利用精密切割的肺切片研究气道和肺内平滑肌的收缩调节

摘要

本方案描述了制备和利用小鼠精确切割的肺切片来评估在近 体内 环境中的气道和肺内动脉平滑肌收缩力。

摘要

平滑肌细胞（SMC）介导气道和肺内动脉的收缩，分别改变气流阻力和肺循环，因此在肺系统的稳态中起着关键作用。SMC收缩力的放松调节会导致几种肺部疾病，包括哮喘和肺动脉高压。然而，由于组织通路有限且缺乏维持 体内 SMC表型的培养系统，这些疾病中SMC收缩性失调的分子机制仍然得到充分鉴定。精密切割肺切片（PCLS）提供了一种离 体 模型，可以规避这些技术难题。作为活的薄肺组织切片，PCLS将SMC保留在自然环境中，并允许 原位 跟踪SMC收缩和细胞内Ca^{2 +} 信号传导，调节SMC收缩力。这里，提供了详细的小鼠PCLS制备方案，其保留了完整的气道和肺内动脉。该方案涉及在对肺叶进行切片之前的两个基本步骤:通过气管用低熔点琼脂糖充气气道，并通过右心室用明胶填充肺血管。使用该方案制备的PCLS可用于生物测定，以评估气道和肺动脉内室中Ca^{2 +}介导的SMC收缩调节。当应用于呼吸系统疾病的小鼠模型时，该方案能够对SMC进行功能研究，从而深入了解疾病中SMC收缩性调节的潜在机制。

引言

平滑肌细胞（SMC）是肺中的主要结构细胞类型，主要位于气道和肺血管的介质壁中。SMC收缩以改变腔径，从而调节空气和血流量^1，2。因此，SMC的收缩调节对于维持空气通气和肺循环的稳态至关重要。相反，异常的SMC收缩性会引起阻塞性气道或肺部血管疾病，如哮喘和肺动脉高压。然而，肺 SMC 的功能评估受到肺部组织（尤其是肺远端的小气道和微血管）的有限访问的挑战^2，3。目前的解决方案采用间接检测，例如通过Flexivent测量气流阻力以反映气道收缩，以及通过右心导管检查肺动脉血压以评估肺血管收缩^4，5。然而，这些间接测定具有多种缺点，例如被结构因素混淆，未能捕获整个肺尺度^6，7中气道或血管反应的空间多样性，以及不适合细胞水平上收缩调节的机制研究。因此，使用分离的原代细胞，气管/支气管肌肉条^8，9或大血管段¹⁰的替代方法已被应用于体外SMC研究。然而，这些方法也有局限性。例如，在培养条件¹¹，¹²中，原代SMC的快速表型适应使得从细胞培养到体内设置的外推结果存在问题。此外，分离的近端气道或血管段中SMC的收缩表型可能不代表远端肺中的SMC^6，7。此外，组织水平的肌肉力量测量仍然与分子和细胞事件分离，这些事件对于机械地了解收缩调节至关重要。

精密切割肺切片（PCLS）是活的肺组织切片，为表征近体内微环境（即保存的多细胞结构和相互作用）中的肺SMC提供了理想的离体工具¹³。自从Placke博士和Fisher博士在20世纪80^年代首次引入从琼脂糖充气的大鼠和仓鼠肺制备肺切片^{以来，该技术}不断进步，为生物医学研究提供更高质量和更大多功能性的PCLS。一项显著的改进是通过明胶输注来增强肺动脉保存，此外还有琼脂糖通过气管的肺充气。结果，气道和肺动脉在PCLS中保持完整，以进行离体评估¹⁶。此外，PCLS在培养中长期可行。例如，小鼠PCLS在培养物中至少12天内细胞活力和新陈代谢没有显着变化，并且它们保持气道收缩性长达7天¹⁷。此外，PCLS保留不同大小的气道或血管进行收缩和松弛测定。此外，SMC的细胞内Ca²⁺信号传导是细胞收缩力的决定因素，可以用共聚焦或2光子显微镜¹³成像的Ca²⁺报告染料进行测定。

考虑到小鼠模型在肺部研究中的广泛应用，这里描述了制备具有完整气道和肺内动脉的小鼠PCLS用于 离体 肺研究的详细方案。使用准备好的PCLS，我们随后演示了如何评估气道和肺动脉对收缩或松弛刺激的反应。此外，还描述了用Ca²⁺ 报告染料加载PCLS，然后对与收缩或弛貆反应相关的SMC的Ca²⁺ 信号传导进行成像的方法。

研究方案

所有动物护理均符合马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会的指导方针。本研究使用8周龄的野生型C57 / B6雄性小鼠。

1. 实验准备

1. 准备工作解决方案。
   1. 准备1x汉克平衡盐溶液（HBSS，含钙²⁺ 和镁²⁺，pH值与20mM HEPES平衡，参见 材料表）。使用 HBSS 解决方案来制备和处理 PCLS。在制备PCLS时，将HBSS溶液放在冰上保持低温。
2. 通过用抗生素 - 抗真菌剂（1:100体积比，见 材料表）补充杜尔贝科的改性鹰培养基和F-12（DMEM-F12）来制备PCLS的培养基。
3. 制备1.5%琼脂糖和6%明胶溶液。
   1. 将低熔点（LMP）琼脂糖或明胶粉末（参见 材料表）与HBSS溶液分别在15 mL无菌离心管中混合（如果溶液体积>10 mL，则为50 mL管）至最终浓度。
      注意:琼脂糖溶液的总体积= 5 mL /小鼠x小鼠数量;明胶溶液= 2 mL /小鼠 x 小鼠数量。
   2. 在沸水中加热溶液管，直到粉末完全溶解。将琼脂糖和明胶溶液保持在42°C水浴中。
      注意:解剖台上的加热灯可用于保持操作环境温暖，并防止琼脂糖溶液在注射到小鼠肺部之前凝固。
4. 将所有解剖工具浸没，包括一把解剖剪刀，两对弯曲的微切开镊子和一对止血镊子在70%乙醇溶液中至少20分钟以进行灭菌。
5. 准备好振动切片机（见 材料表），将肺组织切成薄片。
6. 保留带有CCD相机的倒置相差显微镜以评估气道或血管收缩反应，并保留定制的激光扫描共聚焦显微镜（参见 材料表）以评估肺部SMC中的Ca^{2 +} 信号传导¹⁸。

2. 琼脂糖和明胶溶液对小鼠肺的充气

1. 对鼠标实施安乐死。
   1. 将鼠标放入装有5%异氟醚的塑料室（约750厘米³）中。将鼠标保持在腔室中，直到它停止呼吸至少1分钟。
      注意:其他主要的安乐死方法，如腹膜内注射氯胺酮（240毫克/千克）和甲苯噻嗪（32毫克/千克）¹⁹ 或戊巴比妥（0.3毫升）²⁰，可作为吸入异氟醚的替代品。
   2. 将鼠标身体放在仰卧位的解剖板上。用25 G注射器针头固定尾巴，前爪和头部，并将身体固定到位，并用70%乙醇喷雾消毒身体。
   3. 用手术剪刀切开小鼠的腹部（切口，约2厘米长x 2厘米宽）。然后，切断腹主动脉以耗尽血容量。
2. 按照以下步骤为肺叶充气。
   1. 沿着横膈膜上方的胸骨和双侧下肋骨笼小心地打开胸腔，并在胸腔打开时观察肺叶塌陷。
   2. 切除部分双侧腹肋骨笼以暴露心脏。通过将尖锐的剪刀尖端指向远离肺组织来避免肺部损伤。
   3. 使用镊子将小鼠颈部的胸腺和软组织分开，以暴露气管。
   4. 在气管上端切一个小孔（直径1.2毫米），使20 G Y形IV导管的尖端通过（参见 材料表）。
   5. 将Y形导管的一个适配器端口与预填充有0.5 mL空气的3 mL注射器连接，另一个端口与预填充有2 mL温热的1.5%琼脂糖溶液（42°C）的3 mL注射器连接。
   6. 注入琼脂糖溶液以填充导管，然后将导管通过预切口推入气管中，长度为5-8毫米。
   7. 以约1 mL / 5 s的速度缓慢注入琼脂糖溶液。肺将沿近端至远端轴扩张。当每个肺叶的边缘充气时停止注射。
      注意:不要过度充血肺，因为这可能会使其破裂。琼脂糖溶液使年轻成年小鼠的整个肺膨胀的体积约为1.3±0.1 mL。
   8. 从另一个注射器注入0.2-0.3 mL空气，将导管和导电气道中的残留琼脂糖推到远端肺泡腔。
   9. 用一对弯曲的止血钳夹住气管（参见 材料表）。
3. 填充肺脉管系统。
   1. 在 1 mL 注射器中加入温热的 6% 明胶。连接到针头皮静脉导管，用明胶溶液填充导管，然后用针刺穿靠近下壁的右心室。
   2. 将针头推入右心室，长度为2-3 mm，并将针尖指向肺主动脉。
   3. 将0.2 mL明胶溶液缓慢注入右心室和肺动脉血管。
      注意:肺叶看起来稍微苍白，有适当的明胶充气。
   4. 注射后将针头保持在原位5分钟，通过将冰冷的HBSS溶液倒入心脏和肺部来冷却肺叶，然后将身体与解剖板一起放入4°C冰箱或冰上共10分钟。
   5. 用剪刀从周围的结缔组织中取出小鼠肺和心脏。然后，分离每个肺叶，并将它们保存在冰上的HBSS溶液中。

3. 将肺叶切成薄片

1. 用超强胶将肺叶修剪并连接到标本柱的顶部，并定向肺叶（图1A，B），以使切割方向垂直于从肺门到肺表面的大多数气道。
2. 使用带有新鲜薄剃须刀片的振动仪将肺叶切成150μm切片。将切片收集在预填充有冷HBSS溶液的100毫米无菌培养皿中。
   注:在开始切片之前，请设置适当的刀片移动速度和振荡频率。压缩模块的典型设置是速度级别 4 和振荡级别 4。
3. 将切片转移到装有DMEM / F-12培养基（20片/ 15 mL培养基/皿）的培养皿中，并在实验前将其保持在37°C培养箱中过夜。
   注意:小鼠PCLS可以在培养物中维持约7天而不会失去气道收缩反应¹⁷。肺动脉的寿命尚未得到彻底评估。在我们的观察中，它们在DMEM / F12培养基中保留完整的结构和血管增多至少3天。对于长期储存，小鼠PCLS可以放置在充满含有10%DMSO的DMEM / F12培养基的冷冻管中（每瓶1mL培养基中5片），在异丙醇填充的容器中冷冻至-80°C过夜，并在液氮中冷冻保存数周至^数月21。

4. 分析肺内气道和动脉的收缩反应

1. 将PCLS置于HBSS填充的24孔培养板中，每个孔中一个。将PCLS定位在孔的中间，然后用移液管取出HBSS溶液。
2. 在显微镜下在切片中找到目标气道和血管，然后使用带有预切中心孔（直径2-3mm）的尼龙网覆盖切片以暴露目标区域。
3. 在网状物的顶部放置一个空心金属垫圈，将切片固定到位（图2A）。
4. 加入600μL HBSS溶液以浸没PCLS。将切片静置10分钟，然后记录气道或血管的基线图像。
5. 通过用移液管小心地吸出空白的HBSS溶液并用激动剂加入600μL HBSS，例如1μM甲基胆碱（MCh）或10nM内皮素来诱导气道或血管收缩（见 材料表）。
   注意:在乙酰甲胆碱或内皮素暴露之前，不需要将KCl刺激作为工具设定的标准。小鼠气道中100 mM的KCl刺激仅诱导小的和不规则的气道收缩（10%-15%）²⁰。同样，启动甲基胆碱刺激是强制性的，因为我们已经证实，相同的激动剂，例如甲基胆碱或5-羟色胺，在第一次和重复暴露时触发类似的气道收缩^20，22。
6. 在显微镜下观察反应，直到腔面积变化达到平衡状态，然后记录气道或血管图像进行分析。
7. 用移液管除去MCh或内皮素溶液，并加入具有相同激动剂浓度和松弛剂的新的600μL HBSS溶液;观察并记录气道或血管松弛。
8. 按照以下步骤量化气道或血管反应。
   1. 将图像加载到NIH赞助的免费软件斐济。
   2. 选择工具栏中的 "多边形选择 "以勾勒出每个帧上的气道或血管腔。
   3. 选择 分析>设置面积>测量值。
   4. 选择 "分析>测量 "以量化感兴趣的区域。结果显示在单独的窗口中，用于统计分析。

5. 分析气道或血管SMC的Ca²⁺ 信号传导

1. 准备Ca^{2 +} 染料上样缓冲液。
   1. 溶解Ca^{2 +} 染料，俄勒冈绿488 BAPTA-1-AM（见 材料表），50μg（一个小瓶）与10μLDMSO。
   2. 将0.2g多隆F-12粉末（见 材料表）溶解在1 mL DMSO中，以产生20%多隆溶液。
   3. 将10μL20%多隆溶液与10μLCa^{2 +} 染料- DMSO溶液混合。
   4. 通过将20μL混合物加入2mL HBSS溶液中加入200μM磺基溴巯，制成Ca 2⁺ 染料上样缓冲液（参见 材料表）。
2. 将15只小鼠PCLS置于2mL Ca^{2 +} 上样缓冲液中，并在30°C下孵育1小时。然后将切片与100μM磺基溴苯胺的2mL HBSS溶液中再移动30分钟，以便在室温下进行荧光染料去酯化。
3. 检测中小型机械的 Ca²⁺ 信令。
   1. 将Ca^{2 +} 染料切片放在大盖玻片上。
   2. 在 3 mL 注射器中填充高真空硅脂。将润滑脂挤入18 G钝化针，在薄片上方和下方的盖玻片上画出两条平行线。
   3. 在两条润滑脂管之间用尼龙网覆盖切片。将第二个盖板玻璃放在网状物的顶部，以产生一个由润滑脂密封的腔室（图3A）。
      注意:尼龙网对于将切片附着在底部盖玻片上，从而保持在高量级倒置物镜（例如40x油）的工作距离内至关重要。
   4. 通过手动或通过灌注系统移液，将HBSS 或激动 剂溶液从一端加入腔室中。在连续液体灌注的情况下，通过用纸巾或真空从另一端吸出液体从腔室中取出液体。
   5. 将 PCLS 腔室放在显微镜载物台上。使用定制的共振扫描共聚焦显微镜检测SMC²³的Ca 2⁺信号，激光扫描速率为15或30图像/ s。
      注意:或者，目前广泛使用的高速商用激光扫描共聚焦显微镜可以应用于PCLS中肺SMC的Ca^{2 +} 信号传导测定。
4. 量化SMC中的Ca^{2 +} 荧光。
   1. 将录制的图像序列加载到 FIJI 并选择 "图像>键入> 8 位灰度。
   2. 在工具栏中选择" 矩形选择" ，并在平滑肌单元中定义一个 5 像素 x 5 像素的感兴趣区域 （ROI）。
   3. 选择 分析>设置测量值>平均灰 度值，表示 Ca²⁺ 荧光强度。
   4. 如果 ROI 的位置随 SMC 收缩而变化，请选择分析>逐帧 测量 Ca²⁺ 荧光强度。
   5. 如果 SMC 的 ROI 在一堆图像中保持在相似的位置，请选择 "图像>堆栈">测量 Ca²⁺ 荧光强度的堆栈。
      注意:当 SMC 在图像堆栈中随收缩移动时，可以插入自定义编写的宏来跟踪 SMC 内的 ROI，并逐帧自动测量 ROI 的 Ca²⁺ 强度（灰度值）。

结果

小鼠 PCLS 制剂保留完整的肺内气道和动脉
在倒置相差显微镜下观察了150μm厚的PCLS。在小鼠肺中，传导性气道伴随着从肺叶到外周肺的肺内动脉。小鼠PCLS中具有代表性的肺气道 - 动脉束如图 2B所示。气道可以很容易地通过长方体上皮细胞识别，其内腔内表面有活跃的螺旋跳动。相反，附近的肺动脉以扁平内皮为特征。当到达外周肺野时，导电气道分支到呼吸?...

讨论

PCLS的制备涉及几个关键步骤。首先，必须均匀地使肺叶充气，以避免琼脂糖分布不均匀导致组织硬度的变化。由于液体琼脂糖在低于37°C的温度下在薄导管或气道中迅速凝胶化，由此产生的远端肺野填充缺陷可能增加肺组织硬度的差异，并在振动切片期间引起组织撕裂。因此，可以将低熔点琼脂糖溶液保持在42°C的水浴中，并在解剖台上使用加热灯，以避免琼脂糖凝胶化。快速注射可以将更多的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter