Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Verwendung von präzise geschnittenen Lungenschnitten der Maus zur Beurteilung der Kontraktilität der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur in einem nahezu in vivo Milieu.

Zusammenfassung

Glatte Muskelzellen (SMC) vermitteln die Kontraktion der Atemwege und der intrapulmonalen Arterie, um den Luftströmungswiderstand bzw. die Lungenzirkulation zu modifizieren, und spielen somit eine entscheidende Rolle in der Homöostase des Lungensystems. Die Deregulation der SMC-Kontraktilität trägt zu mehreren Lungenerkrankungen bei, einschließlich Asthma und pulmonaler Hypertonie. Aufgrund des begrenzten Gewebezugangs und des Mangels an Kultursystemen zur Aufrechterhaltung von In-vivo-SMC-Phänotypen bleiben molekulare Mechanismen, die der deregulierten SMC-Kontraktilität bei diesen Krankheiten zugrunde liegen, jedoch vollständig identifiziert. Die präzisionsgeschnittene Lungenscheibe (PCLS) bietet ein Ex-vivo-Modell , das diese technischen Schwierigkeiten umgeht. Als lebender, dünner Lungengewebeschnitt behält das PCLS SMC in natürlicher Umgebung und ermöglicht die In-situ-Verfolgung der SMC-Kontraktion und der intrazellulären Ca 2 + -Signalgebung, die die^{SMC-Kontraktilität} reguliert. Hier wird ein detailliertes PCLS-Vorbereitungsprotokoll für die Maus bereitgestellt, das intakte Atemwege und intrapulmonale Arterien bewahrt. Dieses Protokoll umfasst zwei wesentliche Schritte, bevor der Lungenlappen dem Schneiden unterzogen wird: Aufblasen der Atemwege mit Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch die Luftröhre und Auffüllen der Lungengefäße mit Gelatine durch den rechten Ventrikel. Das mit diesem Protokoll hergestellte PCLS kann für Bioassays verwendet werden, um die Ca2⁺-vermittelte kontraktile Regulation von SMC sowohl in den Atemwegen als auch in den intrapulmonalen arteriellen Kompartimenten zu bewerten. Bei der Anwendung auf Mausmodelle von Atemwegserkrankungen ermöglicht dieses Protokoll die funktionelle Untersuchung von SMC und gibt so Einblick in den zugrunde liegenden Mechanismus der SMC-Kontraktilitätsderegulierung bei Krankheiten.

Einleitung

Die glatte Muskelzelle (SMC) ist ein wichtiger struktureller Zelltyp in der Lunge, der sich hauptsächlich in der Medienwand der Atemwege und Lungengefäße befindet. SMCs ziehen sich zusammen, um das luminale Kaliber zu verändern und so den Luft- und Blutfluss zu regulieren ^1,2. Daher ist die kontraktile Regulierung von SMCs unerlässlich, um die Homöostase der Luftbelüftung und der Lungenzirkulation aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu provoziert die aberrante SMC-Kontraktilität obstruktive Atemwegs- oder pulmonale Gefäßerkrankungen wie Asthma und pulmonale arterielle Hypertonie. Die funktionelle Beurteilung von Lungen-SMCs wurde jedoch durch den begrenzten Zugang zum Lungengewebe in Frage gestellt, insbesondere zu den kleinen Atemwegen und Mikrogefäßen im distalen Teil der Lunge ^2,3. Aktuelle Lösungen greifen auf indirekte Assays zurück, wie z.B. die Messung des Luftstromwiderstands durch Flexivent, um die Verengung der Atemwege zu reflektieren, und die Überprüfung des pulmonalen arteriellen Blutdrucks durch Rechtsherzkatheterisierung zur Beurteilung der pulmonalen Vasokontraktion ^4,5. Diese indirekten Assays haben jedoch mehrere Nachteile, wie z.B. strukturelle Faktoren zu verwirren, die räumliche Vielfalt der Atemwegs- oder Gefäßreaktionen in der gesamten Lungenskala nicht zu erfassen ^6,7 und sind für die mechanistische Untersuchung der kontraktilen Regulation auf zellulärer Ebene ungeeignet. Daher wurden alternative Ansätze mit isolierten Primärzellen, Luftröhren-/Bronchi-Muskelstreifen ^8,9 oder großen Gefäßsegmenten¹⁰ für die SMC-Studie in vitro angewendet. Dennoch haben diese Methoden auch Grenzen. Zum Beispiel macht es eine schnelle phänotypische Anpassung primärer SMCs im Kulturzustand^11,12 problematisch^, Befunde aus der Zellkultur auf In-vivo-Einstellungen zu extrapolieren. Darüber hinaus kann der kontraktile Phänotyp von SMCs in den isolierten proximalen Atemwegs- oder Gefäßsegmenten nicht die SMCs in der distalen Lunge^{darstellen 6,7}. Darüber hinaus bleibt die Muskelkraftmessung auf Gewebeebene von molekularen und zellulären Ereignissen getrennt, die für den mechanistischen Einblick in die kontraktile Regulation unerlässlich sind.

Precision-cut lung slice (PCLS), ein lebender Lungengewebeabschnitt, bietet ein ideales Ex-vivo-Werkzeug zur Charakterisierung pulmonaler SMCs in einer nahezu in vivo Mikroumgebung (d. h. erhaltene multizelluläre Architektur und Interaktion)¹³. Seit Dr. Placke und Dr. Fisher in den 1980er Jahren erstmals die Herstellung von Lungenscheiben aus mit Agarose aufgeblasenen Ratten- und Hamsterlungen eingeführt haben^14,15, wurde diese Technik kontinuierlich weiterentwickelt^, um PCLS eine höhere Qualität und größere Vielseitigkeit für die biomedizinische Forschung zu bieten. Eine signifikante Verbesserung ist die Verbesserung der pulmonalen arteriellen Erhaltung durch Gelatineinfusion zusätzlich zur Lungeninflation mit Agarose über die Luftröhre. Infolgedessen werden sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien im PCLS für die Ex-vivo-Beurteilung ^{intakt gehalten 16}. Darüber hinaus ist das PCLS für eine längere Zeit in der Kultur lebensfähig. Zum Beispiel hatten Maus-PCLS für mindestens 12 Tage in Kultur keine signifikante Veränderung der Zelllebensfähigkeit und des Metabolismus, und sie behielten die Kontraktilität der Atemwege für bis zu 7 Tage^{bei 17}. Darüber hinaus hält PCLS unterschiedlich große Atemwege oder Gefäße für Kontraktions- und Entspannungsassays. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Ca 2 + -Signalgebung von SMCs, dem Determinantenfaktor der Zellkontraktilität, mit Ca 2⁺ -Reporterfarbstoffen untersucht werden, die von einem konfokalen oder 2-Photonen-Mikroskop¹³ aufgenommen wurden.

Unter Berücksichtigung der umfangreichen Anwendung des Mausmodells in der Lungenforschung wird hier ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Maus-PCLS mit intakten Atemwegen und intrapulmonalen Arterien für die Ex-vivo-Lungenforschung beschrieben. Anhand der präparierten PCLS demonstrierten wir anschließend, wie die Reaktionen der Atemwege und der Lungenarterien auf konstriktive oder relaxante Reize bewertet werden können. Darüber hinaus wird auch das Verfahren beschrieben, das PCLS mit Ca 2 + -Reporterfarbstoff zu beladen und dann die Ca^{2 +} -Signalgebung von SMCs in Verbindung mit kontraktilen oder relaxanten Reaktionen abzubilden.

Protokoll

Die gesamte Tierpflege erfolgte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Massachusetts General Hospital. Wildtyp C57/B6 männliche Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet.

1. Versuchsvorbereitung

1. Bereiten Sie die funktionierende Lösung vor.
   1. Bereiten Sie 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, mit Ca 2+ und Mg 2⁺ und pH ausgewogen mit²⁰ mM HEPES, siehe Materialtabelle) vor. Verwenden Sie die HBSS-Lösung, um das PCLS vorzubereiten und zu verarbeiten. Halten Sie die HBSS-Lösung bei der Herstellung von PCLS kalt auf Eis.
2. Bereiten Sie das Kulturmedium von PCLS vor, indem Sie Dulbeccos modifiziertes Adlermedium und F-12 (DMEM-F12) mit einem antibiotisch-antimykotischen Mittel (Volumenverhältnis 1:100, siehe Materialtabelle) ergänzen.
3. Bereiten Sie 1,5% Agarose und 6% ige Gelatinelösung vor.
   1. Agarose oder Gelatinepulver mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) (siehe Materialtabelle) mit HBSS-Lösung separat in 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen (oder 50 ml Röhrchen bei Lösungsvolumen >10 ml) zu Endkonzentrationen mischen.
      HINWEIS: Gesamtvolumen der Agaroselösung = 5 ml/Maus x Anzahl der Mäuse; Gelatinelösung = 2 ml/Maus x Anzahl der Mäuse.
   2. Erhitzen Sie die Lösungsrohre in kochendem Wasser, bis sich das Pulver vollständig auflöst. Bewahren Sie sowohl Agarose- als auch Gelatinelösungen in einem 42 °C warmen Wasserbad auf.
      HINWEIS: Eine Heizlampe am Seziertisch kann nützlich sein, um die Betriebsumgebung warm zu halten und zu verhindern, dass sich Agaroselösung verfestigt, bevor sie in die Mauslunge injiziert wird.
4. Tauchen Sie alle Sezierwerkzeuge, einschließlich einer Sezierschere, zwei Paare gekrümmter Mikrosezierungszange und eines Paares hämostatischer Pinzetten für mindestens 20 Minuten zur Sterilisation in 70% ige Ethanollösung.
5. Halten Sie ein Vibratom bereit (siehe Materialtabelle), um das Lungengewebe in dünne Scheiben zu schneiden.
6. Bewahren Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop mit einer CCD-Kamera auf, um die Atemwegs- oder Gefäßkontraktionsreaktionen zu bewerten, und ein speziell angefertigtes konfokales Laserscanning-Mikroskop (siehe Materialtabelle), um die Ca^{2 +} -Signalgebung in pulmonalen SMCs¹⁸ zu beurteilen.

2. Aufblasen von Mauslungen mit Agarose und Gelatinelösung

1. Euthanasieren Sie die Maus.
   1. Legen Sie die Maus in eine Kunststoffkammer (ca. 750 cm³) mit 5% Isofluran. Halten Sie die Maus in der Kammer, bis sie mindestens 1 min aufhört zu atmen.
      HINWEIS: Andere primäre Euthanasiemethoden, wie die intraperitoneale Injektion von Ketamin (240 mg/Kg) und Xylazin (32 mg/Kg)¹⁹ oder Pentobarbital (0,3 ml)²⁰, können als Alternativen zu inhalativem Isofluran angewendet werden.
   2. Legen Sie den Mauskörper auf ein Sezierbrett in Rückenlage. Fixieren Sie den Körper in Position, indem Sie den Schwanz, die Vorderpfoten und den Kopf mit 25 G Spritzennadeln festnageln und den Körper mit 70% Ethanolspray desinfizieren.
   3. Schneiden Sie den Bauch der Maus mit einer chirurgischen Schere auf (Schnitt, ~2 cm lang x 2 cm breit). Schneiden Sie dann die Bauchaorta ab, um das Blutvolumen zu erschöpfen.
2. Blasen Sie die Lungenlappen mit den folgenden Schritten auf.
   1. Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig entlang des Brustbeins und des bilateralen unteren Brustkorbs über dem Zwerchfell und beobachten Sie, wie die Lungenlappen kollabieren, wenn sich die Brusthöhle öffnet.
   2. Entfernen Sie einen Teil der bilateralen ventralen Brustkäfige, um das Herz freizulegen. Vermeiden Sie Lungenschäden, indem Sie die scharfe Scherenspitze vom Lungengewebe wegrichten.
   3. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Thymus und das Weichgewebe im Maushals zu trennen, um die Luftröhre freizulegen.
   4. Schneiden Sie ein kleines Loch (1,2 mm Durchmesser) in das obere Ende der Luftröhre, das den Durchgang der Spitze eines 20 G Y-förmigen IV-Katheters ermöglicht (siehe Materialtabelle).
   5. Verbinden Sie einen Adapteranschluss des Y-förmigen Katheters mit einer 3-ml-Spritze, die mit 0,5 ml Luft vorgefüllt ist, und den anderen Anschluss mit einer 3-ml-Spritze, die mit 2 ml warmer 1,5%iger Agaroselösung (42 °C) vorgefüllt ist.
   6. Injizieren Sie Agaroselösung, um den Katheter zu füllen, und drücken Sie dann den Katheter durch die vorgeschnittene Öffnung in die Luftröhre für 5-8 mm Länge.
   7. Injizieren Sie die Agaroselösung langsam bei etwa 1 ml/5 s. Die Lunge dehnt sich entlang der proximalen zu distalen Achse aus. Stoppen Sie die Injektion, wenn der Rand jedes Lungenlappens aufgeblasen ist.
      HINWEIS: Überpumpen Sie die Lunge nicht, da dies zu einem Bruch führen könnte. Das Volumen der Agaroselösung, um die gesamte Lunge einer jungen erwachsenen Maus aufzublasen, beträgt etwa 1,3 ± 0,1 ml.
   8. Injizieren Sie 0,2-0,3 ml Luft aus der anderen Spritze, um die Restagarose im Katheter und in den leitenden Atemwegen in den distalen Alveolenraum zu drücken.
   9. Schließen Sie die Luftröhre mit einer gekrümmten hämostatischen Pinzette (siehe Materialtabelle).
3. Füllen Sie das Lungengefäßsystem aus.
   1. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit warmer 6% Gelatine. Schließen Sie sich an einen Nadel-Kopfhautvenenkatheter an, füllen Sie den Katheter mit Gelatinelösung und punktieren Sie dann den rechten Ventrikel in der Nähe der unteren Wand mit der Nadel.
   2. Drücken Sie die Nadel für 2-3 mm Länge in den rechten Ventrikel und richten Sie die Nadelspitze auf die Hauptlungenarterie.
   3. Injizieren Sie 0,2 ml Gelatinelösung langsam in den rechten Ventrikel und die pulmonalen arteriellen Gefäße.
      HINWEIS: Die Lungenlappen erscheinen bei entsprechender Gelatineinflation etwas blasser.
   4. Halten Sie die Nadel nach der Injektion 5 Minuten an Ort und Stelle, kühlen Sie die Lungenlappen, indem Sie eiskalte HBSS-Lösung auf Herz und Lunge gießen, und legen Sie dann den Körper mit dem Sezierbrett für insgesamt 10 Minuten in einen 4 ° C-Kühlschrank oder auf Eis.
   5. Entfernen Sie die Mauslunge und das Herz mit einer Schere aus dem umgebenden Bindegewebe. Trennen Sie dann jeden Lungenlappen und bewahren Sie ihn in HBSS-Lösung auf Eis auf.

3. Schneiden von Lungenlappen in dünne Scheiben

1. Schneiden und befestigen Sie den Lungenlappen an der Oberseite der Probensäule mit Sekundenkleber und richten Sie den Lappen aus (Abbildung 1A, B), damit die Schnittrichtung senkrecht zu den meisten Atemwegen von der Hila bis zur Lungenoberfläche steht.
2. Verwenden Sie ein Vibratom mit einer frischen, dünnen Rasierklinge, um den Lungenlappen in 150 μm-Scheiben zu schneiden. Sammeln Sie die Scheiben in 100 mm sterilen Petrischalen vorgefüllt mit kalter HBSS-Lösung.
   HINWEIS: Stellen Sie die entsprechende Blattbewegungsgeschwindigkeit und Schwingungsfrequenz ein, bevor Sie mit dem Schneiden beginnen. Eine typische Einstellung für einen Compresstom ist Speed Level 4 und Oscillation Level 4.
3. Die mit DMEM/F-12-Kulturmedium gefüllten Petrischalen (20 Scheiben/15 ml Medium/Schale) in Petrischalen überführen und vor den Experimenten über Nacht in einem 37 °C Inkubator aufbewahren.
   HINWEIS: Maus-PCLS können etwa 7 Tage lang in Kultur gehalten werden, ohne die kontraktilen Reaktionen der Atemwege zu verlieren¹⁷. Die Langlebigkeit der Lungenarterien wurde nicht gründlich untersucht. Nach unserer Beobachtung behalten sie ihre intakte Struktur und Vasoreaktion für mindestens 3 Tage in DMEM/F12-Medium. Zur Langzeitlagerung können Maus-PCLS in Kryoviale gegeben werden, die mit DMEM/F12-Medium gefüllt sind, das 10% DMSO enthält (5 Scheiben in 1 ml Medium pro Durchstechflasche), in einem mit Isopropylalkohol gefüllten Behälter bei -80 °C über Nacht eingefroren und in flüssigem Stickstoff für Wochen bis Monate²¹ kryokonserviert werden.

4. Analyse kontraktiler Reaktionen von intrapulmonalen Atemwegen und Arterien

1. Legen Sie PCLS in eine HBSS-gefüllte 24-Well-Kulturplatte, eine in jedem Well. Suchen Sie das PCLS in der Mitte des Bohrlochs und entfernen Sie dann die HBSS-Lösung mit einer Pipette.
2. Suchen Sie die Zielatemwege und das Gefäß in der Scheibe unter dem Mikroskop und bedecken Sie die Scheibe dann mit einem Nylonnetz mit einem vorgeschnittenen zentralen Loch (2-3 mm Durchmesser), um den Zielbereich freizulegen.
3. Legen Sie eine hohle Metallscheibe auf das Netz, um die Scheiben an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2A).
4. Fügen Sie 600 μL HBSS-Lösung hinzu, um das PCLS zu untertauchen. Ruhen Sie den Schnitt für 10 Minuten aus und zeichnen Sie dann die Basisbilder von Atemwegen oder Schiffen auf.
5. Induzieren Sie die Atemwegs- oder Gefäßkontraktion, indem Sie die leere HBSS-Lösung vorsichtig mit einer Pipette absaugen und 600 μL HBSS mit einem Agonisten hinzufügen, wie z. B. 1 μM Methacholin (MCh) oder 10 nM Endothelin (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Eine KCl-Stimulation als Werkzeugstandard ist vor der Methacholin- oder Endothelin-Exposition nicht erforderlich. 100 mM KCl-Stimulation in den Atemwegen der Maus induzieren nur eine kleine und unregelmäßige Atemwegskontraktion (10%-15%)²⁰. Ebenso ist eine Priming-Methacholin-Stimulation nicht erforderlich, da wir bestätigt haben, dass derselbe Agonist, zum Beispiel Methacholin oder Serotonin, bei der ersten und wiederholten Exposition eine ähnliche Atemwegskontraktion auslöst^20,22.
6. Beobachten Sie die Reaktion unter dem Mikroskop, bis die Luminalbereichsänderung einen Gleichgewichtsstatus erreicht, und zeichnen Sie dann die Atemwegs- oder Gefäßbilder zur Analyse auf.
7. Entfernen Sie MCh- oder Endothelinlösung mit einer Pipette und fügen Sie eine neue 600-μL-HBSS-Lösung mit der gleichen Agonistenkonzentration und einem Relaxans hinzu; Beobachten und erfassen Sie die Atemwegs- oder Gefäßentspannung.
8. Quantifizieren Sie die Atemwegs- oder Gefäßreaktion mit den folgenden Schritten.
   1. Laden Sie die Bilder in die von NIH gesponserte kostenlose Software FIJI.
   2. Wählen Sie in der Symbolleiste die Polygonauswahl aus, um die Atemwege oder das Gefäßlumen auf jedem Rahmen zu umreißen.
   3. Wählen Sie Analysieren > Messen > Bereich festlegen.
   4. Wählen Sie Analyze > Measure aus, um den Interessenbereich zu quantifizieren. Die Ergebnisse werden in einem separaten Fenster zur statistischen Analyse angezeigt.

5. Analyse der Ca²⁺ Signalgebung von Atemwegs- oder Gefäß-SMCs

1. Bereiten Sie den Farbstoffladepuffer Ca²⁺ vor.
   1. Lösen Sie Ca²⁺ Farbstoff, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (siehe Materialtabelle), 50 μg (eine Durchstechflasche) mit 10 μL DMSO auf.
   2. 0,2 g Pluronic F-12-Pulver (siehe Materialtabelle) in 1 ml DMSO auflösen, um eine 20%ige Plunonic-Lösung zu erzeugen.
   3. Mischen Sie 10 μL 20%ige Plunonic-Lösung mit 10 μL Ca²⁺ Farbstoff-DMSO-Lösung.
   4. Machen Sie Ca 2+ Farbstoffbelastungspuffer, indem Sie 20 μL der Mischung zu 2 ml HBSS-Lösung mit²⁰⁰ μM Sulfobromphthalein hinzufügen (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie 15 Maus-PCLS in 2 ml Ca²⁺ Ladepuffer und inkubieren Sie bei 30 °C für 1 h. Dann bewegen Sie die Scheiben auf 2 ml HBSS-Lösung mit 100 μM Sulfobromphthalein für weitere 30 min für die Entesterung von Fluoreszenzfarbstoffen bei Raumtemperatur.
3. Erkennen Sie Ca²⁺ Signalisierung von SMCs.
   1. Legen Sie Ca²⁺ farbstoffbeladene Scheiben auf ein großes Deckglas.
   2. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit Hochvakuum-Silikonfett. Drücken Sie das Fett durch eine abgestumpfte Nadel mit 18 G, um zwei parallele Linien über das Deckglas über und unter der Scheibe zu ziehen.
   3. Decken Sie die Scheibe mit einem Nylonnetz zwischen zwei Fettlinien ab. Legen Sie das zweite Deckglas auf das Netz, um eine an den Seiten fettversiegelte Kammer zu erzeugen (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Das Nylonnetz ist wichtig, um die Scheibe am unteren Deckglas befestigt zu halten und somit innerhalb des Arbeitsabstands eines invertierten Objektivs hoher Größe, wie z. B. 40-faches Öl, zu bleiben.
   4. Fügen Sie HBSS- oder Agonistenlösung von einem Ende in die Kammer hinzu, indem Sie manuell oder über ein Perfusionssystem pipettieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der Kammer, indem Sie vom anderen Ende mit Seidenpapier oder Vakuum im Falle einer kontinuierlichen Flüssigkeitsperfusion absaugen.
   5. Stellen Sie die PCLS-Kammer auf den Mikroskoptisch. Detektieren Sie die Ca 2⁺ Signalisierung von SMC²³ mit einem speziell entwickelten resonanten scannenden konfokalen Mikroskop mit einer Laserabtastrate von 15 oder 30 Bildern/s.
      HINWEIS: Alternativ kann ein kommerzielles Hochgeschwindigkeits-Laserscanning-Konfokalmikroskop, das derzeit weit verbreitet ist, im Ca²⁺ Signalisierungsassay von pulmonalen SMCs in PCLS angewendet werden.
4. Quantifizieren Sie die Ca²⁺ Fluoreszenz in SMCs.
   1. Laden Sie die aufgezeichnete Bildsequenz auf FIJI und wählen Sie das Bild > Typ > 8-Bit-Graustufen.
   2. Wählen Sie in der Symbolleiste die Rechteckauswahl aus und definieren Sie einen 5 Pixel x 5 Pixel großen Bereich von Interesse (ROI) in einer glatten Muskelzelle.
   3. Wählen Sie Analysieren > Messungen einstellen > Mittleren Grauwert , der die Fluoreszenzintensität von Ca²⁺ darstellt.
   4. Wenn sich die Position eines ROI mit der SMC-Kontraktion ändert, wählen Sie Analysieren > Messen Sie die Ca²⁺ Fluoreszenzintensität Bild für Bild.
   5. Wenn der ROI von SMC in einem Stapel von Bildern in einer ähnlichen Position bleibt, wählen Sie Bild > Stapel > Messen Sie den Stapel der Fluoreszenzintensität von Ca²⁺ .
      HINWEIS: Ein benutzerdefiniertes Makro kann angeschlossen werden, um den ROI innerhalb des SMC zu verfolgen, wenn es sich mit Kontraktion in einem Bildstapel bewegt und automatisch die Ca²⁺ Intensität (Grauwert) des ROI Bild für Bild misst.

Ergebnisse

Maus-PCLS-Präparat zur Erhaltung intakter intrapulmonaler Atemwege und Arterien
Ein 150 μm dickes PCLS wurde unter dem invertierten Phasenkontrastmikroskop beobachtet. In der Mauslunge werden leitfähige Atemwege von intrapulmonalen Arterien begleitet, die vom Hilus bis zur peripheren Lunge verlaufen. Ein repräsentatives Lungen-Atemwegs-Arterie-Bündel in einem Maus-PCLS ist in Abbildung 2B dargestellt. Die Atemwege können leicht durch quaderförmige Epithelzellen ide...

Diskussion

Die Vorbereitung von PCLS umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens ist es wichtig, den Lungenlappen homogen aufzublasen, um die Variation der Gewebesteifigkeit durch ungleichmäßige Agaroseverteilung zu vermeiden. Da die flüssige Agarose bei einer Temperatur unter 37 °C schnell in dünnen Kathetern oder Atemwegen geliert, könnte der daraus resultierende Fülldefekt im distalen Lungenfeld die Disparität der Lungengewebesteifigkeit erhöhen und Geweberisse während des Vibratomabschnitts verursachen. Daher kann ge?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter