שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .

Abstract

תאי שריר חלקים (SMC) מתווכים את התכווצות דרכי הנשימה ואת העורק התוך-פולמונרי כדי לשנות את ההתנגדות לזרימת האוויר ואת זרימת הדם הריאתית, בהתאמה, ומכאן ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס של מערכת הריאה. דה-רגולציה של התכווצות SMC תורמת למספר מחלות ריאה, כולל אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי. עם זאת, בשל גישה מוגבלת לרקמות והיעדר מערכות תרבית לשמירה על פנוטיפים של in vivo SMC, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התכווצות SMC ללא פיקוח במחלות אלה נותרים מזוהים במלואם. פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) מציעה מודל ex vivo שעוקף את הקשיים הטכניים הללו. כמקטע רקמת ריאה חי ודק, ה-PCLS שומר על SMC בסביבה טבעית ומאפשר מעקב באתרו אחר התכווצות SMC ואיתות Ca²⁺ תוך-תאי המווסת את התכווצות ה-SMC. כאן, פרוטוקול הכנה מפורט של PCLS עכבר מסופק, אשר משמר דרכי אוויר שלמות ועורקים intrapulmonary. פרוטוקול זה כולל שני שלבים חיוניים לפני הכפפת אונת הריאה לחיתוך: ניפוח דרכי הנשימה עם אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה דרך קנה הנשימה ומילוי כלי ריאתיים בג'לטין דרך החדר הימני. ה- PCLS שהוכן באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש לבדיקות ביולוגיות כדי להעריך את ויסות ההתכווצות בתיווך Ca²⁺ של SMC הן בדרכי הנשימה והן בתאי העורקים התוך-פולמונריים. כאשר הוא מיושם על מודלים של עכברים של מחלות בדרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר חקירה תפקודית של SMC, ובכך מספק תובנה לגבי המנגנון הבסיסי של דה-רגולציה של התכווצות SMC במחלות.

Introduction

תא שריר חלק (SMC) הוא סוג של תא מבני עיקרי בריאה, השוכן בעיקר בדופן המדיה של דרכי הנשימה וכלי הדם הריאתיים. עסקים קטנים ובינוניים מתכווצים כדי לשנות את קליבר הלומינלי, ובכך לווסת את זרימת האוויר והדם ^1,2. לכן, ויסות התכווצות של SMCs חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס של אוורור אוויר וזרימת ריאות. לעומת זאת, התכווצות SMC חריגה מעוררת מחלות חסימתיות בדרכי הנשימה או בכלי הדם הריאתיים כמו אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי עורקי. עם זאת, ההערכה התפקודית של SMCs של הריאה אותגרה על ידי גישה מוגבלת לרקמת הריאה, במיוחד אלה דרכי הנשימה הקטנות והמיקרו-ווסלים בחלק הדיסטלי של הריאה ^2,3. הפתרונות הנוכחיים משתמשים בבדיקות עקיפות, כגון מדידת עמידות זרימת האוויר על ידי Flexivent כדי לשקף התכווצות דרכי הנשימה, ובדיקת לחץ דם עורקי ריאתי על ידי צנתור לב ימין כדי להעריך את כלי הדם הריאתיים ^4,5. עם זאת, לבדיקות עקיפות אלה יש חסרונות מרובים, כגון בלבול על ידי גורמים מבניים, כישלון ללכוד את המגוון המרחבי של תגובות דרכי הנשימה או כלי הדם בכל סולם הריאות ^6,7, ובלתי מתאים למחקר המכניסטי של ויסות התכווצות ברמה התאית. לכן, גישות חלופיות המשתמשות בתאים ראשוניים מבודדים, רצועות שריר קנה הנשימה/ברונכי ^8,9, או מקטעי כלי דם גדולים¹⁰ יושמו עבור מחקר SMC במבחנה. עם זאת, לשיטות אלה יש גם מגבלות. לדוגמה, התאמה פנוטיפית מהירה של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים בתנאי התרבית^11,12 הופכת את זה לבעייתי לאקסטרפולציה של ממצאים מתרבית תאים להגדרות in vivo. בנוסף, ייתכן שהפנוטיפ המתכווץ של SMCs בדרכי הנשימה הפרוקסימליות המבודדות או בקטעי כלי הדם של כלי הדם אינו מייצג את ה-SMCs בריאה הדיסטלית ^6,7. יתר על כן, מדידת כוח השריר ברמת הרקמה נותרה מנותקת מאירועים מולקולריים ותאיים החיוניים לתובנה מכניסטית לגבי ויסות התכווצות.

