Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar

Resumen

El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .

Resumen

Las células del músculo liso (SMC) median la contracción de las vías respiratorias y la arteria intrapulmonar para modificar la resistencia al flujo de aire y la circulación pulmonar, respectivamente, desempeñando así un papel crítico en la homeostasis del sistema pulmonar. La desregulación de la contractilidad de SMC contribuye a varias enfermedades pulmonares, incluyendo el asma y la hipertensión pulmonar. Sin embargo, debido al acceso limitado a los tejidos y la falta de sistemas de cultivo para mantener fenotipos de SMC in vivo , los mecanismos moleculares subyacentes a la contractilidad desregulada de SMC en estas enfermedades permanecen completamente identificados. La rodaja pulmonar cortada con precisión (PCLS) ofrece un modelo ex vivo que evita estas dificultades técnicas. Como una sección de tejido pulmonar delgado y vivo, el PCLS retiene SMC en un entorno natural y permite el seguimiento in situ de la contracción de SMC y la señalización intracelular de Ca^{2 +} que regula la contractilidad de SMC. Aquí, se proporciona un protocolo detallado de preparación de PCLS de ratón, que preserva las vías respiratorias intactas y las arterias intrapulmonares. Este protocolo implica dos pasos esenciales antes de someter el lóbulo pulmonar a corte: inflar la vía aérea con agarosa de bajo punto de fusión a través de la tráquea y rellenar los vasos pulmonares con gelatina a través del ventrículo derecho. El PCLS preparado utilizando este protocolo se puede utilizar para bioensayos para evaluar la regulación contráctil mediada por Ca²⁺ de SMC tanto en la vía aérea como en los compartimentos arteriales intrapulmonares. Cuando se aplica a modelos de ratón de enfermedades respiratorias, este protocolo permite la investigación funcional de SMC, proporcionando así información sobre el mecanismo subyacente de desregulación de la contractilidad de SMC en enfermedades.

Introducción

La célula del músculo liso (SMC) es un tipo de célula estructural importante en el pulmón, que reside principalmente en la pared media de las vías respiratorias y los vasos pulmonares. Los SMC se contraen para alterar el calibre luminal, regulando así el aire y el flujo sanguíneo ^1,2. Por lo tanto, la regulación contráctil de los SMC es esencial para mantener la homeostasis de la ventilación del aire y la circulación pulmonar. Por el contrario, la contractilidad aberrante de SMC provoca enfermedades vasculares pulmonares o obstructivas de las vías respiratorias como el asma y la hipertensión arterial pulmonar. Sin embargo, la evaluación funcional de los SMC pulmonares se ha visto desafiada por el acceso limitado al tejido pulmonar, especialmente aquellas vías respiratorias pequeñas y microvasos en la parte distal del pulmón ^2,3. Las soluciones actuales recurren a ensayos indirectos, como la medición de la resistencia al flujo de aire por Flexivent para reflejar la constricción de las vías respiratorias, y la comprobación de la presión arterial pulmonar mediante cateterismo cardíaco derecho para evaluar la vasocontracción pulmonar ^4,5. Sin embargo, estos ensayos indirectos tienen múltiples desventajas, como ser confundidos por factores estructurales, no capturar la diversidad espacial de las respuestas respiratorias o vasculares en toda la escala pulmonar ^6,7, e inadecuados para el estudio mecanicista de la regulación contráctil a nivel celular. Por lo tanto, se han aplicado enfoques alternativos utilizando células primarias aisladas, tiras musculares de tráquea / bronquios ^8,9 o grandes segmentos vasculares¹⁰ para el estudio SMC in vitro. Sin embargo, estos métodos también tienen limitaciones. Por ejemplo, una rápida adaptación fenotípica de los SMC primarios en la condición de cultivo^11,12 hace que sea problemático extrapolar los hallazgos del cultivo celular a los entornos in vivo. Además, el fenotipo contráctil de las CME en los segmentos aislados de la vía aérea proximal o vascular puede no representar las CME en el pulmón distal ^6,7. Además, la medición de la fuerza muscular a nivel tisular permanece disociada de los eventos moleculares y celulares que son esenciales para la comprensión mecanicista de la regulación contráctil.

La rebanada pulmonar cortada con precisión (PCLS), una sección de tejido pulmonar vivo, proporciona una herramienta ex vivo ideal para caracterizar las SMC pulmonares en un microambiente casi in vivo (es decir, arquitectura e interacción multicelular preservada)¹³. Desde que los doctores Placke y Fisher introdujeron por primera vez la preparación de rodajas pulmonares a partir de pulmones de rata y hámster inflados con agarosa en la^{década de 1980 14,15}, esta técnica se ha avanzado continuamente para proporcionar a los PCLS una mayor calidad y una mayor versatilidad para la investigación biomédica. Una mejora significativa es la mejora de la preservación arterial pulmonar mediante infusión de gelatina, además de la inflación pulmonar con agarosa a través de la tráquea. Como resultado, tanto las vías respiratorias como las arterias pulmonares se mantienen intactas en el PCLS para la evaluación ex vivo ¹⁶. Además, el PCLS es viable durante un tiempo prolongado en cultivo. Por ejemplo, los PCLS de ratón no tuvieron cambios significativos en la viabilidad celular y el metabolismo durante un mínimo de 12 días en cultivo, así como, retuvieron la contractilidad de las vías respiratorias durante un máximo de 7 días¹⁷. Además, PCLS mantiene vías respiratorias o vasos de diferentes tamaños para ensayos de contracción y relajación. Además, la señalización intracelular de Ca²⁺ de las SMC, el factor determinante de la contractilidad celular, se puede ensayar con colorantes reporteros de Ca²⁺ fotografiados por un microscopio confocal o de 2 fotones¹³.

Teniendo en cuenta la amplia aplicación del modelo de ratón en la investigación pulmonar, aquí se describe un protocolo detallado para preparar PCLS de ratón con vías respiratorias y arterias intrapulmonares intactas para la investigación pulmonar ex vivo . Utilizando los PCLS preparados, posteriormente demostramos cómo evaluar las respuestas arteriales respiratorias y pulmonares a estímulos constrictivos o relajantes. Además, también se describe el método de carga del PCLS con colorante reportero Ca²⁺ y luego la obtención de imágenes de la señalización ca²⁺ de los SMC asociados con respuestas contráctiles o relajantes.

Protocolo

Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General de Massachusetts. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57/B6 de tipo salvaje, de 8 semanas de edad.

1. Preparación experimental

1. Prepare la solución de trabajo.
   1. Preparar 1 solución de sal equilibrada de Hank (HBSS, con Ca²⁺ y Mg²⁺, y pH equilibrado con 20 mM HEPES, ver Tabla de Materiales). Utilice la solución HBSS para preparar y procesar el PCLS. Mantenga la solución de HBSS fría sobre hielo cuando prepare PCLS.
2. Preparar el medio de cultivo de PCLS complementando el Medio Águila Modificada de Dulbecco y F-12 (DMEM-F12) con un agente antibiótico-antimicótico (relación volumen 1:100, ver Tabla de Materiales).
3. Preparar solución de agarosa al 1,5% y gelatina al 6%.
   1. Mezcle agarosa o gelatina en polvo de bajo punto de fusión (LMP) (consulte la Tabla de materiales) con solución de HBSS por separado en tubos de centrífuga estériles de 15 ml (o tubos de 50 ml si el volumen de solución >10 ml) hasta las concentraciones finales.
      NOTA: Volumen total de solución de agarosa = 5 ml/ratón x número de ratones; solución de gelatina = 2 ml/ratón x número de ratones.
   2. Calentar los tubos de solución en agua hirviendo hasta que el polvo se disuelva por completo. Mantenga las soluciones de agarosa y gelatina en un baño de agua a 42 °C.
      NOTA: Una lámpara de calentamiento en la mesa de disección puede ser útil para mantener el ambiente de operación caliente y evitar que la solución de agarosa se solidifique antes de inyectarse en el pulmón del ratón.
4. Sumerja todas las herramientas de disección, incluido un par de tijeras de disección, dos pares de pinzas curvas de microdisección y un par de pinzas hemostáticas en una solución de etanol al 70% durante al menos 20 minutos para la esterilización.
5. Mantenga un vibratome listo (ver Tabla de Materiales) para seccionar el tejido pulmonar en rodajas delgadas.
6. Mantenga un microscopio de contraste de fase invertido con una cámara CCD para evaluar las respuestas contráctiles vasculares o de las vías respiratorias y un microscopio confocal de barrido láser personalizado (consulte la Tabla de materiales) para evaluar la señalización de Ca²⁺ en las SMC pulmonares¹⁸.

2. Inflado de los pulmones del ratón con solución de agarosa y gelatina

1. Sacrificar al ratón.
   1. Coloque el ratón en una cámara de plástico (alrededor de 750 cm³) con 5% de isoflurano. Mantenga al ratón en la cámara hasta que deje de respirar durante al menos 1 minuto.
      NOTA: Otros métodos de eutanasia primaria, como la inyección intraperitoneal de ketamina (240 mg/Kg) y xilazina (32 mg/Kg)¹⁹ o pentobarbital (0,3 ml)²⁰, se pueden aplicar como alternativas al isoflurano inhalado.
   2. Coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección en posición supina. Fije el cuerpo en su posición fijando la cola, las patas delanteras y la cabeza con agujas de jeringa de 25 G, y desinfecte el cuerpo con un aerosol de etanol al 70%.
   3. Corte el abdomen del ratón con tijeras quirúrgicas (incisión, ~ 2 cm de largo x 2 cm de ancho). Luego, corte la aorta abdominal para agotar el volumen de sangre.
2. Infle los lóbulos pulmonares siguiendo los pasos a continuación.
   1. Abra la cavidad torácica con cuidado a lo largo del esternón y la caja torácica inferior bilateral por encima del diafragma, y observe cómo los lóbulos pulmonares colapsan cuando se abre la cavidad torácica.
   2. Retire parte de las cajas torácicas ventrales bilaterales para exponer el corazón. Evite el daño pulmonar apuntando la punta de la tijera afilada lejos del tejido pulmonar.
   3. Use fórceps para separar el timo y el tejido blando en el cuello del ratón para exponer la tráquea.
   4. Cortar un pequeño orificio (1,2 mm de diámetro) en el extremo superior de la tráquea que permita el paso de la punta de un catéter intravenoso en forma de Y de 20 G (ver Tabla de Materiales).
   5. Conecte un puerto adaptador del catéter en forma de Y con una jeringa de 3 ml precargada con 0,5 ml de aire y el otro puerto con una jeringa de 3 ml precargada con 2 ml de solución tibia de agarosa al 1,5 % (42 °C).
   6. Inyecte una solución de agarosa para llenar el catéter y luego empuje el catéter a través de la abertura precortada en la tráquea durante 5-8 mm de longitud.
   7. Inyecte lentamente la solución de agarosa a alrededor de 1 ml/5 s. El pulmón se expandirá a lo largo del eje proximal a distal. Detenga la inyección cuando se infle el borde de cada lóbulo pulmonar.
      NOTA: No sobreinfle el pulmón, ya que esto podría romperlo. El volumen de solución de agarosa para inflar todo el pulmón de un ratón adulto joven es de aproximadamente 1,3 ± 0,1 ml.
   8. Inyecte 0.2-0.3 ml de aire de la otra jeringa para empujar la agarosa residual en el catéter y las vías respiratorias conductoras hasta el espacio de los alvéolos distales.
   9. Cierre la tráquea con un par de pinzas hemostáticas curvas (consulte la Tabla de materiales).
3. Rellenar la vasculatura pulmonar.
   1. Llene una jeringa de 1 ml con gelatina tibia al 6%. Conéctese a un catéter de vena del cuero cabelludo con aguja, llene el catéter con solución de gelatina y luego perfore el ventrículo derecho cerca de la pared inferior con la aguja.
   2. Empuje la aguja en el ventrículo derecho durante 2-3 mm de longitud y apunte la punta de la aguja a la arteria pulmonar principal.
   3. Inyecte 0,2 ml de solución de gelatina lentamente en el ventrículo derecho y los vasos arteriales pulmonares.
      NOTA: Los lóbulos pulmonares parecen ligeramente más pálidos con la inflación de gelatina adecuada.
   4. Mantenga la aguja en su lugar durante 5 minutos después de la inyección, enfríe los lóbulos pulmonares vertiendo una solución de HBSS helada sobre el corazón y el pulmón, luego coloque el cuerpo con la placa de disección en un refrigerador de 4 ° C o en hielo durante un total de 10 minutos.
   5. Retire el pulmón y el corazón del ratón de los tejidos conectivos circundantes con tijeras. Luego, separe cada lóbulo pulmonar y manténgalos en solución HBSS en hielo.

3. Seccionamiento de lóbulos pulmonares a rodajas finas

1. Recorte y fije el lóbulo pulmonar en la parte superior de la columna de la muestra con superpegamento, y oriente el lóbulo (Figura 1A, B) para permitir que la dirección de corte sea perpendicular a la mayoría de las vías respiratorias desde la hila hasta la superficie pulmonar.
2. Use un vibratome con una cuchilla de afeitar fina y fresca para cortar el lóbulo pulmonar en rodajas de 150 μm. Recoger las rodajas en placas de Petri estériles de 100 mm prellenadas con solución fría de HBSS.
   NOTA: Establezca la velocidad de movimiento de la cuchilla y la frecuencia de oscilación adecuadas antes de comenzar a cortar. Una configuración típica para un Compresstom es el nivel de velocidad 4 y el nivel de oscilación 4.
3. Transfiera las rebanadas a placas de Petri rellenas con medio de cultivo DMEM/F-12 (20 rebanadas/15 ml de medio/plato) y manténgalas en una incubadora de 37 °C durante la noche antes de los experimentos.
   NOTA: Los PCLS de ratón se pueden mantener en cultivo durante aproximadamente 7 días sin perder las respuestas contráctiles de las vías respiratorias¹⁷. La longevidad de las arterias pulmonares no se ha evaluado a fondo. En nuestra observación, conservan la estructura intacta y la vasoreacción durante al menos 3 días en medio DMEM/F12. Para el almacenamiento a largo plazo, los PCLS de ratón se pueden colocar en crioviales llenos de medio DMEM/F12 que contienen 10% de DMSO (5 rodajas en medio de 1 ml por vial), congelados en un recipiente lleno de alcohol isopropílico a -80 °C durante la noche y criopreservados en nitrógeno líquido durante semanas a meses²¹.

4. Análisis de las respuestas contráctiles de las vías respiratorias y arterias intrapulmonares

1. Coloque los PCLS en una placa de cultivo de 24 pocillos llena de HBSS, una en cada pozo. Ubique el PCLS en el centro del pozo y, a continuación, retire la solución HBSS con una pipeta.
2. Encuentre la vía aérea y el vaso objetivo en la rebanada bajo el microscopio, luego cubra la rebanada con una malla de nylon con un orificio central precortado (2-3 mm de diámetro) para exponer el área objetivo.
3. Coloque una arandela de metal hueca en la parte superior de la malla para mantener las rodajas en su lugar (Figura 2A).
4. Añadir 600 μL de solución HBSS para sumergir el PCLS. Descanse la rebanada durante 10 minutos, luego registre las imágenes de referencia de las vías respiratorias o los vasos.
5. Induzca la contracción de las vías respiratorias o vascular succionando cautelosamente la solución de HBSS en blanco con una pipeta y agregando 600 μL de HBSS con un agonista, como 1 μM de metacolina (MCh) o 10 nM de endotelina (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: La estimulación de KCl como estándar de conjunto de herramientas no es necesaria antes de la exposición a metacolina o endotelina. 100 mM de estimulación de KCl en las vías respiratorias del ratón sólo induce una contracción pequeña e irregular de las vías respiratorias (10%-15%)²⁰. Del mismo modo, una estimulación cebadora de metacolina no está obligada, ya que hemos confirmado que el mismo agonista, por ejemplo, metacolina o serotonina, desencadena una contracción similar de las vías respiratorias en la primera y repetitiva exposición^20,22.
6. Observe la reacción bajo el microscopio hasta que el cambio en el área luminal alcance un estado equilibrante, y luego registre las imágenes de las vías respiratorias o vasculares para su análisis.
7. Retire la solución de MCh o endotelina con una pipeta y agregue una nueva solución hbSS de 600 μL con la misma concentración de agonistas y un relajante; observar y registrar la relajación de las vías respiratorias o vascular.
8. Cuantifique la reacción vascular o de las vías respiratorias siguiendo los pasos a continuación.
   1. Cargue las imágenes en el software gratuito FIJI patrocinado por los NIH.
   2. Seleccione la Selección de polígono en la barra de herramientas para delinear la luz de las vías respiratorias o vascular en cada fotograma.
   3. Elija Analizar > Establecer medidas > área.
   4. Elija Analizar > medir para cuantificar el área de interés. Los resultados se muestran en una ventana separada para el análisis estadístico.

5. Análisis de la señalización de Ca²⁺ de las SMC de las vías respiratorias o vasculares

1. Prepare el tampón de carga de tinte Ca²⁺ .
   1. Disolver el colorante Ca²⁺ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (ver Tabla de Materiales), 50 μg (un vial) con 10 μL de DMSO.
   2. Disolver 0,2 g de polvo de Pluronic F-12 (ver Tabla de Materiales) en 1 mL de DMSO para generar una solución Pluronic al 20%.
   3. Mezclar 10 μL de solución plurónica al 20% con 10 μL de solución de colorante Ca²⁺ -DMSO.
   4. Haga tampón de carga de colorante Ca²⁺ agregando 20 μL de la mezcla a 2 ml de solución HBSS con 200 μM de sulfobromoftaleína (ver Tabla de materiales).
2. Coloque 15 PCLS de ratón en 2 ml de tampón de carga Ca²⁺ e incube a 30 °C durante 1 h. Luego mueva las rodajas a 2 ml de solución de HBSS con 100 μM de sulfobromoftaleína durante 30 minutos adicionales para la desesterificación de colorantes fluorescentes a temperatura ambiente.
3. Detectar la señalización de Ca²⁺ de los SMC.
   1. Coloque las rodajas cargadas de tinte Ca²⁺ en un vaso de cubierta grande.
   2. Llene una jeringa de 3 ml con grasa de silicona de alto vacío. Exprima la grasa a través de una aguja embotada de 18 G para dibujar dos líneas paralelas a través del vidrio de la cubierta por encima y por debajo de la rebanada.
   3. Cubra la rebanada con una malla de nylon entre dos líneas de grasa. Coloque el vidrio de la segunda cubierta en la parte superior de la malla para generar una cámara sellada por grasa en los lados (Figura 3A).
      NOTA: La malla de nylon es esencial para mantener la rebanada unida a la cubierta inferior y así mantenerse dentro de la distancia de trabajo de un objetivo invertido de alta magnitud, como el aceite 40x.
   4. Agregue HBSS o solución agonista a la cámara desde un extremo mediante pipeteo manual o a través de un sistema de perfusión . Retire el líquido de la cámara succionando desde el otro extremo con papel de seda o vacío en el caso de perfusión continua de líquido.
   5. Coloque la cámara PCLS en el escenario del microscopio. Detecte la señalización Ca²⁺ de SMC²³ con un microscopio confocal de barrido resonante personalizado con una velocidad de escaneo láser de 15 o 30 imágenes/s.
      NOTA: Alternativamente, se puede aplicar un microscopio confocal de escaneo láser comercial de alta velocidad, ampliamente disponible en la actualidad, en el ensayo de señalización Ca^{2 +} de SMC pulmonares en PCLS.
4. Cuantificar la fluorescencia de Ca²⁺ en SMC.
   1. Cargue la secuencia de imágenes grabadas en FIJI y elija el Tipo de > de imagen > escala de grises de 8 bits.
   2. Seleccione la Selección de rectángulo en la barra de herramientas y defina una región de interés (ROI) de 5 píxeles x 5 píxeles en una célula muscular lisa.
   3. Elija Analizar > Establecer mediciones > valor gris medio , que representa la intensidad de fluorescencia Ca²⁺ .
   4. Si la posición de un ROI cambia con la contracción de SMC, elija Analizar > Medir la intensidad fluorescente Ca²⁺ fotograma a fotograma.
   5. Si el ROI de SMC permanece en una posición similar en una pila de imágenes, elija > pilas de > medir de la intensidad fluorescente Ca²⁺ .
      NOTA: Se puede conectar una macro escrita a medida para realizar un seguimiento del ROI dentro del SMC cuando se mueve con contracción en una pila de imágenes y mide automáticamente la intensidad de Ca²⁺ (valor gris) del ROI fotograma a fotograma.

Resultados

Preparación de PCLS de ratón que preserva intactas las vías respiratorias y arterias intrapulmonares
Se observó un PCLS de 150 μm de espesor bajo el microscopio de contraste de fase invertido. En los pulmones de ratón, las vías respiratorias conductoras se acompañan de arterias intrapulmonares, que van desde el hilio hasta el pulmón periférico. En la Figura 2B se muestra un haz representativo de las vías respiratorias pulmonares-arteria en un PCLS de ratón. La...

Discusión

La preparación de PCLS implica varios pasos críticos. En primer lugar, es esencial inflar el lóbulo pulmonar de manera homogénea para evitar la variación de la rigidez del tejido por la distribución desigual de la agarosa. A medida que la agarosa líquida se gelifica rápidamente en catéteres delgados o vías respiratorias a una temperatura inferior a 37 ° C, el defecto de llenado resultante en el campo pulmonar distal podría aumentar la disparidad de rigidez del tejido pulmonar y causar desgarro del tejido dura...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter