lancet. 390 (10108), 2160-2170 (2017).
  13. Sun, X., et al. Renal denervation restrains the inflammatory response in myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Research in Cardiology. 115 (2), 15 (2020).
  14. Sharp, T. E., et al. Renal denervation prevents heart failure progression via inhibition of the renin-angiotensin system. Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2609-2621 (2018).
  15. Wang, H., et al. Renal denervation attenuates progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice independent of blood pressure lowering. Hypertension. 65 (4), 758-765 (2015).
  16. Chen, H., et al. Renal denervation mitigates atherosclerosis in ApoE-/- mice via the suppression of inflammation. American Journal of Translational Research. 12 (9), 5362-5380 (2020).
  17. Wang, Y., et al. Renal denervation promotes atherosclerosis in hypertensive apolipoprotein E-deficient mice infused with Angiotensin II. Frontiers in Physiology. 8, 215 (2017).
  18. Eriguchi, M., Tsuruya, K. Renal sympathetic denervation in rats. Methods in Molecular Biology. 1397, 45-52 (2016).
  19. Thukkani, A. K., Bhatt, D. L. Renal denervation therapy for hypertension. Circulation. 128 (20), 2251-2254 (2013).
  20. Zhang, Y. J., et al. NAD(+) administration decreases microvascular damage following cardiac ischemia/reperfusion by restoring autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 115 (5), 57 (2020).
  21. Wang, M., et al. Long-term renal sympathetic denervation ameliorates renal fibrosis and delays the onset of hypertension in spontaneously hypertensive rats. American Journal of Translational Research. 10 (12), 4042-4053 (2018).
  22. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e53191 (2015).
  23. Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
  24. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1291 (2009).
  25. Esler, M. Illusions of truths in the Symplicity HTN-3 trial: generic design strengths but neuroscience failings. Journal of the American Society of Hypertension. 8 (8), 593-598 (2014).
  26. Han, W., et al. Low-dose sustained-release deoxycorticosterone acetate-induced hypertension in Bama miniature pigs for renal sympathetic nerve denervation. Journal of the American Society of Hypertension. 11 (5), 314-320 (2017).
  27. Han, W., et al. The safety of renal denervation as assessed by optical coherence tomography: pre- and post-procedure comparison with multi-electrode ablation catheter in animal experiment. Hellenic Journal of Cardiology. 61 (3), 190-196 (2020).
  28. Cai, X., et al. Noninvasive stereotactic radiotherapy for renal denervation in a swine model. Journal of the American College of Cardiology. 74 (13), 1697-1709 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183II

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены