Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Resumo

O presente protocolo descreve a preparação e utilização de fatias pulmonares cortadas com precisão do rato para avaliar as vias aéreas e a contratilidade muscular liso arterial intrapulmonar em um ambiente quase in vivo .

Resumo

As células musculares lisas (SMC) mediam a contração das vias aéreas e da artéria intrapulmonar para modificar a resistência ao fluxo de ar e a circulação pulmonar, respectivamente, desempenhando um papel crítico na homeostase do sistema pulmonar. A desregulamentação da contralução da SMC contribui para várias doenças pulmonares, incluindo asma e hipertensão pulmonar. No entanto, devido ao acesso limitado aos tecidos e à falta de sistemas culturais para manter os fenótipos in vivo SMC, os mecanismos moleculares subjacentes à contratlidade SMC desregulamentada nessas doenças permanecem totalmente identificados. A fatia pulmonar de corte de precisão (PCLS) oferece um modelo ex vivo que contorna essas dificuldades técnicas. Como uma seção de tecido pulmonar vivo e fino, o PCLS retém O SMC em ambientes naturais e permite o rastreamento in situ da contração do SMC e sinalização intracelular ca²⁺ que regula a contração do SMC. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação pcls detalhado do mouse, que preserva vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares. Este protocolo envolve dois passos essenciais antes de submeter o lobo pulmonar ao corte: inflar as vias aéreas com ponto de fusão baixo agarose através da traqueia e enchimento de vasos pulmonares com gelatina através do ventrículo direito. O PCLS preparado usando este protocolo pode ser usado para bioensaio para avaliar a regulação contraítária de CA²⁺mediada da SMC tanto nas vias aéreas quanto nos compartimentos arteriais intrapulmonares. Quando aplicado a modelos de camundongos de doenças respiratórias, este protocolo permite a investigação funcional do SMC, fornecendo assim uma visão do mecanismo subjacente da desregulamentação da contração da SMC em doenças.

Introdução

A célula muscular lisa (SMC) é um tipo de célula estrutural importante no pulmão, residindo principalmente na parede de mídia das vias aéreas e vasos pulmonares. As SMCs contraem para alterar o calibre luminal, regulando assim o fluxo de ar e sangue ^1,2. Portanto, a regulação conjuntura de SMCs é essencial para manter a homeostase da ventilação de ar e circulação pulmonar. Em contraste, a contratilidade aberrante do SMC provoca vias aéreas obstrutivas ou doenças vasculares pulmonares como asma e hipertensão arterial pulmonar. No entanto, a avaliação funcional das SMCs pulmonares tem sido desafiada pelo acesso limitado ao tecido pulmonar, especialmente aquelas pequenas vias aéreas e microvexes na parte distal do pulmão ^2,3. As soluções atuais recorrem a ensaios indiretos, como medir a resistência ao fluxo de ar pela Flexivent para refletir a constrição das vias aéreas e verificar a pressão arterial pulmonar pelo cateterismo cardíaco direito para avaliar a vasocontração pulmonar ^4,5. No entanto, esses ensaios indiretos têm múltiplas desvantagens, como ser confundido por fatores estruturais, não captar a diversidade espacial das vias aéreas ou respostas vasculares em toda a escala pulmonar ^6,7, e a inaptidão para o estudo mecanicista da regulação contratil no nível celular. Portanto, abordagens alternativas utilizando células primárias isoladas, tiras musculares de traqueia/brônquico ^8,9, ou grandes segmentos vasculares¹⁰ foram aplicadas para o estudo SMC in vitro. No entanto, esses métodos também têm limitações. Por exemplo, uma rápida adaptação fenotípica dos SMCs primários na condição^{de cultura 11,12} torna problemático extrapolar achados da cultura celular para configurações in vivo. Além disso, o fenótipo contracttil de SMCs nas vias aéreas proximais isoladas ou segmentos vasculares pode não representar as SMCs no pulmão distal ^6,7. Além disso, a medição da força muscular no nível do tecido permanece dissociada de eventos moleculares e celulares que são essenciais para uma visão mecanicista sobre a regulação contratil.

A fatia pulmonar cortada com precisão (PCLS), uma seção de tecido pulmonar vivo, fornece uma ferramenta ex vivo ideal para caracterizar SMCs pulmonares em um microambiente quase in vivo (ou seja, arquitetura multicelular preservada e interação)¹³. Desde que os Drs. Placke e Fisher introduziram pela primeira vez a preparação de fatias pulmonares de pulmões de ratos e hamsters inflados pela agarose nos^{anos 14,15}, essa técnica tem avançado continuamente para fornecer aos PCLSs maior qualidade e maior versatilidade para pesquisas biomédicas. Uma melhora significativa é o aprimoramento da preservação arterial pulmonar por infusão de gelatina, além da inflação pulmonar com agarose através da traqueia. Como resultado, tanto as vias aéreas quanto as artérias pulmonares são mantidas intactas no PCLS para avaliação ex vivo ¹⁶. Além disso, o PCLS é viável por um tempo prolongado na cultura. Por exemplo, os PCLSs do mouse não tiveram nenhuma mudança significativa na viabilidade celular e metabolismo por um mínimo de 12 dias na cultura, bem como, eles mantiveram a contração das vias aéreas por até 7 dias¹⁷. Além disso, o PCLS mantém vias aéreas ou embarcações de tamanho diferente para ensaios de contração e relaxamento. Além disso, a sinalização intracelular Ca²⁺ de SMCs, fator determinante da contratilação celular, pode ser avaliada com corantes de repórter Ca²⁺ retratados por um microscópio confocal ou de 2 fótons¹³.

Considerando a ampla aplicação do modelo de camundongos em pesquisa pulmonar, um protocolo detalhado é descrito aqui para a preparação do PCLS do rato com vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares para pesquisa pulmonar ex vivo . Utilizando os PCLSs preparados, demonstramos posteriormente como avaliar as vias aéreas e as respostas arteriais pulmonares a estímulos constritivos ou relaxantes. Além disso, também são descritos o método de carregamento do PCLS com corante de repórter Ca²⁺ e, em seguida, a sinalização ca²⁺ de SMCs associadas a respostas contratuais ou relaxantes.

Protocolo

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts. Foram utilizados camundongos machos do tipo selvagem C57/B6, com 8 semanas de idade, para o presente estudo.

1. Preparação experimental

1. Prepare a solução de trabalho.
   1. Prepare a solução de sal balanceado 1x Hank 's Balanced (HBSS, com Ca²⁺ e Mg²⁺, e pH balanceado com HEPES de 20 mM, veja Tabela de Materiais). Use a solução HBSS para preparar e processar o PCLS. Mantenha a solução HBSS fria no gelo ao preparar PCLSs.
2. Prepare o meio de cultura do PCLS complementando o Medium De Águia Modificada de Dulbecco e o F-12 (DMEM-F12) com um agente antimíctico antibiótico (proporção de volume de 1:100, ver Tabela de Materiais).
3. Prepare 1,5% de agarose e 6% de solução de gelatina.
   1. Misture o baixo ponto de fusão (LMP) em pó de agarose ou gelatina (ver Tabela de Materiais) com a solução HBSS separadamente em tubos de centrífugas estéreis de 15 mL (ou tubos de 50 mL se o volume da solução >10 mL) até as concentrações finais.
      NOTA: Volume total de solução agarose = 5 mL/mouse x número de ratos; solução de gelatina = 2 mL/mouse x número de ratos.
   2. Aqueça os tubos da solução em água fervente até que o pó se dissolva completamente. Mantenha as soluções de agarose e gelatina em um banho de água de 42 °C.
      NOTA: Uma lâmpada de aquecimento na mesa de dissecção pode ser útil para manter o ambiente operacional aquecido e evitar que a solução agarose se solidifique antes de ser injetada no pulmão do camundongo.
4. Submergir todas as ferramentas de dissecção, incluindo um par de tesouras dissecando, dois pares de fórceps micro-dissecção curvados, e um par de fórceps hemostáticos em 70% de solução de etanol por pelo menos 20 minutos para esterilização.
5. Mantenha um vibratome pronto (ver Tabela de Materiais) para secionar o tecido pulmonar em fatias finas.
6. Mantenha um microscópio de contraste de fase invertido com uma câmera CCD para avaliar as respostas contratuais das vias aéreas ou vasculares e um microscópio confocal de varredura a laser personalizado (ver Tabela de Materiais) para avaliar a sinalização ca²⁺ em SMCs pulmonares¹⁸.

2. Inflação de pulmões de camundongos com solução de agarose e gelatina

1. Eutanize o rato.
   1. Coloque o mouse em uma câmara de plástico (cerca de 750 cm³) com 5% de isoflurane. Mantenha o rato na câmara até que ele pare de respirar por pelo menos 1 min.
      NOTA: Outros métodos primários de eutanásia, como a injeção intraperitoneal de cetamina (240 mg/Kg) e xilazina (32 mg/Kg)¹⁹ ou pentobarbital (0,3 mL)²⁰, podem ser aplicados como alternativas à isoflurano inalada.
   2. Coloque o corpo do rato em uma placa de dissecção na posição supina. Fixar o corpo em posição fixando a cauda, as patas dianteiras e a cabeça com agulhas de seringa de 25 G, e higienize o corpo com 70% de spray de etanol.
   3. Corte o abdômen do rato com uma tesoura cirúrgica (incisão, ~2 cm de comprimento x 2 cm de largura). Então, corte a aorta abdominal para esgotar o volume sanguíneo.
2. Infle os lóbulos pulmonares seguindo os passos abaixo.
   1. Abra a cavidade torácica cuidadosamente ao longo do esterno e da caixa torácica inferior bilateral acima do diafragma, e observe o colapso dos lobos pulmonares quando a cavidade torácica se abrir.
   2. Remova parte das caixas torácicas ventrais bilaterais para expor o coração. Evite danos pulmonares apontando a ponta afiada da tesoura para longe do tecido pulmonar.
   3. Use fórceps para separar o timo e o tecido mole no pescoço do rato para expor a traqueia.
   4. Corte um pequeno orifício (1,2 mm de diâmetro) na extremidade superior da traqueia permitindo a passagem da ponta de um cateter IV em forma de Y de 20 G (ver Tabela de Materiais).
   5. Conecte uma porta adaptadora do cateter em forma de Y com uma seringa de 3 mL pré-preenchida com 0,5 mL de ar, e a outra porta com uma seringa de 3 mL pré-preenchida com 2 mL de solução agarose quente de 1,5% (42 °C).
   6. Injete a solução agarose para encher o cateter e, em seguida, empurre o cateter através da abertura pré-cortada na traqueia por 5-8 mm de comprimento.
   7. Injete lentamente a solução agarose em torno de 1 mL/5 s. O pulmão se expandirá ao longo do eixo proximal-distal. Pare a injeção quando a borda de cada lobo pulmonar estiver inflada.
      NOTA: Não insinflar demais o pulmão, pois isso pode rompê-lo. O volume de solução agarose para inflar todo o pulmão de um camundongo adulto jovem é de cerca de 1,3 ± 0,1 mL.
   8. Injete 0,2-0,3 mL de ar da outra seringa para empurrar a agarose residual no cateter e nas vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.
   9. Corte feche a traqueia com um par de fórceps hemostáticos curvos (ver Tabela de Materiais).
3. Enchi a vasculatura pulmonar.
   1. Encha uma seringa de 1 mL com gelatina quente de 6%. Conecte-se a um cateter de veia do couro cabeludo da agulha, enchi o cateter com solução de gelatina e, em seguida, puna o ventrículo direito perto da parede inferior com a agulha.
   2. Empurre a agulha para dentro do ventrículo direito por 2-3 mm de comprimento e aponte a ponta da agulha para a artéria pulmonar principal.
   3. Injete 0,2 mL de solução de gelatina lentamente no ventrículo direito e vasos arteriais pulmonares.
      NOTA: Os lóbulos pulmonares parecem ligeiramente mais pálidos com a inflação de gelatina apropriada.
   4. Mantenha a agulha no lugar por 5 minutos após a injeção, esfrie os lóbulos pulmonares derramando solução HBSS gelada no coração e no pulmão, em seguida, coloque o corpo com a placa de dissecção em uma geladeira de 4 °C ou no gelo por um total de 10 minutos.
   5. Remova o pulmão e o coração do camundongo dos tecidos conjuntivos circundantes com uma tesoura. Em seguida, separe cada lobo pulmonar e mantenha-os na solução HBSS no gelo.

3. Secção de lóbulos pulmonares para fatias finas

1. Apare e anexe o lobo pulmonar na parte superior da coluna do espécime com supercola, e oriente o lobo (Figura 1A,B) para permitir que a direção de corte seja perpendicular à maioria das vias aéreas da hila até a superfície pulmonar.
2. Use um vibratome com uma lâmina de barbear fina fresca para cortar o lobo pulmonar em fatias de 150 μm. Colete as fatias em placas de Petri estéreis de 100 mm pré-preenchidas com solução HBSS fria.
   NOTA: Defina a velocidade de movimento da lâmina apropriada e a frequência de oscilação antes de iniciar o corte. Uma configuração típica para um Compresstom é o nível de velocidade 4 e o nível de oscilação 4.
3. Transfira fatias para pratos de Petri recheadas com meio de cultura DMEM/F-12 (20 fatias/15 mL médio/prato) e mantenha-as em uma incubadora de 37 °C durante a noite antes dos experimentos.
   NOTA: Os PCLSs do mouse podem ser mantidos na cultura por cerca de 7 dias sem perder as respostas contraídas das vias aéreas¹⁷. A longevidade das artérias pulmonares não foi minuciosamente avaliada. Em nossa observação, eles mantêm estrutura intacta e vasoreação por pelo menos 3 dias no meio DMEM/F12. Para armazenamento a longo prazo, os PCLSs do mouse podem ser colocados em criovias preenchidas com meio DMEM/F12 contendo 10% de DMSO (5 fatias em 1 mL médio por frasco), congelados em um recipiente recheado de álcool isopropílico a -80 °C durante a noite e criopreservado em nitrogênio líquido por semanas a^{21 meses}.

4. Análise das respostas contratuais das vias aéreas e artérias intrapulmonares

1. Coloque PCLSs em uma placa de cultura de 24 poços preenchida pelo HBSS, uma em cada poço. Localize o PCLS no meio do poço e remova a solução HBSS com uma pipeta.
2. Encontre as vias aéreas e o vaso alvo na fatia sob o microscópio, em seguida, cubra a fatia usando uma malha de nylon com um orifício central pré-cortado (2-3 mm de diâmetro) para expor a área alvo.
3. Coloque uma lavadora de metal oca em cima da malha para segurar as fatias no lugar (Figura 2A).
4. Adicione 600 μL de solução HBSS para submergir o PCLS. Descanse a fatia por 10 minutos, depois grave as imagens da linha de base das vias aéreas ou embarcações.
5. Induzir as vias aéreas ou contração vascular, sucundo cautelosamente a solução HBSS em branco com uma pipeta e adicionando 600 μL de HBSS com um agonista, como 1 μM de metanfetamina (MCh) ou 10 nM de endotelina (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A estimulação de KCl como padrão de configuração de ferramenta não é necessária antes da exposição à methacholina ou à endotelina. 100 mM de estimulação de KCl nas vias aéreas de camundongos apenas induz uma contração de vias aéreas pequenas e irregulares (10%-15%)²⁰. Da mesma forma, uma estimulação de methacholina priming não é obrigatória, pois confirmamos que o mesmo agonista, por exemplo, methacholina ou serotonina, desencadeia contração semelhante das vias aéreas nas primeiras e repetitivas exposições^20,22.
6. Observe a reação sob o microscópio até que a mudança da área luminal atinja um estado de equilíbrio e, em seguida, regisine as vias aéreas ou imagens vasculares para análise.
7. Remova a solução MCh ou endothelin com uma pipeta e adicione uma nova solução HBSS de 600 μL com a mesma concentração agonista e relaxante; observar e registrar as vias aéreas ou relaxamento vascular.
8. Quantifique as vias aéreas ou a reação vascular seguindo os passos abaixo.
   1. Carregue as imagens para o software livre patrocinado pelo NIH FIJI.
   2. Selecione a Seleção polígona na barra de ferramentas para delinear as vias aéreas ou lúmen vascular em cada quadro.
   3. Escolha Analisar > definir medidas > área.
   4. Escolha Analisar > Medida para quantificar a área de interesse. Os resultados são mostrados em uma janela separada para análise estatística.

5. Analisando a sinalização ca²⁺ das vias aéreas ou SMCs vasculares

1. Prepare o tampão de carregamento de tingimento Ca² +.
   1. Dissolver ca²⁺ corante, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (ver Tabela de Materiais), 50 μg (um frasco) com 10 μL de DMSO.
   2. Dissolva 0,2 g de pó Plurônico F-12 (ver Tabela de Materiais) em 1 mL de DMSO para gerar uma solução plurônica de 20%.
   3. Misture 10 μL de solução plurônica de 20% com 10 μL de solução ca²⁺ corante-DMSO.
   4. Faça o tampão de carregamento de corante Ca²⁺ adicionando 20 μL da mistura a 2 mL de solução HBSS com 200 μM de sulfobromophthalein (ver Tabela de Materiais).
2. Coloque 15 PCLSs de mouse em 2 mL de tampão de carregamento Ca²⁺ e incubar a 30 °C por 1h. Em seguida, mova as fatias para 2 mL de solução HBSS com 100 μM de sulfobromophthalein por um adicional de 30 min para desestrificação de corante fluorescente à temperatura ambiente.
3. Detecte a sinalização ca²⁺ de SMCs.
   1. Coloque fatias carregadas de tinta Ca²⁺ em um copo de tampa grande.
   2. Encha uma seringa de 3 mL com graxa de silicone de alto vácuo. Esprema a graxa através de uma agulha de 18 G sem cortes para desenhar duas linhas paralelas através do vidro de cobertura acima e abaixo da fatia.
   3. Cubra a fatia usando uma malha de nylon entre duas linhas de graxa. Coloque o segundo vidro de cobertura em cima da malha para gerar uma câmara selada por graxa nas laterais (Figura 3A).
      NOTA: A malha de nylon é essencial para manter a fatia presa ao deslizamento de cobertura inferior e, assim, ficar dentro da distância de trabalho de um objetivo invertido de alta magnitude, como óleo de 40x.
   4. Adicione HBSS ou solução agonista na câmara de uma extremidade, pipetando manualmente ou através de um sistema de perfusão. Remova o fluido da câmara sucumbindo da outra extremidade com papel de tecido ou vácuo no caso de perfusão contínua de fluido.
   5. Coloque a câmara PCLS no estágio do microscópio. Detecte a sinalização Ca²⁺ do SMC²³ com um microscópio confocal de varredura ressonante personalizado com uma taxa de varredura a laser de 15 ou 30 imagens/s.
      NOTA: Alternativamente, um microscópio confocal de varredura a laser comercial de alta velocidade, amplamente disponível no momento, pode ser aplicado no ensaio de sinalização Ca²⁺ de SMCs pulmonares em PCLS.
4. Quantifique a fluorescência Ca²⁺ em SMCs.
   1. Carregue a sequência de imagem gravada para FIJI e escolha a escala de cinza Tipo > de imagem > 8 bits.
   2. Selecione a Seleção Retângulo na barra de ferramentas e defina uma região de interesse de 5 pixels x 5 pixels (ROI) em uma célula muscular lisa.
   3. Escolha Analisar > definir medidas > Valor cinza médio , representando a intensidade de fluorescência ca² +.
   4. Se a posição de um ROI mudar com contração de SMC, escolha Analisar > Medir o quadro de intensidade fluorescente Ca²⁺ .
   5. Se o ROI do SMC permanecer em uma posição semelhante em uma pilha de imagens, escolha Image > Stacks > Measure stack of the Ca²⁺ fluorescente intensity.
      NOTA: Uma macro escrita sob medida pode ser conectada para rastrear o ROI dentro do SMC quando ele se move com contração em uma pilha de imagens e mede automaticamente a intensidade ca²⁺ (valor cinza) do ROI quadro a quadro.

Resultados

Preparação do MOUSE PCLS preservando vias aéreas e artérias intrapulmonares intactas
Um PCLS de 150 μm de espessura foi observado sob o microscópio de contraste de fase invertido. Nos pulmões do rato, as vias aéreas condutoras são acompanhadas por artérias intrapulmonares, indo do hilus ao pulmão periférico. Um pacote representativo de artérias aéreas pulmonares em um PCLS de rato é mostrado na Figura 2B. As vias aéreas podem ser facilmente identificadas p...

Discussão

A preparação do PCLS envolve várias etapas críticas. Em primeiro lugar, é essencial inflar o lobo pulmonar de forma homogênea para evitar a variação da rigidez tecidual da distribuição desigual da ágarose. Como o líquido agarose rapidamente géis em cateteres finos ou vias aéreas a uma temperatura abaixo de 37 °C, o defeito de enchimento resultante no campo pulmonar distal poderia aumentar a disparidade de rigidez do tecido pulmonar e causar ruptura de tecido durante a seção vibratome. Portanto, manter a ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter