Miglioramento della denervazione renale ha attenuato l'ipertensione indotta dall'infusione di angiotensina II

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la denervazione simpatica renale (RDN) nei topi con ipertensione indotta dall'infusione di angiotensina II. La procedura è ripetibile, conveniente e consente di studiare i meccanismi regolatori della RDN sull'ipertensione e l'ipertrofia cardiaca.

Abstract

I benefici della denervazione simpatica renale (RDN) sulla pressione sanguigna sono stati dimostrati in un gran numero di studi clinici negli ultimi anni. Tuttavia, il meccanismo regolatore di RDN sull'ipertensione rimane elusivo. Pertanto, è essenziale stabilire un modello RDN più semplice nei topi. In questo studio, mini pompe osmotiche riempite con angiotensina II sono state impiantate in topi C57BL / 6 di 14 settimane. Una settimana dopo l'impianto della pompa mini-osmotica, è stata eseguita una procedura RDN modificata sulle arterie renali bilaterali dei topi usando fenolo. Ai topi di sesso di età corrispondente è stata somministrata soluzione salina e serviti come gruppo fittizio. La pressione sanguigna è stata misurata al basale e successivamente ogni settimana per 21 giorni. Quindi, l'arteria renale, l'aorta addominale e il cuore sono stati raccolti per l'esame istologico utilizzando H & E e la colorazione Masson. In questo studio, presentiamo un modello RDN semplice, pratico, ripetibile e standardizzato, che può controllare l'ipertensione e alleviare l'ipertrofia cardiaca. La tecnica può denervare i nervi simpatici renali periferici senza danni alle arterie renali. Rispetto ai modelli precedenti, l'RDN modificato facilita lo studio della patobiologia e della fisiopatologia dell'ipertensione.

Introduzione

L'ipertensione è una delle principali malattie cardiovascolari croniche in tutto il mondo. L'ipertensione incontrollata potrebbe danneggiare gli organi bersaglio e contribuire a insufficienza cardiaca, ictus e malattie renali croniche ^1,2,3. La prevalenza dell'ipertensione è aumentata dal 20% al 31% tra il 1991 e il 2007 in Cina. Il numero di adulti con ipertensione in Cina potrebbe raddoppiare a seguito di una recente revisione dei criteri diagnostici per l'ipertensione (130/80 mmHg)⁴. L'ipertensione può essere controllata dalla medicina, tuttavia, circa il 20% dei pazienti non è in grado di controllare la propria ipertensione, anche quando riceve almeno tre farmaci antipertensivi (incluso un diuretico) alla dose massima tollerata, che può portare allo sviluppo di ipertensione resistente ai farmaci⁵.

La denervazione simpatica renale (RDN) ha dimostrato di essere un potenziale trattamento per l'ipertensione. Nel 2009, Krum e colleghi hanno riferito di un trattamento per l'ipertensione resistente utilizzando RDN per la prima volta. È stato riscontrato che l'ablazione percutanea dell'arteria renale può causare efficacemente una riduzione persistente della pressione arteriosa nei pazienti⁶. Tuttavia, il fallimento dello studio Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) ha impedito l'applicazione di RDN⁷, trasformando RDN in una terapia controversa. Tuttavia, la prospettiva di RDN non è stata ancora esclusa. Recenti studi clinici, tra cui RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED e SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal hanno confermato l'efficacia di RDN sull'ipertensione 8,9,10,11,12. Pertanto, è necessario eseguire ricerche meccanicistiche più dettagliate per esplorare gli effetti di RDN.

Lo scopo generale di questo studio è dimostrare come l'RDN nei topi può essere modificato per produrre un intervento chirurgico più semplice e stabile. Un gran numero di esperimenti ha studiato vari approcci di RDN, come la crioablazione intravascolare, l'ecografia extracorporea e l'applicazione locale di una sostanza chimica o neurotossina in diversi modelli animali 13,14,15,16,17. Il modello RDN generato mediante ablazione chimica con fenolo è un modello sperimentale consolidato per studiare la patogenesi dell'attivazione simpatica sull'ipertensione. Questo modello è generato dalla corrosione chimica dei nervi simpatici renali con una soluzione di fenolo / etanolo al 10% utilizzando un batuffolo di cotone¹⁸. Da un lato, l'RDN convenzionale potenzialmente inibisce l'attività simpatica renale, che quindi diminuisce la secrezione di renina e il riassorbimento di sodio e aumenta il flusso sanguigno renale. D'altra parte, sopprime il sistema renina-angiotensina-aldosterone¹⁹. In tal modo, RDN ha un effetto benefico sull'ipertensione. Tuttavia, il modello RDN generato dall'ablazione chimica manca di criteri di ablazione e tempo di ablazione e i dettagli della procedura sperimentale non sono ancora chiari. Inoltre, non ci sono rapporti tecnici disponibili. In questo rapporto, descriviamo un protocollo chirurgico per la generazione del modello RDN con fenolo utilizzando carta pesata nell'ipertensione indotta da angiotensina II (Ang II) nei topi C57BL / 6. Avvolgiamo l'arteria renale con carta pesata contenente fenolo e unifichiamo il tempo di ablazione, il che aiuta a stabilire un modello RDN più riproducibile e affidabile. Questo modello sperimentale ha lo scopo di valutare l'effetto di RDN sull'ipertensione.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono conformi alla guida etica pertinente per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 2011) e sono state approvate dai comitati per la ricerca sugli animali dell'ospedale Huadong affiliato all'Università Fudan. Topi maschi C57BL / 6 di quattordici settimane (28-30g) sono stati divisi casualmente in quattro gruppi: gruppo Sham, gruppo Sham + Ang II, gruppo RDN, gruppo RDN + Ang II, n = 6 in ciascun gruppo. Tutti gli animali sono stati mantenuti in specifiche condizioni chiuse prive di agenti patogeni in una stanza a temperatura controllata a 24 ± 1 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore e libero accesso al chow standard per roditori e all'acqua ad libitum.

1. Preparazione del campo operativo

1. Disinfettare il tavolo operatorio con etanolo al 70%. Regolare la temperatura del termoforo a 37 °C.
2. Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterilizzati prima dell'intervento chirurgico a 121 °C per 30 minuti o con altri metodi. Questa procedura richiede micro forbici chirurgiche, due pinze dritte sottili, due pinze curve sottili, pinze emostatiche, garze sterili e carte da pesare.

2. Ipertensione indotta da angiotensina II

1. Fornire meloxicam (0,5 mg/kg, SC) ai topi C57BL/6 poco prima dell'induzione dell'anestesia. Quindi, anestetizzare i topi usando l'iniezione di pentobarbital di sodio come descritto in precedenza^20,21. L'isoflurano può anche essere usato, se si preferisce. Confermare la profondità dell'anestesia con un riflesso negativo del pizzico della punta.
2. Rimuovere i peli sulla schiena con un rasoio. Applicare unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
3. Posizionare l'animale su un tavolo operatorio in posizione dorsale. Tamponare e pulire l'area rasata con povidone-iodio seguito da tre salviette con etanolo al 70%.
4. Fai un'incisione di 1 cm usando una lama sterile di bisturi, perpendicolare alla coda, dietro l'orecchio sopra la scapola della gamba anteriore.
5. Utilizzare un emostatico sterile per creare un tunnel sottocutaneo sotto la pelle e creare una tasca per la pompa²². Inserire delicatamente nella tasca una pompa osmotica riempita con angiotensina II (1.000 ng/kg/min). Assicurarsi che ci sia abbastanza spazio libero per suturare la ferita senza allungare la pelle.
6. Sutura il muscolo con suture Vicryl 6-0 interrotte e chiudere la pelle con suture di nylon 4-0 interrotte. Tamponare e pulire il sito della ferita con povidone-iodio. Eseguire lo stesso intervento chirurgico con uguale volume di soluzione salina per il gruppo di controllo.
7. Mettere tutti gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore per 10 secondi e sostituire i guanti sterili tra un intervento chirurgico e l'altro. Monitorare tutti i mouse fino a quando non sono completamente recuperati.
8. Monitorare attentamente e osservare la guarigione delle ferite nei topi almeno due volte al giorno durante la prima settimana e una volta al giorno successivamente, inclusi arrossamento, gonfiore e infezione. Eseguire immediatamente la dissezione se i topi muoiono durante l'infusione di Ang II.
9. Misurare la pressione sanguigna al basale e ogni settimana dopo l'infusione di Ang II con il metodo di pletismografia coda-cuffia²³ nei topi coscienti. Assicurarsi che gli esperimenti di misurazione della pressione sanguigna siano condotti in una zona tranquilla, a 22 ± 2 ° C, dove i topi sono acclimatati per 1 ora prima dell'inizio dell'esperimento. Topi abituati per almeno 5 giorni consecutivi prima delle misurazioni basali della pressione arteriosa^23,24.

3. Denervazione renale bilaterale

1. Selezionare i topi con pressione sanguigna elevata (BP) ≥140/90mmHg o aumento del 25% della pressione sistolica / pressione diastolica, 1 settimana dopo l'infusione di Ang II.
2. Registrare il peso degli animali prima dell'intervento chirurgico e scegliere animali con un peso minimo di 24 g per la chirurgia di denervazione renale.
3. Anestetizzare i topi usando pentobarbital di sodio. Confermare la profondità dell'anestesia con un riflesso negativo del pizzico della punta.
4. Rimuovere i peli sull'addome con un rasoio. Eseguire questa procedura con attenzione e accuratamente per evitare qualsiasi contaminazione chirurgica.
5. Posiziona i topi sul tavolo operatorio, mantenendo l'addome sollevato e fissando i suoi arti con del nastro adesivo. Disinfettare la pelle addominale con povidone-iodio seguita da tre salviette con etanolo al 70%.
6. Fai un'incisione addominale della linea mediana ventrale di 2 cm usando una lama di bisturi. Tirare indietro l'intestino con una garza imbevuta di soluzione salina a 37 °C per esporre l'arteria renale sinistra. Sezionare attentamente ma senza mezzi termini il grasso lontano dall'arteria renale usando una pinzetta curva. (Figura 1A-C).
7. Tagliare la carta pesata in un rettangolo delle stesse dimensioni dell'arteria renale con forbici affilate sterili. Per riferimento, tagliare la carta pesata con le stesse dimensioni mostrate dalla linea tratteggiata nella figura 1C.
   NOTA: È una parte fondamentale dell'intervento chirurgico, provare a tagliare diversi pezzi della carta pesata alla volta per mantenere la stessa forma.
8. Immergere la carta pesata in una soluzione di fenolo/etanolo al 10% per almeno 30 s. Coprire la superficie dell'arteria renale sinistra e avvolgere il vaso con la carta da pesata, conservare per 2 minuti (Figura 1D). Utilizzare una garza per proteggere i tessuti circostanti per evitare che la carta pesata tocchi il rene e l'intestino circostanti.
   NOTA: La soluzione di fenolo è stabile nei tubi di plastica ma non nei flaconcini di vetro. Pertanto, la soluzione deve essere preparata al momento per ogni esperimento¹⁸.
9. Eseguire la stessa procedura per l'arteria renale destra. Eseguire l'intervento chirurgico fittizio con carta pesata immersa nella soluzione salina.
10. Riposizionare i muscoli nella loro posizione iniziale e chiudere il peritoneo con 6-0 suture Vicryl in una sutura interrotta. Quindi, chiudere la pelle con suture di nylon 4-0 interrotte. Monitorare tutti i mouse fino a quando non sono completamente recuperati.

4. Assistenza post-operatoria

1. Applicare povidone-iodio all'incisione e posizionare l'animale in una coperta elettrica riscaldata per il recupero e il monitoraggio post-operatorio.
2. Monitorare i topi due volte al giorno per valutare arrossamento, gonfiore e dolore o infezione addominale. Fornire meloxicam (0,5 mg/kg, SC) a tutti i topi circa 1 ora prima e 24 ore dopo la procedura RDN.

Risultati

Statistica
Tutti i dati sono espressi come media ± deviazione standard. ANOVA unidirezionale è stato utilizzato per esperimenti con tre o più condizioni seguiti da test posthoc Bonferroni per confronti tra singoli gruppi. Si consideri un valore p uguale o minore di 0,05 come significativo. Un software commerciale è stato utilizzato per eseguire tutte le analisi statistiche.

L'aumento della pressione arteriosa indotto da Ang II è stato attenuato dopo RDN

Discussione

Se RDN potrebbe abbassare la pressione sanguigna è diventato controverso dopo la pubblicazione del risultato negativo dello studio di symplicity HTN-3 ^7,25. Tuttavia, i numerosi studi clinici e gli esperimenti sugli animali hanno dimostrato risultati positivi ed efficaci di RDN su esseri umani e animali ipertesi 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sangon Biotech	CAS:4474-91-3	To make a hypertensive animol model
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody	Abcam	ab137869	To evaluate the expression of TH of renal nerves
Blood Pressure Analysis	Visitech Systems	BP-2000	Measure the blood pressure of mice
Mini-osmotic pump	DURECT Corporation	CA 95014	To fill with Angiotensin II
Norepinephrine ELISA Kit	Abcam	ab287789	to measure renal norepinephrine levels
Phenol	Sangon Biotech	CAS:108-95-2	Damage the renal sympathetic nerve
Weighing paper	Sangon Biotech	F512112	To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112.