Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .

Abstract

Le cellule muscolari lisce (SMC) mediano la contrazione delle vie aeree e dell'arteria intrapolmonare per modificare rispettivamente la resistenza al flusso d'aria e la circolazione polmonare, svolgendo quindi un ruolo critico nell'omeostasi del sistema polmonare. La deregolamentazione della contrattilità SMC contribuisce a diverse malattie polmonari, tra cui l'asma e l'ipertensione polmonare. Tuttavia, a causa del limitato accesso ai tessuti e della mancanza di sistemi di coltura per mantenere fenotipi SMC in vivo , i meccanismi molecolari alla base della contrattilità SMC deregolata in queste malattie rimangono pienamente identificati. La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS) offre un modello ex vivo che aggira queste difficoltà tecniche. Come sezione di tessuto polmonare vivo e sottile, il PCLS mantiene l'SMC in un ambiente naturale e consente il monitoraggio in situ della contrazione SMC e della segnalazione intracellulare Ca²⁺ che regola la contrattilità SMC. Qui viene fornito un protocollo dettagliato di preparazione PCLS del topo, che conserva intatte le vie aeree e le arterie intrapolmonari. Questo protocollo prevede due passaggi essenziali prima di sottoporre il lobo polmonare all'affettamento: gonfiare le vie aeree con agarosio a basso punto di fusione attraverso la trachea e riempire i vasi polmonari con gelatina attraverso il ventricolo destro. Il PCLS preparato utilizzando questo protocollo può essere utilizzato per biosaggi per valutare la regolazione contrattile mediata da Ca²⁺ di SMC sia nelle vie aeree che nei compartimenti arteriosi intrapolmonari. Quando applicato a modelli murini di malattie respiratorie, questo protocollo consente l'indagine funzionale di SMC, fornendo così informazioni sul meccanismo alla base della deregolazione della contrattilità SMC nelle malattie.

Introduzione

Le cellule muscolari lisce (SMC) sono un importante tipo di cellula strutturale nel polmone, che risiede principalmente nella parete media delle vie aeree e dei vasi polmonari. Gli SMC si contraggono per alterare il calibro luminale, regolando così l'aria e il flusso sanguigno ^1,2. Pertanto, la regolazione contrattile delle SMC è essenziale per mantenere l'omeostasi della ventilazione dell'aria e della circolazione polmonare. Al contrario, la contrattilità Aberrante SMC provoca vie aeree ostruttive o malattie vascolari polmonari come l'asma e l'ipertensione arteriosa polmonare. Tuttavia, la valutazione funzionale delle SMC polmonari è stata messa in discussione da un accesso limitato al tessuto polmonare, in particolare quelle piccole vie aeree e microvasi nella parte distale del polmone ^2,3. Le soluzioni attuali ricorrono a saggi indiretti, come la misurazione della resistenza del flusso d'aria da parte di Flexivent per riflettere la costrizione delle vie aeree e il controllo della pressione arteriosa polmonare mediante cateterizzazione del cuore destro per valutare la vasocontrazione polmonare ^4,5. Tuttavia, questi saggi indiretti presentano molteplici svantaggi, come essere confusi da fattori strutturali, non riuscire a catturare la diversità spaziale delle vie aeree o delle risposte vascolari nell'intera scala polmonare ^6,7 e inadatti allo studio meccanicistico della regolazione contrattile a livello cellulare. Pertanto, per lo studio SMC sono stati applicati approcci alternativi che utilizzano cellule primarie isolate, strisce muscolari trachea/bronchi ^8,9 o grandi segmenti vascolari¹⁰. Tuttavia, questi metodi hanno anche delle limitazioni. Ad esempio, un rapido adattamento fenotipico delle SMC primarie nella condizione di coltura^11,12 rende problematico estrapolare i risultati dalla coltura cellulare alle impostazioni in vivo. Inoltre, il fenotipo contrattile delle SMC nelle vie aeree prossimali isolate o nei segmenti vascolari può non rappresentare le SMC nel polmone distale ^6,7. Inoltre, la misurazione della forza muscolare a livello tissutale rimane dissociata dagli eventi molecolari e cellulari che sono essenziali per la comprensione meccanicistica della regolazione contrattile.

La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS), una sezione di tessuto polmonare vivo, fornisce uno strumento ex vivo ideale per caratterizzare le SMC polmonari in un microambiente quasi in vivo (cioè l'architettura e l'interazione multicellulare conservate)¹³. Da quando i dottori Placke e Fisher hanno introdotto per la prima volta la preparazione di fette polmonari da polmoni di ratto e criceto gonfiati di agarosio negli anni 1980 ^14,15, questa tecnica è stata continuamente avanzata per fornire AI PCLS una qualità superiore e una maggiore versatilità per la ricerca biomedica. Un miglioramento significativo è il miglioramento della conservazione arteriosa polmonare mediante infusione di gelatina oltre al gonfiaggio polmonare con agarosio attraverso la trachea. Di conseguenza, sia le vie aeree che le arterie polmonari sono mantenute intatte nel PCLS per la valutazione ex vivo ¹⁶. Inoltre, il PCLS è praticabile per un tempo prolungato in coltura. Ad esempio, i PCLS di topo non hanno avuto cambiamenti significativi nella vitalità cellulare e nel metabolismo per un minimo di 12 giorni in coltura, oltre a mantenere la contrattilità delle vie aeree fino a 7 giorni¹⁷. Inoltre, PCLS mantiene vie aeree o vasi di dimensioni diverse per i test di contrazione e rilassamento. Inoltre, la segnalazione intracellulare Ca²⁺ delle SMC, il fattore determinante della contrattilità cellulare, può essere dosata con coloranti Reporter Ca²⁺ ripresi da un microscopio confocale o a 2 fotoni¹³.

Considerando l'ampia applicazione del modello murino nella ricerca polmonare, qui viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di PCLS murini con vie aeree intatte e arterie intrapolmonari per la ricerca polmonare ex vivo . Utilizzando i PCLS preparati, abbiamo successivamente dimostrato come valutare le vie aeree e le risposte arteriose polmonari a stimoli costrittivi o rilassanti. Inoltre, viene descritto anche il metodo di caricamento del PCLS con colorante reporter Ca²⁺ e quindi l'imaging della segnalazione Ca²⁺ di SMC associati a risposte contrattili o rilassanti.

Protocollo

Tutta la cura degli animali era conforme alle linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee del Massachusetts General Hospital. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi di tipo C57/B6 di tipo selvatico, di 8 settimane di età.

1. Preparazione sperimentale

1. Preparare la soluzione di lavoro.
   1. Preparare 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, con Ca²⁺ e Mg²⁺, e pH bilanciato con 20 mM HEPES, vedere Tabella dei materiali). Utilizzare la soluzione HBSS per preparare ed elaborare il PCLS. Mantenere la soluzione HBSS fredda sul ghiaccio durante la preparazione dei PCLS.
2. Preparare il terreno di coltura di PCLS integrando l'Eagle Medium modificato di Dulbecco e l'F-12 (DMEM-F12) con un agente antibiotico-antimicotico (rapporto volume 1:100, vedere Tabella dei materiali).
3. Preparare la soluzione di agarosio all'1,5% e gelatina al 6%.
   1. Mescolare separatamente l'agarosio a basso punto di fusione (LMP) o la gelatina in polvere (vedere Tabella dei materiali) con la soluzione HBSS in tubi centrifughi sterili da 15 mL (o tubi da 50 mL se il volume della soluzione >10 mL) alle concentrazioni finali.
      NOTA: Volume totale della soluzione di agarosio = 5 ml/mouse x numero di topi; soluzione di gelatina = 2 ml/mouse x numero di topi.
   2. Riscaldare i tubi della soluzione in acqua bollente fino a quando la polvere non si dissolve completamente. Conservare le soluzioni di agarosio e gelatina a bagnomaria a 42 °C.
      NOTA: Una lampada riscaldante sul tavolo di dissezione può essere utile per mantenere caldo l'ambiente operativo e impedire che la soluzione di agarosi si solidifichi prima di essere iniettata nel polmone del topo.
4. Immergere tutti gli strumenti di dissezione, tra cui un paio di forbici di dissezione, due paia di pinze di micro-dissezione curve e un paio di pinze emostatiche in soluzione di etanolo al 70% per almeno 20 minuti per la sterilizzazione.
5. Tenere un vibratoma pronto (vedere Tabella dei materiali) per sezionare il tessuto polmonare in fette sottili.
6. Tenere un microscopio a contrasto di fase invertito con una telecamera CCD per valutare le risposte contrattili delle vie aeree o vascolari e un microscopio confocale a scansione laser personalizzato (vedere Tabella dei materiali) per valutare la segnalazione Ca²⁺ nelle SMC polmonari¹⁸.

2. Gonfiaggio dei polmoni di topo con soluzione di agarosio e gelatina

1. Eutanasia del mouse.
   1. Posizionare il mouse in una camera di plastica (circa 750 cm³) con il 5% di isoflurano. Tenere il mouse nella camera fino a quando non smette di respirare per almeno 1 minuto.
      NOTA: Altri metodi di eutanasia primaria, come l'iniezione intraperitoneale di ketamina (240 mg/Kg) e xilazina (32 mg/Kg)¹⁹ o pentobarbital (0,3 ml)²⁰, possono essere applicati in alternativa all'isoflurano per via inalatoria.
   2. Posizionare il corpo del mouse su una scheda di dissezione in posizione supina. Fissa il corpo in posizione bloccando la coda, le zampe anteriori e la testa con aghi per siringhe da 25 G e disinfetta il corpo con spray al 70% di etanolo.
   3. Tagliare l'addome del topo con le forbici chirurgiche (incisione, ~ 2 cm di lunghezza x 2 cm di larghezza). Quindi, tagliare l'aorta addominale per esaurire il volume del sangue.
2. Gonfiare i lobi polmonari seguendo i passaggi seguenti.
   1. Aprire attentamente la cavità toracica lungo lo sterno e la gabbia toracica inferiore bilaterale sopra il diaframma e osservare i lobi polmonari collassare quando la cavità toracica si apre.
   2. Rimuovere parte delle gabbie toraciche ventrali bilaterali per esporre il cuore. Evitare danni ai polmoni puntando la punta affilata della forbice lontano dal tessuto polmonare.
   3. Utilizzare una pinza per separare il timo e i tessuti molli nel collo del topo per esporre la trachea.
   4. Tagliare un piccolo foro (1,2 mm di diametro) all'estremità superiore della trachea che consente il passaggio della punta di un catetere IV a forma di Y da 20 G (vedi Tabella dei materiali).
   5. Collegare una porta adattatore del catetere a forma di Y con una siringa da 3 mL preriempita con 0,5 mL di aria e l'altra porta con una siringa da 3 mL preriempita con 2 mL di soluzione calda di agarosio all'1,5% (42 °C).
   6. Iniettare la soluzione di agarosio per riempire il catetere e quindi spingere il catetere attraverso l'apertura pretagliata nella trachea per 5-8 mm di lunghezza.
   7. Iniettare lentamente la soluzione di agarosio a circa 1 mL/5 s. Il polmone si espanderà lungo l'asse prossimale-distale. Interrompere l'iniezione quando il bordo di ciascun lobo polmonare è gonfiato.
      NOTA: Non gonfiare eccessivamente il polmone, in quanto ciò potrebbe romperlo. Il volume della soluzione di agarosio per gonfiare l'intero polmone di un topo giovane adulto è di circa 1,3 ± 0,1 ml.
   8. Iniettare 0,2-0,3 mL di aria dall'altra siringa per spingere l'agarosio residuo nel catetere e nelle vie aeree conduttive nello spazio degli alveoli distali.
   9. Clip chiudere la trachea con un paio di pinze emostatiche curve (vedi Tabella dei materiali).
3. Riempire la vascolarizzazione polmonare.
   1. Riempire una siringa da 1 mL con gelatina tiepida al 6%. Collegare a un catetere venoso del cuoio capelluto ad ago, riempire il catetere con una soluzione di gelatina, quindi perforare il ventricolo destro vicino alla parete inferiore con l'ago.
   2. Spingere l'ago nel ventricolo destro per 2-3 mm di lunghezza e puntare la punta dell'ago verso l'arteria polmonare principale.
   3. Iniettare lentamente 0,2 mL di soluzione di gelatina nel ventricolo destro e nei vasi arteriosi polmonari.
      NOTA: I lobi polmonari appaiono leggermente più chiari con un adeguato gonfiaggio della gelatina.
   4. Tenere l'ago in posizione per 5 minuti dopo l'iniezione, raffreddare i lobi polmonari versando la soluzione di HBSS ghiacciata sul cuore e sul polmone, quindi posizionare il corpo con il pannello di dissezione in un frigorifero a 4 °C o su ghiaccio per un totale di 10 minuti.
   5. Rimuovere il polmone e il cuore del topo dai tessuti connettivi circostanti con le forbici. Quindi, separare ogni lobo polmonare e tenerli in soluzione HBSS sul ghiaccio.

3. Sezionamento dei lobi polmonari a fette sottili

1. Tagliare e attaccare il lobo polmonare sulla parte superiore della colonna del campione con supercolla e orientare il lobo (Figura 1A, B) per consentire alla direzione di taglio di essere perpendicolare alla maggior parte delle vie aeree dall'hila alla superficie polmonare.
2. Utilizzare un vibratoma con una lama di rasoio sottile fresca per tagliare il lobo polmonare in fette da 150 μm. Raccogliere le fette in piastre di Petri sterili da 100 mm preriempite con soluzione fredda di HBSS.
   NOTA: impostare la velocità di movimento della lama e la frequenza di oscillazione appropriate prima di iniziare l'affettatura. Un'impostazione tipica per un Compresstom è Il livello di velocità 4 e il livello di oscillazione 4.
3. Trasferire le fette in piastre di Petri riempite con terreno di coltura DMEM / F-12 (20 fette / 15 ml medio / piatto) e mantenerle in un incubatore a 37 ° C durante la notte prima degli esperimenti.
   NOTA: i PCLS del mouse possono essere mantenuti in coltura per circa 7 giorni senza perdere le risposte contrattili delle vie aeree¹⁷. La longevità delle arterie polmonari non è stata valutata a fondo. Nella nostra osservazione, mantengono intatta la struttura e la vasoreazione per almeno 3 giorni nel mezzo DMEM / F12. Per la conservazione a lungo termine, i PCLS del mouse possono essere collocati in crioviali riempiti con un mezzo DMEM/F12 contenente il 10% di DMSO (5 fette in 1 mL di mezzo per flaconcino), congelati in un contenitore pieno di alcool isopropilico a -80 °C durante la notte e crioconservati in azoto liquido per settimane o mesi²¹.

4. Analisi delle risposte contrattili delle vie aeree e delle arterie intrapolmonari

1. Posizionare i PCLS in una piastra di coltura a 24 pozzetti riempita di HBSS, uno in ogni pozzetto. Individuare il PCLS al centro del pozzo, quindi rimuovere la soluzione HBSS con una pipetta.
2. Trova le vie aeree e il vaso bersaglio nella fetta al microscopio, quindi copri la fetta usando una rete di nylon con un foro centrale pretagliato (2-3 mm di diametro) per esporre l'area target.
3. Stendere una rondella metallica cava sopra la rete per mantenere le fette in posizione (Figura 2A).
4. Aggiungere 600 μL di soluzione HBSS per immergere il PCLS. Riposare la fetta per 10 minuti, quindi registrare le immagini di base delle vie aeree o dei vasi.
5. Indurre le vie aeree o la contrazione vascolare aspirando con cautela la soluzione vuota di HBSS con una pipetta e aggiungendo 600 μL di HBSS con un agonista, come 1 μM di metacolina (MCh) o 10 nM di endotelina (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: La stimolazione KCl come standard di set di strumenti non è richiesta prima dell'esposizione a metacolina o endotelina. 100 mM di stimolazione KCl nelle vie aeree del topo inducono solo una contrazione delle vie aeree piccola e irregolare (10%-15%)²⁰. Allo stesso modo, una stimolazione di metacolina primordiale non è obbligata in quanto abbiamo confermato che lo stesso agonista, ad esempio metacolina o serotonina, innesca una contrazione delle vie aeree simile alle prime e ripetitive esposizioni^20,22.
6. Osservare la reazione al microscopio fino a quando il cambiamento dell'area luminale raggiunge uno stato equilibratorio, quindi registrare le immagini delle vie aeree o vascolari per l'analisi.
7. Rimuovere MCh o soluzione di endotelina con una pipetta e aggiungere una nuova soluzione HBSS da 600 μL con la stessa concentrazione di agonista e un rilassante; osservare e registrare le vie aeree o il rilassamento vascolare.
8. Quantificare le vie aeree o la reazione vascolare seguendo i passaggi seguenti.
   1. Carica le immagini sul software libero sponsorizzato dal NIH FIJI.
   2. Selezionate selezione poligono nella barra degli strumenti per delineare le vie aeree o il lume vascolare su ciascun fotogramma.
   3. Selezionate Analizza (Analyze) > Imposta misure (Set Measurements > Area).
   4. Scegliere Analizza > Misura per quantificare l'area di interesse. I risultati sono mostrati in una finestra separata per l'analisi statistica.

5. Analisi della segnalazione Ca²⁺ delle vie aeree o delle SMC vascolari

1. Preparare il buffer di caricamento del colorante Ca² +.
   1. Sciogliere il colorante Ca²⁺ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (vedere Tabella dei materiali), 50 μg (una fiala) con 10 μL di DMSO.
   2. Sciogliere 0,2 g di polvere Pluronic F-12 (vedere Tabella dei materiali) in 1 mL di DMSO per generare una soluzione Pluronic al 20%.
   3. Miscelare 10 μL di soluzione pluronica al 20% con 10 μL di soluzione colorante-DMSO Ca² +.
   4. Fare il tampone di carico del colorante Ca²⁺ aggiungendo 20 μL della miscela a 2 mL di soluzione HBSS con 200 μM di sulfobromophthalein (vedere Tabella dei materiali).
2. Posizionare 15 PCLS del mouse in 2 mL di tampone di carico Ca²⁺ e incubare a 30 °C per 1 ora. Quindi spostare le fette a 2 mL di soluzione HBSS con 100 μM di sulfobromophthalein per ulteriori 30 minuti per la desterificazione del colorante fluorescente a temperatura ambiente.
3. Rileva la segnalazione Ca²⁺ di SMC.
   1. Posizionare le fette caricate con colorante Ca²⁺ su un grande coperchio di vetro.
   2. Riempire una siringa da 3 ml con grasso siliconico ad alto vuoto. Spremere il grasso attraverso un ago smussato da 18 G per disegnare due linee parallele attraverso il vetro di copertura sopra e sotto la fetta.
   3. Coprire la fetta con una rete di nylon tra due linee di grasso. Posizionare il secondo vetro di copertura sopra la rete per generare una camera sigillata da grasso sui lati (Figura 3A).
      NOTA: La rete di nylon è essenziale per mantenere la fetta attaccata al coperchio inferiore e quindi rimanere entro la distanza di lavoro di un obiettivo invertito di grandezza elevata, come l'olio 40x.
   4. Aggiungere HBSS o soluzione agonista nella camera da un'estremità mediante pipettaggio manuale o tramite un sistema di perfusione. Rimuovere il fluido dalla camera aspirando dall'altra estremità con carta velina o vuoto in caso di perfusione continua di fluido.
   5. Posizionare la camera PCLS sullo stadio del microscopio. Rileva la segnalazione Ca²⁺ di SMC²³ con un microscopio confocale a scansione risonante personalizzato con una velocità di scansione laser di 15 o 30 immagini/s.
      NOTA: In alternativa, un microscopio confocale a scansione laser commerciale ad alta velocità, ampiamente disponibile al momento, può essere applicato nel test di segnalazione Ca²⁺ di SMC polmonari in PCLS.
4. Quantificare la fluorescenza di Ca²⁺ nelle SMC.
   1. Caricare la sequenza di immagini registrata in FIJI e scegliere image > Type > scala di grigi a 8 bit.
   2. Selezionare la selezione del rettangolo nella barra degli strumenti e definire una regione di interesse (ROI) di 5 pixel x 5 pixel in una cellula muscolare liscia.
   3. Selezionate Analizza > Imposta misure (Set Measurements) > Valore grigio medio (Mean gray value), che rappresenta l'intensità di fluorescenza Ca² +.
   4. Se la posizione di un ROI cambia con la contrazione SMC, scegliete Analizza > Misura l'intensità fluorescente Ca²⁺ fotogramma per fotogramma.
   5. Se il ROI di SMC rimane in una posizione simile in una pila di immagini, scegliere Image > Stacks > Measure stack dell'intensità^{fluorescente Ca 2+} .
      NOTA: è possibile collegare una macro scritta su misura per tenere traccia del ROI all'interno dell'SMC quando si muove con contrazione in uno stack di immagini e misura automaticamente l'intensità Ca²⁺ (valore grigio) del ROI fotogramma per fotogramma.

Risultati

Preparazione PCLS del topo che preserva intatte le vie aeree e le arterie intrapolmonari
Un PCLS di 150 μm di spessore è stato osservato al microscopio a contrasto di fase invertito. Nei polmoni di topo, le vie aeree conduttive sono accompagnate da arterie intrapolmonari, che vanno dall'ilo al polmone periferico. Un fascio rappresentativo delle vie aeree-arterie polmonari in un PCLS di topo è mostrato nella Figura 2B. Le vie aeree possono essere facilmente identificate...

Discussione

La preparazione di PCLS comporta diversi passaggi critici. In primo luogo, è essenziale gonfiare il lobo polmonare in modo omogeneo per evitare la variazione della rigidità dei tessuti da distribuzione irregolare dell'agarosio. Poiché l'agarosio liquido si gelifica rapidamente in cateteri sottili o vie aeree a una temperatura inferiore a 37 °C, il conseguente difetto di riempimento nel campo polmonare distale potrebbe aumentare la disparità di rigidità del tessuto polmonare e causare lacerazione del tessuto durante...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter