Verbesserte renale Denervierung milderte Hypertonie durch Angiotensin-II-Infusion

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die renale sympathische Denervierung (RDN) bei Mäusen mit Bluthochdruck vor, die durch Angiotensin-II-Infusion induziert wurde. Das Verfahren ist wiederholbar, bequem und ermöglicht es, die Regulationsmechanismen von RDN bei Bluthochdruck und Herzhypertrophie zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Vorteile der renalen sympathischen Denervierung (RDN) auf den Blutdruck wurden in einer Vielzahl von klinischen Studien in den letzten Jahren nachgewiesen. Der Regulierungsmechanismus von RDN bei Bluthochdruck bleibt jedoch schwer fassbar. Daher ist es wichtig, ein einfacheres RDN-Modell in Mäusen zu etablieren. In dieser Studie wurden osmotische Minipumpen, die mit Angiotensin II gefüllt waren, in 14 Wochen alte C57BL/6-Mäuse implantiert. Eine Woche nach der Implantation der Mini-osmotischen Pumpe wurde ein modifiziertes RDN-Verfahren an bilateralen Nierenarterien der Mäuse mit Phenol durchgeführt. Altersgeschlechtliche Mäuse erhielten Kochsalzlösung und dienten als Scheingruppe. Der Blutdruck wurde zu Studienbeginn und danach jede Woche für 21 Tage gemessen. Dann wurden Nierenarterie, Bauchaorta und Herz zur histologischen Untersuchung mit H & E- und Masson-Färbung gesammelt. In dieser Studie präsentieren wir ein einfaches, praktisches, wiederholbares und standardisiertes RDN-Modell, das Bluthochdruck kontrollieren und Herzhypertrophie lindern kann. Die Technik kann periphere renale Sympathikusnerven ohne Nierenarterienschädigung denervieren. Im Vergleich zu früheren Modellen erleichtert das modifizierte RDN die Untersuchung der Pathobiologie und Pathophysiologie der Hypertonie.

Einleitung

Bluthochdruck ist eine schwere chronische Herz-Kreislauf-Erkrankung auf der ganzen Welt. Unkontrollierte Hypertonie könnte Zielorgane schädigen und zu Herzinsuffizienz, Schlaganfall und chronischen Nierenerkrankungen beitragen ^1,2,3. Die Prävalenz von Bluthochdruck ist zwischen 1991 und 2007 in China von 20% auf 31% gestiegen. Die Zahl der Erwachsenen mit Bluthochdruck in China könnte sich nach einer kürzlich erfolgten Überarbeitung der diagnostischen Kriterien für Bluthochdruck (130/80 mmHg)⁴ verdoppeln. Hypertonie kann durch Medikamente kontrolliert werden, jedoch sind etwa 20% der Patienten nicht in der Lage, ihre Hypertonie zu kontrollieren, selbst wenn sie mindestens drei blutdrucksenkende Medikamente (einschließlich eines Diuretikums) in maximal verträglicher Dosis erhalten, was zur Entwicklung einer arzneimittelresistenten Hypertonie führen kann⁵.

Die renale sympathische Denervierung (RDN) hat sich als mögliche Behandlung von Bluthochdruck erwiesen. Im Jahr 2009 berichteten Krum und Kollegen erstmals über eine resistente Hypertoniebehandlung mit RDN. Es wurde festgestellt, dass eine perkutane Nierenarterienablation bei Patienten eine anhaltende Blutdrucksenkung bewirken kann⁶. Das Scheitern der Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) -Studie behinderte jedoch die Anwendung von RDN⁷ und machte RDN zu einer umstrittenen Therapie. Dennoch ist die Aussicht auf RDN noch nicht ausgeschlossen. Jüngste klinische Studien, darunter RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED und SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal, haben die Wirksamkeit von RDN bei Bluthochdruck 8,9,10,11,12 bestätigt. Daher müssen detailliertere mechanistische Untersuchungen durchgeführt werden, um die Auswirkungen von RDN zu untersuchen.

Der Hauptzweck dieser Studie ist es, zu zeigen, wie RDN in Mäusen modifiziert werden kann, um eine einfachere und stabilere Operation zu erzeugen. Eine große Anzahl von Experimenten hat verschiedene Ansätze der RDN untersucht, wie intravaskuläre Kryoablation, extrakorporalen Ultraschall und lokale Anwendung einer Chemikalie oder eines Neurotoxins in verschiedenen Tiermodellen 13,14,15,16,17. Das RDN-Modell, das durch chemische Ablation mit Phenol erzeugt wird, ist ein etabliertes experimentelles Modell zur Untersuchung der Pathogenese der sympathischen Aktivierung bei Bluthochdruck. Dieses Modell wird durch chemische Korrosion der Nierensympathikusnerven mit 10% Phenol/Ethanol-Lösung unter Verwendung eines Wattestäbchens¹⁸ erzeugt. Auf der einen Seite hemmt das konventionelle RDN möglicherweise die renale sympathische Aktivität, was dann die Reninsekretion und die Natriumresorption verringert und den renalen Blutfluss erhöht. Auf der anderen Seite unterdrückt es das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System¹⁹. Dadurch wirkt sich RDN positiv auf Bluthochdruck aus. Dem durch chemische Ablation erzeugten RDN-Modell fehlen jedoch Ablationskriterien und Ablationszeit, und die Details des experimentellen Verfahrens sind noch unklar. Es liegen auch keine technischen Berichte vor. In diesem Bericht beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll für die Erzeugung eines RDN-Modells mit Phenol unter Verwendung von Wiegepapier bei Angiotensin II (Ang II) induzierter Hypertonie bei C57BL/6-Mäusen. Wir wickeln die Nierenarterie mit phenolhaltigem Wiegepapier ein und vereinheitlichen die Ablationszeit, was dazu beiträgt, ein reproduzierbareres, zuverlässigeres RDN-Modell zu erstellen. Dieses experimentelle Modell zielt darauf ab, die Wirkung von RDN auf Bluthochdruck zu bewerten.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren entsprachen dem einschlägigen ethischen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 2011) und wurden von den Komitees für Tierversuche des Huadong-Krankenhauses der Fudan-Universität genehmigt. Vierzehn Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (28-30g) wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt: Scheingruppe, Sham+Ang II-Gruppe, RDN-Gruppe, RDN+Ang II-Gruppe, n = 6 in jeder Gruppe. Alle Tiere wurden unter bestimmten geschlossenen pathogenfreien Bedingungen in einem temperaturkontrollierten Raum bei 24 ± 1 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser ad libitum gehalten.

1. Vorbereitung des Operationsfeldes

1. Desinfizieren Sie den Operationstisch mit 70% Ethanol. Stellen Sie die Heizkissentemperatur auf 37 °C ein.
2. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente vor der Operation bei 121 °C für 30 min oder mit anderen Methoden sterilisiert werden. Dieses Verfahren erfordert eine mikrochirurgische Schere, zwei feine gerade Pinzetten, zwei feine gebogene Pinzetten, hämostatische Pinzetten, sterile Gazen und Wiegepapiere.

2. Angiotensin II induzierte Hypertonie

1. Verabreichung von Meloxicam (0,5 mg/kg, SC) an die C57BL/6-Mäuse kurz vor der Narkoseeinleitung. Dann betäuben Sie die Mäuse mit Natrium-Pentobarbital-Injektion, wie zuvor beschrieben^20,21. Isofluran kann auch verwendet werden, wenn bevorzugt. Bestätigen Sie die Anästhesietiefe mit einem negativen Zehenklemmreflex.
2. Entfernen Sie die Haare auf dem Rücken mit einem Rasierer. Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Legen Sie das Tier in Rückenposition auf einen Operationstisch. Tupfen und wischen Sie den rasierten Bereich mit Povidon-Jod ab, gefolgt von drei Tüchern mit 70% Ethanol.
4. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt mit einer sterilen Skalpellklinge, senkrecht zum Schwanz, hinter dem Ohr über dem Schulterblatt des Vorderbeins.
5. Verwenden Sie einen sterilen Hämostat, um einen subkutanen Tunnel unter der Haut zu machen und eine Tasche für die Pumpe^{zu schaffen 22}. Führen Sie eine mit Angiotensin II (1.000 ng/kg/min) gefüllte osmotische Pumpe vorsichtig in die Tasche ein. Stellen Sie sicher, dass genügend freier Platz vorhanden ist, um die Wunde zu nähen, ohne die Haut zu dehnen.
6. Nähen Sie den Muskel mit unterbrochenen 6-0 Vicryl-Nähten und schließen Sie die Haut mit unterbrochenen 4-0-Nylonnähten. Tupfen und wischen Sie die Wundstelle mit Povidon-Jod ab. Führen Sie die gleiche Operation mit gleichem Volumen an Kochsalzlösung für die Kontrollgruppe durch.
7. Legen Sie alle chirurgischen Instrumente für 10 s in einen Sterilisator und ersetzen Sie die sterilen Handschuhe zwischen den Operationen. Überwachen Sie alle Mäuse, bis sie vollständig wiederhergestellt sind.
8. Überwachen und beobachten Sie die Wundheilung bei Mäusen mindestens zweimal täglich in der ersten Woche und danach einmal täglich, einschließlich Rötung, Schwellung und Infektion. Führen Sie sofort eine Dissektion durch, wenn die Mäuse während der Ang II-Infusion sterben.
9. Messen Sie den Blutdruck zu Studienbeginn und jede Woche nach der Infusion von Ang II mit der Schwanzmanschettenplethysmographie-Methode²³ bei bewussten Mäusen. Stellen Sie sicher, dass die Blutdruckmessexperimente in einem ruhigen Bereich bei 22 ± 2 °C durchgeführt werden, wo die Mäuse 1 h lang akklimatisiert werden, bevor das Experiment beginnt. Mäuse mindestens 5 aufeinanderfolgende Tage vor der Ausgangsmessung des Blutdrucks^{gewöhnen 23,24}.

3. Bilaterale renale Denervierung

1. Wählen Sie die Mäuse mit erhöhtem Blutdruck (BP) ≥140/90mmHg oder 25% Anstieg des systolischen Blutdrucks/diastolischen Blutdrucks, 1 Woche nach der Ang II-Infusion.
2. Erfassen Sie das Tiergewicht vor der Operation und wählen Sie Tiere mit einem Mindestgewicht von 24 g für die renale Denervierungsoperation.
3. Betäuben Sie die Mäuse mit Natriumpentobarbital. Bestätigen Sie die Anästhesietiefe mit einem negativen Zehenklemmreflex.
4. Entfernen Sie die Haare am Bauch mit einem Rasierer. Führen Sie diesen Vorgang sorgfältig und gründlich durch, um eine chirurgische Kontamination zu vermeiden.
5. Legen Sie die Mäuse auf den Operationstisch, halten Sie den Bauch oben und fixieren Sie seine Gliedmaßen mit Klebeband. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Povidon-Jod, gefolgt von drei Tüchern mit 70% Ethanol.
6. Machen Sie einen 2 cm ventralen Mittellinien-Bauchschnitt mit einer Skalpellklinge. Ziehen Sie den Darm mit Gaze, die in 37 °C Kochsalzlösung getränkt ist, zurück, um die linke Nierenarterie freizulegen. Sezieren Sie das Fett vorsichtig, aber unverblümt mit einer gebogenen Pinzette von der Nierenarterie weg. (Abbildung 1A-C).
7. Schneiden Sie das Wiegepapier mit einer sterilen scharfen Schere in ein Rechteck von der Größe der Nierenarterie. Schneiden Sie das Wägepapier als Referenz in der gleichen Größe aus, die durch die gepunktete Linie in Abbildung 1C dargestellt ist.
   HINWEIS: Es ist ein kritischer Teil der Operation, versuchen Sie, mehrere Stücke des Wiegepapiers gleichzeitig zu schneiden, um die gleiche Form zu behalten.
8. Tauchen Sie das Wägepapier mindestens 30 s lang in 10%ige Phenol/Ethanol-Lösung. Decken Sie die Oberfläche der linken Nierenarterie ab und wickeln Sie das Gefäß mit dem Wiegepapier ein, halten Sie es 2 min (Abbildung 1D). Verwenden Sie Gaze, um das umliegende Gewebe zu schützen, um zu vermeiden, dass das Wiegepapier die umgebende Niere und den Darm berührt.
   HINWEIS: Die Phenollösung ist in Kunststoffröhrchen, aber nicht in Glasdurchstechflaschen stabil. Daher muss die Lösung für jeden Versuch¹⁸ frisch zubereitet werden.
9. Führen Sie das gleiche Verfahren für die rechte Nierenarterie durch. Führen Sie die Scheinoperation mit in Kochsalzlösung getauchtem Wiegepapier durch.
10. Positionieren Sie die Muskeln in ihre Ausgangsposition und schließen Sie das Peritoneum mit 6-0 Vicryl-Nähten in einer unterbrochenen Naht. Dann schließen Sie die Haut mit unterbrochenen 4-0 Nylonnähten. Überwachen Sie alle Mäuse, bis sie vollständig wiederhergestellt sind.

4. Nachsorge

1. Tragen Sie Povidon-Jod auf den Schnitt auf und legen Sie das Tier zur Erholung und postoperativen Überwachung in eine erwärmte Heizdecke.
2. Überwachen Sie die Mäuse zweimal täglich, um Rötungen, Schwellungen und Schmerzen oder Bauchinfektionen zu beurteilen. Meloxicam (0,5 mg/kg, subkutan) allen Mäusen etwa 1 Stunde vor und 24 h nach dem RDN-Verfahren zur Verfügung stellen.

Ergebnisse

Statistik
Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Einweg-ANOVA wurde für Experimente mit drei oder mehr Bedingungen verwendet, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Tests für Vergleiche zwischen einzelnen Gruppen. Betrachten Sie einen p-Wert gleich oder kleiner als 0,05 als signifikant. Eine kommerzielle Software wurde verwendet, um alle statistischen Analysen durchzuführen.

Der durch Ang II induzierte Blutdruckanstieg wurde nach RDN ab...

Diskussion

Ob RDN den Blutdruck senken könnte, ist seit der Veröffentlichung des negativen Ergebnisses der Symplizitätsstudie HTN-3 umstritten ^7,25. Die verschiedenen klinischen Studien und Tierversuche haben jedoch positive und wirksame Ergebnisse von RDN bei hypertensiven Menschen und Tieren gezeigt 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sangon Biotech	CAS:4474-91-3	To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody	Abcam	ab137869	To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure Analysis	Visitech Systems	BP-2000	Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pump	DURECT Corporation	CA 95014	To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA Kit	Abcam	ab287789	to measure renal norepinephrine levels
Phenol	Sangon Biotech	CAS:108-95-2	Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paper	Sangon Biotech	F512112	To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112.