פרוסת ריאה חתוכה במדויק (PCLS), מקטע רקמת ריאה חיה, מספקת כלי אקס-ויוו אידיאלי לאפיון SMCs ריאתיים במיקרו-סביבה כמעט in vivo (כלומר, ארכיטקטורה רב-תאית משומרת ואינטראקציה)¹³. מאז שד"ר פלאקה ופישר הציגו לראשונה את הכנת פרוסות הריאה מריות של חולדה מנופחת אגרוז וריאות אוגר בשנות ה-80^{של המאה ה-20, 14,15}, טכניקה זו קודמה ברציפות כדי לספק ל-PCLSs איכות גבוהה יותר ורב-תכליתיות רבה יותר למחקר ביו-רפואי. שיפור משמעותי אחד הוא שיפור שימור עורקי הריאה על ידי עירוי ג'לטין בנוסף לניפוח הריאות עם אגרוז דרך קנה הנשימה. כתוצאה מכך, הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים נשמרים שלמים ב- PCLS להערכת ex vivo ¹⁶. יתר על כן, ה- PCLS הוא בר קיימא במשך זמן ממושך בתרבות. לדוגמה, ל-PCLS של עכברים לא היה שינוי משמעותי בכדאיות התאים ובחילוף החומרים במשך 12 ימים לפחות בתרבית, כמו גם, הם שמרו על התכווצות דרכי הנשימה עד 7 ימים^ו-17 ימים. בנוסף, PCLS שומר על דרכי אוויר או כלי דם בגדלים שונים לבדיקות התכווצות והרפיה. יתר על כן, ניתן לבחון איתות Ca²⁺ תוך-תאי של SMCs, הגורם הקובע של התכווצות התאים, באמצעות צבעי כתב Ca²⁺ המצולמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי או 2-פוטון¹³.

בהתחשב ביישום הנרחב של מודל העכבר בחקר הריאות, פרוטוקול מפורט מתואר כאן להכנת PCLS של עכבר עם דרכי נשימה שלמות ועורקים תוך-פולמונריים למחקר ריאות ex vivo . באמצעות ה- PCLSs המוכנים, הדגמנו לאחר מכן כיצד להעריך את תגובות דרכי הנשימה והעורקים הריאתיים לגירויים מכווצים או מרגיעים. בנוסף, מתוארת גם השיטה של טעינת ה- PCLS עם צבע כתב Ca²⁺ ולאחר מכן הדמיה של איתות Ca²⁺ של SMCs הקשורים לתגובות מתכווצות או מרגיעות.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס. עכברים זכרים מסוג C57/B6 מסוג בר, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי.

1. הכנה ניסיונית

1. הכן את פתרון העבודה.
   1. הכינו תמיסת מלח מאוזנת של 1x Hank (HBSS, עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, ו-pH מאוזן עם 20 mM HEPES, ראו טבלת חומרים). השתמש בפתרון HBSS כדי להכין ולעבד את ה- PCLS. שמור על פתרון HBSS קר על קרח בעת הכנת PCLSs.
2. הכן את מדיום התרבית של PCLS על ידי השלמת מדיום הנשר המהונדס של Dulbecco ו- F-12 (DMEM-F12) עם חומר אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (יחס נפח של 1:100, ראה טבלת חומרים).
3. מכינים 1.5% אגרוז ו-6% תמיסת ג'לטין.
   1. ערבבו את נקודת ההיתוך הנמוכה (LMP) של אגרוז או אבקת ג'לטין (ראו טבלת חומרים) עם תמיסת HBSS בנפרד בצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מ"ל (או צינורות של 50 מ"ל אם נפח התמיסה >10 מ"ל) לריכוזים סופיים.
      הערה: נפח כולל של תמיסת אגרוז = 5 מ"ל / עכבר x מספר עכברים; תמיסת ג'לטין = 2 מ"ל/עכבר x מספר עכברים.
   2. מחממים את צינורות התמיסה במים רותחים עד שהאבקה מתמוססת לחלוטין. יש לשמור על תמיסות אגרוז וג'לטין באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס.
      הערה: מנורת חימום ליד שולחן הנתיחה יכולה להיות שימושית כדי לשמור על סביבת ההפעלה חמה ולמנוע התמצקות של תמיסת אגרוז לפני שהיא מוזרקת לריאות העכבר.
4. הטביעו את כל כלי הנתיחה, כולל זוג מספריים מתפרקים, שני זוגות של מלקחיים מיקרו-דיס-דיסציפליים מעוקלים, וזוג מלקחיים המוסטטיים בתמיסת אתנול של 70% למשך 20 דקות לפחות לצורך עיקור.
5. יש לשמור על ויברטום מוכן (ראו טבלת חומרים) כדי לחלק את רקמת הריאה לפרוסות דקות.
6. שמור מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך עם מצלמת CCD כדי להעריך את תגובות התכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם ומיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר שנבנה בהתאמה אישית (ראה טבלת חומרים) כדי להעריך את האיתות Ca²⁺ ב- SMCs ריאתיים¹⁸.

2. אינפלציה של ריאות עכבר עם תמיסת אגרוז וג'לטין

1. להרדים את העכבר.
   1. מניחים את העכבר בתא פלסטיק (כ-750 ס"מ³) עם 5% איזופלורן. שמור את העכבר בתא עד שהוא מפסיק לנשום למשך דקה אחת לפחות.
      הערה: שיטות עיקריות אחרות להמתת חסד, כגון הזרקה תוך-צפקית של קטמין (240 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (32 מ"ג/ק"ג)¹⁹ או פנטוברביטל (0.3 מ"ל)²⁰, יכולות להיות מיושמות כחלופות לאיזופלורן בשאיפה.
   2. מניחים את גוף העכבר על לוח דיסקציה בתנוחת השכיבה. קבעו את הגוף במקומו על ידי הצמדת הזנב, הכפות הקדמיות והראש עם מחטי מזרק 25 גרם, וחיטוי הגוף עם תרסיס אתנול 70%.
   3. חותכים את בטנו של העכבר במספריים כירורגיים (חתך, כ-2 ס"מ אורך x 2 ס"מ רוחב). לאחר מכן, חתכו את אבי העורקים הבטני כדי לרוקן את נפח הדם.
2. לנפח אונות ריאה בעקבות השלבים הבאים.
   1. פתחו את חלל החזה בזהירות לאורך עצם החזה וכלוב הצלעות התחתון הדו-צדדי מעל הסרעפת, וצפו באונות הריאה קורסות עם פתיחת חלל החזה.
   2. הסר חלק מכלובי הצלעות הגחוניים הדו-צדדיים כדי לחשוף את הלב. הימנעו מנזק לריאות על ידי הפניית קצה המספריים החד הרחק מרקמת הריאה.
   3. השתמשו במלקחיים כדי להפריד בין התימוס לרקמות הרכות בצוואר העכבר כדי לחשוף את קנה הנשימה.
   4. חותכים חור קטן (בקוטר 1.2 מ"מ) בקצה העליון של קנה הנשימה ומאפשרים מעבר של קצה של צנתר IV בצורת 20 G Y (ראו טבלת חומרים).
   5. חבר יציאת מתאם אחת של הצנתר בצורת Y עם מזרק 3 מ"ל ממולא מראש עם 0.5 מ"ל של אוויר, ואת היציאה השנייה עם מזרק 3 מ"ל ממולא מראש עם 2 מ"ל של תמיסת אגרוז חמה של 1.5% (42 מעלות צלזיוס).
   6. הזריקו תמיסת אגרוז כדי למלא את הצנתר ולאחר מכן דחפו את הצנתר דרך הפתח החתוך מראש לקנה הנשימה באורך של 5-8 מ"מ.
   7. יש להזריק באיטיות את תמיסת האגרוס בסביבות 1 מ"ל/5 שניות. הריאה תתרחב לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי. יש להפסיק את ההזרקה כאשר הקצה של כל אונת ריאה מנופח.
      הערה: אין לנפח יתר על המידה את הריאה, מכיוון שהדבר עלול לקרוע אותה. נפח תמיסת אגרוז לניפוח כל הריאה של עכבר בוגר צעיר הוא כ 1.3 ± 0.1 מ"ל.
   8. הזריקו 0.2-0.3 מ"ל אוויר מהמזרק השני כדי לדחוף את שאריות האגרוז בצנתר ואת דרכי הנשימה המוליכות לחלל הנאדיות הדיסטלי.
   9. קליפ סוגר את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים המוסטטיים מעוקלים (ראו טבלת חומרים).
3. למלא את כלי הדם הריאתיים.
   1. יש למלא מזרק 1 מ"ל בג'לטין חם של 6%. מתחברים לצנתר וריד קרקפת מחט, ממלאים את הצנתר בתמיסת ג'לטין, ואז מנקבים את החדר הימני קרוב לדופן הנחותה עם המחט.
   2. דוחפים את המחט לחדר הימני באורך 2-3 מ"מ ומכוונים את קצה המחט לעורק הריאתי הראשי.
   3. הזריקו 0.2 מ"ל של תמיסת ג'לטין באיטיות לתוך החדר הימני וכלי העורקים הריאתיים.
      הערה: אונות הריאה נראות מעט חיוורות יותר עם אינפלציית ג'לטין מתאימה.
   4. שמור את המחט במקומה במשך 5 דקות לאחר ההזרקה, מצנן את אונות הריאה על ידי מזיגת תמיסת HBSS קר כקרח על הלב והריאות, ולאחר מכן מניח את הגוף עם לוח הנתיחה במקרר של 4 מעלות צלזיוס או על קרח במשך 10 דקות בסך הכל.
   5. הסר את ריאות העכבר ואת הלב מרקמות החיבור הסובבות אותו במספריים. לאחר מכן, הפרד כל אונת ריאות ושמור אותן בתמיסת HBSS על קרח.

3. חתך אונות הריאה לפרוסות דקות

1. גזמו והצמידו את אונת הריאה בחלק העליון של עמוד הדגימה עם superglue, וכיוונו את האונה (איור 1A,B) כדי לאפשר לכיוון החיתוך להיות מאונך לרוב דרכי הנשימה מההילה ועד לפני השטח של הריאה.
2. השתמשו בוויברטום עם סכין גילוח דקה ורעננה כדי לחתוך את אונת הריאה לפרוסות של 150 מיקרומטר. אספו את הפרוסות בצלחות פטרי סטריליות בקוטר 100 מ"מ במילוי מראש בתמיסת HBSS קרה.
   הערה: הגדר מהירות תנועה מתאימה של להב ותדירות תנודה לפני תחילת החיתוך. הגדרה טיפוסית עבור דחיסה היא מהירות רמה 4 ורמת תנודה 4.
3. מעבירים פרוסות לצלחות פטרי במילוי מדיום תרבית DMEM/F-12 (20 פרוסות/15 מ"ל בינוני/מנה) ושומרים אותן באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הניסויים.
   הערה: PCLSs של עכברים יכולים להישמר בתרבית במשך כ-7 ימים מבלי לאבד את תגובות ההתכווצות של דרכי הנשימה¹⁷. אריכות הימים של עורקי הריאה לא הוערכה ביסודיות. בתצפית שלנו, הם שומרים על מבנה שלם וחיל כלי דם במשך 3 ימים לפחות במדיום DMEM/F12. לאחסון לטווח ארוך, ניתן למקם PCLS של עכברים בקריוביאלים מלאים במדיום DMEM/F12 המכיל 10% DMSO (5 פרוסות במדיום 1 מ"ל לכל בקבוקון), להקפיא במיכל מלא באלכוהול איזופרופיל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולהקפאה בחנקן נוזלי במשך שבועות עד חודשים²¹.

4. ניתוח תגובות התכווצות של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים

1. הניחו את ה-PCLS בצלחת תרבית מלאה ב-HBSS עם 24 בארות, אחת בכל באר. אתר את ה- PCLS באמצע הבאר, ולאחר מכן הסר את פתרון HBSS עם פיפטה.
2. מצאו את דרכי הנשימה וכלי השיט של המטרה בפרוסה שמתחת למיקרוסקופ, ואז כסו את הפרוסה באמצעות רשת ניילון עם חור מרכזי חתוך מראש (בקוטר 2-3 מ"מ) כדי לחשוף את אזור המטרה.
3. הניחו מכונת כביסה חלולה ממתכת על גבי הרשת כדי להחזיק את הפרוסות במקומן (איור 2A).
4. הוסף 600 μL של פתרון HBSS כדי להטביע את ה- PCLS. הנח את הפרוסה למשך 10 דקות, ולאחר מכן הקלט את התמונות הבסיסיות של דרכי הנשימה או כלי הדם.
5. לגרום להתכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם על ידי יניקה זהירה של תמיסת HBSS הריקה באמצעות פיפטה והוספת 600 μL של HBSS עם אגוניסט, כגון 1 μM של מתכולין (MCh) או 10 ננומטר של אנדותלין (ראו טבלת חומרים).
   הערה: גירוי KCl כתקן סט כלים אינו נדרש לפני חשיפה למתכולין או אנדותלין. 100 mM של גירוי KCl בדרכי הנשימה של העכבר רק גורם להתכווצות קטנה ולא סדירה של דרכי הנשימה (10%-15%)²⁰. כמו כן, גירוי מתכולין ראשוני אינו חובה מכיוון שאישרנו כי אותו אגוניסט, למשל, מתכולין או סרוטונין, גורם להתכווצות דומה בדרכי הנשימה בחשיפה הראשונה והחוזרת על עצמה^20,22.
6. שימו לב לתגובה מתחת למיקרוסקופ עד ששינוי האזור הזוהר יגיע למצב של שיווי משקל, ולאחר מכן תעדו את תמונות דרכי הנשימה או כלי הדם לניתוח.
7. הסר MCh או תמיסת אנדותלין עם פיפטה והוסף תמיסת HBSS חדשה של 600 μL עם אותו ריכוז אגוניסטי וחומר מרגיע; להתבונן ולתעד את הרפיית דרכי הנשימה או כלי הדם.
8. כימתו את תגובת דרכי הנשימה או כלי הדם בהתאם לשלבים הבאים.
   1. טען את התמונות לתוכנה חופשית בחסות NIH FIJI.
   2. בחר את בחירת המצולע בסרגל הכלים כדי לתאר את דרכי הנשימה או לומן כלי הדם בכל מסגרת.
   3. בחר נתח > הגדרת מדידות > אזור.
   4. בחר נתח > מדידה כדי לכמת את תחום העניין. התוצאות מוצגות בחלון נפרד לניתוח סטטיסטי.

5. ניתוח איתות Ca²⁺ של SMCs של דרכי הנשימה או כלי הדם

1. הכינו את מאגר טעינת הצבע Ca²⁺ .
   1. להמיס Ca²⁺ צבע, אורגון ירוק 488 BAPTA-1-AM (ראה טבלת חומרים), 50 מיקרוגרם (בקבוקון אחד) עם 10 μL של DMSO.
   2. ממיסים 0.2 גרם של אבקת F-12 פלורונית (ראו טבלת חומרים) ב-1 מ"ל של DMSO כדי ליצור תמיסה פלורונית של 20%.
   3. ערבבו 10 μL של תמיסת פלורונית של 20% עם 10 μL של תמיסת Ca²⁺ צבע-DMSO.
   4. הפוך את מאגר טעינת הצבעים Ca²⁺ על ידי הוספת 20 μL מהתערובת ל-2 מ"ל של תמיסת HBSS עם 200 μM של סולפובירומופתליין (ראה טבלת חומרים).
2. מקם 15 PCLS של עכבר ב- 2 מ"ל של מאגר טעינה Ca²⁺ ודגירה בטמפרטורה של 30 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן העבירו את הפרוסות ל-2 מ"ל של תמיסת HBSS עם 100 μM של סולפובירומופתליין למשך 30 דקות נוספות עבור דה-אסטריפיקציה של צבע פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר.
3. זהה את האיתות Ca²⁺ של SMCs.
   1. הניחו פרוסות Ca²⁺ עמוסות צבע על כיסוי גדולה.
   2. מלאו מזרק 3 מ"ל בשומן סיליקון ואקום גבוה. סחטו את השומן דרך מחט קהה של 18 גרם כדי לצייר שני קווים מקבילים על פני זכוכית הכיסוי מעל ומתחת לפרוסה.
   3. מכסים את הפרוסה באמצעות רשת ניילון בין שני קווי שומן. הניחו את הכיסוי השנייה על גבי הרשת כדי ליצור תא אטום על ידי שומן בצדדים (איור 3A).
      הערה: רשת הניילון חיונית כדי לשמור על הפרוסה מחוברת לכיסוי התחתון ובכך להישאר במרחק העבודה של מטרה הפוכה בעוצמה גבוהה, כגון שמן 40x.
   4. הוסף HBSS או תמיסה אגוניסטית לתוך התא מקצה אחד על ידי צנרת ידנית או באמצעות מערכת פרפוזיה. הסר את הנוזל מהתא על ידי יניקה מהקצה השני עם נייר טישו או ואקום במקרה של זלוף נוזלים רציף.
   5. שים את תא ה- PCLS על במת המיקרוסקופ. זהה את האיתות Ca²⁺ של SMC²³ באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת תהודה שנבנה בהתאמה אישית עם קצב סריקת לייזר של 15 או 30 תמונות לשנייה.
      הערה: לחלופין, ניתן ליישם מיקרוסקופ קונפוקלי מסחרי לסריקת לייזר במהירות גבוהה, הזמין באופן נרחב כיום, בבדיקת האיתות Ca²⁺ של SMCs ריאתיים ב- PCLS.
4. לכמת את הפלואורסצנציה Ca²⁺ ב-SMCs.
   1. טען את רצף התמונות המוקלטות ל- FIJI ובחר את סוג > התמונה > גווני אפור של 8 סיביות.
   2. בחר את בחירת המלבן בסרגל הכלים והגדר אזור עניין של 5 פיקסלים x 5 פיקסלים (ROI) בתא שריר חלק.
   3. בחר נתח > הגדר מדידות > ערך אפור ממוצע , המייצג את עוצמת הפלואורסצנציה Ca²⁺ .
   4. אם המיקום של החזר השקעה משתנה עם התכווצות SMC, בחר נתח > למדוד את העוצמה הפלואורסצנטית Ca²⁺ מסגרת אחר מסגרת.
   5. אם ההחזר על ההשקעה של SMC נשאר במיקום דומה בערימה של תמונות, בחר Image > Stacks > מחסניות מדידה של עוצמת הפלואורסצנט Ca²⁺ .
      הערה: ניתן לחבר מאקרו שנכתב בהתאמה אישית כדי לעקוב אחר ההחזר על ההשקעה בתוך ה- SMC כאשר הוא נע עם התכווצות במחסנית תמונות ומודד באופן אוטומטי את עוצמת Ca²⁺ (ערך אפור) של ROI מסגרת אחר מסגרת.

תוצאות

הכנת PCLS של עכבר המשמרת דרכי אוויר ועורקים תוך-פולמונריים שלמים
PCLS בעובי 150 מיקרומטר נצפה תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה ההפוכה. בריאות עכבר, דרכי הנשימה המוליכות מלוות בעורקים תוך-פולמונריים, העוברים מההילוס לריאה ההיקפית. צרור עורקי דרכי הנשימה הריאתיים הייצוגי ב-PCLS של עכבר מוצ?...

Discussion

הכנת PCLS כוללת מספר שלבים קריטיים. ראשית, חיוני לנפח את אונת הריאה באופן הומוגני כדי למנוע את השונות של נוקשות הרקמה מהתפלגות אגרוז לא אחידה. מכיוון שהאגרוז הנוזלי מתנגש במהירות בצנתרים דקים או בדרכי הנשימה בטמפרטורה הנמוכה מ-37 מעלות צלזיוס, פגם המילוי שנוצר כתוצאה מכך בשדה הריאה הדיסטלי ע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter