استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة

Summary

يصف هذا البروتوكول إعداد واستخدام شرائح الرئة المقطوعة بدقة للفأر لتقييم مجرى الهواء وانقباض العضلات الملساء الشريانية داخل الرئة في بيئة حية تقريبا.

Abstract

تتوسط خلايا العضلات الملساء (SMC) في تقلص مجرى الهواء والشريان داخل الرئة لتعديل مقاومة تدفق الهواء والدورة الدموية الرئوية ، على التوالي ، وبالتالي تلعب دورا حاسما في توازن الجهاز الرئوي. يساهم تحرير انقباض SMC في العديد من الأمراض الرئوية ، بما في ذلك الربو وارتفاع ضغط الدم الرئوي. ومع ذلك ، نظرا لمحدودية الوصول إلى الأنسجة وعدم وجود أنظمة استزراع للحفاظ على الأنماط الظاهرية SMC في الجسم الحي ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء انقباض SMC غير المنظم في هذه الأمراض لا تزال محددة بالكامل. توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) نموذجا خارج الجسم الحي يتحايل على هذه الصعوبات التقنية. كقسم أنسجة رئوية حي ورقيق ، يحتفظ PCLS ب SMC في المناطق الطبيعية المحيطة ويسمح في الموقع بتتبع تقلص SMC وإشارات Ca^{2 +} داخل الخلايا التي تنظم انقباض SMC. هنا ، يتم توفير بروتوكول إعداد PCLS مفصل للماوس ، والذي يحافظ على الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة. يتضمن هذا البروتوكول خطوتين أساسيتين قبل إخضاع فص الرئة للتقطيع: تضخيم مجرى الهواء باستخدام الأغاروز منخفض الانصهار عبر القصبة الهوائية وملء الأوعية الرئوية بالجيلاتين من خلال البطين الأيمن. يمكن استخدام PCLS المعد باستخدام هذا البروتوكول للمقايسات الحيوية لتقييم تنظيم الانقباض بوساطة Ca^{2 +} ل SMC في كل من مجرى الهواء ومقصورات الشرايين داخل الرئة. عند تطبيقه على نماذج الفئران لأمراض الجهاز التنفسي ، يمكن هذا البروتوكول من التحقيق الوظيفي ل SMC ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة على الآلية الأساسية لإزالة الانقباض SMC في الأمراض.

Introduction

خلية العضلات الملساء (SMC) هي نوع رئيسي من الخلايا الهيكلية في الرئة ، وتقيم في المقام الأول في الجدار الإعلامي للممرات الهوائية والأوعية الرئوية. تتعاقد SMCs لتغيير العيار المضيء ، وبالتالي تنظيم تدفق الهواء والدم ^1,2. لذلك ، فإن التنظيم الانقباضي ل SMCs ضروري للحفاظ على توازن تهوية الهواء والدورة الدموية الرئوية. في المقابل ، يثير انقباض SMC الشاذ انسداد مجرى الهواء أو أمراض الأوعية الدموية الرئوية مثل الربو وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. ومع ذلك ، فقد واجه التقييم الوظيفي ل SMCs الرئة تحديا بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة الرئة ، وخاصة تلك الشعب الهوائية الصغيرة والأوعية الدقيقة في الجزء البعيد

Protocol

كانت جميع رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى ماساتشوستس العام. تم استخدام الفئران الذكور من النوع البري C57 / B6 ، التي يبلغ عمرها 8 أسابيع ، لهذه الدراسة.

1. التحضير التجريبي

1. إعداد حل العمل.
   1. قم بإعداد محلول الملح المتوازن 1x Hank (HBSS ، مع Ca 2+ و Mg 2⁺ ، ودرجة الحموضة المتوازنة مع²⁰ mM HEPES ، انظر جدول المواد). استخدم حل HBSS لإعداد ومعالجة PCLS. حافظ على برودة محلول HBSS على الجليد عند تحضير PCLSs.
2. قم بإعداد الوسط الاستزراعي ل PCLS عن طريق استكمال Dulbecco's Modified Eagle Medium و F-

النتائج

إعداد PCLS الماوس الحفاظ على الشعب الهوائية داخل الرئة سليمة والشرايين
وقد لوحظت PCLS بسماكة 150 ميكرومتر تحت مجهر تباين الطور المقلوب. في رئتي الفأر ، تكون الشعب الهوائية الموصلة مصحوبة بشرايين داخل الرئة ، تمتد من التلال إلى الرئة الطرفية. يظهر الشكل 2B حزمة تمثيلية...

Discussion

يتضمن إعداد PCLS عدة خطوات حاسمة. أولا ، من الضروري تضخيم فص الرئة بشكل متجانس لتجنب اختلاف تصلب الأنسجة عن توزيع الأغاروز غير المتساوي. نظرا لأن الأغاروز السائل يتدفق بسرعة في القسطرة الرقيقة أو الشعب الهوائية عند درجة حرارة أقل من 37 درجة مئوية ، فإن عيب الملء الناتج في مجال الرئة البعيد يم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter