АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает подготовку и использование прецизионных срезов легких мышей для оценки сократимости дыхательных путей и внутрилегочных артерий гладкой мускулатуры в среде почти in vivo .

Аннотация

Гладкомышечные клетки (SMC) опосредуют сокращение дыхательных путей и внутрилегочной артерии для изменения сопротивления воздушного потока и легочного кровообращения соответственно, играя, следовательно, играя решающую роль в гомеостазе легочной системы. Дерегуляции сократимости СМЦ способствует развитию ряда легочных заболеваний, включая астму и легочную гипертензию. Однако из-за ограниченного доступа к тканям и отсутствия систем культивирования для поддержания фенотипов SMC in vivo молекулярные механизмы, лежащие в основе дерегулированной сократимости SMC при этих заболеваниях, остаются полностью идентифицированными. Прецизионный срез легких (PCLS) предлагает модель ex vivo , которая обходит эти технические трудности. Как живой, тонкий участок легочной ткани, PCLS сохраняет SMC в естественной среде и позволяет in situ отслеживать сокращение SMC и внутриклеточную передачу сигналов Ca2 + , которая регулирует сократимость SMC. Здесь представлен подробный протокол подготовки PCLS для мыши, который сохраняет интактные дыхательные пути и внутрилегочные артерии. Этот протокол включает в себя два основных шага перед тем, как подвергнуть долю легкого нарезке: надувание дыхательных путей агарозой с низкой температурой плавления через трахею и заполнение легочных сосудов желатином через правый желудочек. PCLS, приготовленный с использованием этого протокола, может быть использован для биоанализов для оценки Ca2+ -опосредованной сократительной регуляции SMC как в дыхательных путях, так и во внутрилегочных артериальных компартментах. При применении к мышиным моделям респираторных заболеваний этот протокол позволяет проводить функциональное исследование SMC, тем самым давая представление о базовом механизме дерегуляции сократимости SMC при заболеваниях.

Введение

Гладкомышечные клетки (SMC) являются основным типом структурных клеток в легких, в основном находящихся в медиа-стенке дыхательных путей и легочных сосудов. SMC сокращаются, чтобы изменить просветный калибр, тем самым регулируя воздух и кровоток 1,2. Поэтому сократительная регуляция SMC имеет важное значение для поддержания гомеостаза вентиляции воздуха и легочного кровообращения. Напротив, аберрантная сократимость SMC провоцирует обструктивные заболевания дыхательных путей или легочных сосудов, такие как астма и легочная артериальная гипертензия. Однако функциональная оценка легких SMC была затруднена ограниченным доступом к легочной ткани, особенно к тем небольшим дыхательным путям и микрососудам в дистальной части легкого 2,3. Современные решения прибегают к косвенным анализам, таким как измерение сопротивления воздушного потока Flexivent для отражения сужения дыхательных путей и проверка легочного артериального артериального давления путем катетеризации правого сердца для оценки легочной вазоконтракции 4,5. Тем не менее, эти косвенные анализы имеют множество недостатков, таких как смешение структурных факторов, неспособность охватить пространственное разнообразие дыхательных путей или сосудистых реакций во всей шкале легких 6,7 и непригодность для механистического изучения сократительной регуляции на клеточном уровне. Поэтому для исследования SMC in vitro были применены альтернативные подходы с использованием изолированных первичных клеток, полосок мышц трахеи/бронхов 8,9 или крупных сосудистых сегментов10. Тем не менее, эти методы также имеют ограничения. Например, быстрая фенотипическая адаптация первичных SMC в условиях культуры 11,12 делает проблематичным экстраполяцию результатов из клеточной культуры в условия in vivo. Кроме того, сократительный фенотип SMC в изолированных проксимальных дыхательных путях или сосудистых сегментах может не представлять собой SMC в дистальном легком 6,7. Более того, измерение мышечной силы на тканевом уровне остается диссоциированным от молекулярных и клеточных событий, которые необходимы для механистического понимания сократительной регуляции.

Прецизионно разрезанный срез легкого (PCLS), живой участок легочной ткани, обеспечивает идеальный инструмент ex vivo для характеристики легочных SMC в микросреде, близкой к in vivo (т.е. сохраненной многоклеточной архитектуре и взаимодействии)13. С тех пор, как доктора Плаке и Фишер впервые представили приготовление легких срезов из надутых агарозой легких крыс и хомяков в 1980-х годах 14,15, этот метод постоянно развивался, чтобы обеспечить PSS более высоким качеством и большей универсальностью для биомедицинских исследований. Одним из значительных улучшений является усиление сохранения легочных артерий путем инфузии желатина в дополнение к надуванию легких агарозой через трахею. В результате как дыхательные пути, так и легочные артерии остаются нетронутыми в PCLS для оценки ex vivo 16. Кроме того, PCLS жизнеспособна в течение длительного времени в культуре. Например, у мышиных PSS не было значительных изменений жизнеспособности клеток и метаболизма в течение как минимум 12 дней в культуре, а также они сохраняли сократимость дыхательных путей до 7 дней17. Кроме того, PCLS сохраняет дыхательные пути или сосуды разного размера для анализа сокращения и релаксации. Кроме того, внутриклеточные сигналы Ca2+ SMC, детерминантный фактор сократимости клеток, могут быть проанализированы с помощью репортерных красителей Ca2+, визуализированных конфокальным или 2-фотонным микроскопом13.

Учитывая широкое применение мышиной модели в исследованиях легких, здесь описан подробный протокол подготовки ПКЛС мыши с интактными дыхательными путями и внутрилегочными артериями для исследования легких ex vivo . Используя подготовленные PSCL, мы впоследствии продемонстрировали, как оценивать реакции дыхательных путей и легочных артерий на констриктивные или релаксантные стимулы. Кроме того, описан способ загрузки PCLS репортерным красителем Ca2+ и последующей визуализации сигналов Ca2+ SMC, связанных со сократительными или релаксантными реакциями.

протокол

Весь уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Массачусетской больницы общего профиля. Для настоящего исследования использовались самцы мышей дикого типа C57/B6 в возрасте 8 недель.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Подготовьте рабочий раствор.
    1. Приготовьте 1x сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS, с Ca2+ и Mg2+, и pH сбалансирован с 20 мМ HEPES, см. Таблицу материалов). Используйте решение HBSS для подготовки и обработки PCLS. Держите раствор HBSS холодным на льду при приготовлении PCLS.
  2. Готовят культуральную среду PCLS, дополняя модифицированную орлиную среду Dulbecco и F-12 (DMEM-F12) антибиотиком-антимикотическим средством (объемное соотношение 1:100, см. Таблицу материалов).
  3. Готовят 1,5% агарозу и 6% раствор желатина.
    1. Смешайте агарозу с низкой температурой плавления (LMP) или желатиновый порошок (см. Таблицу материалов) с раствором HBSS отдельно в стерильных центрифужных трубках по 15 мл (или в пробирках по 50 мл, если объем раствора >10 мл) до конечных концентраций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем раствора агарозы = 5 мл/мышь x количество мышей; раствор желатина = 2 мл/мышь x количество мышей.
    2. Нагревайте трубки раствора в кипящей воде до полного растворения порошка. Храните растворы агарозы и желатина на водяной бане с температурой 42 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревательная лампа на столе для рассечения может быть полезна для поддержания теплой рабочей среды и предотвращения затвердевания раствора агарозы перед инъекцией в легкое мыши.
  4. Погрузите все инструменты для рассечения, включая пару рассекающих ножниц, две пары изогнутых микродиссекции щипцов и пару гемостатических щипцов в 70% раствор этанола в течение не менее 20 минут для стерилизации.
  5. Держите вибратом наготове (см. Таблицу материалов), чтобы разделить легочную ткань на тонкие ломтики.
  6. Имейте перевернутый фазоконтрастный микроскоп с ПЗС-камерой для оценки дыхательных путей или сосудистых сократительных реакций и специально разработанным лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (см. Таблицу материалов) для оценки сигналов Ca2+ в легочных SMC18.

2. Раздувание легких мыши раствором агарозы и желатина

  1. Усыплите мышь.
    1. Поместите мышь в пластиковую камеру (около 750см3) с 5% изофлурана. Держите мышь в камере до тех пор, пока она не перестанет дышать не менее чем на 1 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы первичной эвтаназии, такие как внутрибрюшинная инъекция кетамина (240 мг/кг) и ксилазина (32 мг/кг)19 или пентобарбитала (0,3 мл)20, могут применяться в качестве альтернативы ингаляционному изофлурану.
    2. Поместите тело мыши на рассеченную доску в положении лежа на спине. Зафиксируйте тело в нужном положении, прижав хвост, передние лапы и голову шприцевыми иглами 25 Г, и продезинфицируйте тело с помощью 70% этанолового спрея.
    3. Разрезайте живот мыши хирургическими ножницами (разрез, ~2 см длиной х 2 см шириной). Затем отрежьте брюшную аорту, чтобы истощить объем крови.
  2. Надувайте доли легких, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Осторожно откройте грудную полость вдоль грудины и двусторонней нижней грудной клетки над диафрагмой и наблюдайте, как мочки легких разрушаются при открытии грудной полости.
    2. Удалите часть двусторонних вентральных грудных клеток, чтобы обнажить сердце. Избегайте повреждения легких, направляя острый кончик ножниц в сторону от легочной ткани.
    3. Используйте щипцы, чтобы отделить тимус и мягкие ткани в шее мыши, чтобы обнажить трахею.
    4. Вырежьте небольшое отверстие (диаметром 1,2 мм) в верхнем конце трахеи, позволяющее пройти кончику 20 G Y-образного IV катетера (см. Таблицу материалов).
    5. Соедините один порт адаптера Y-образного катетера со шприцем объемом 3 мл, предварительно заполненным 0,5 мл воздуха, а другой порт шприцем 3 мл, предварительно заполненным 2 мл теплого 1,5% раствора агарозы (42 °C).
    6. Ввести раствор агарозы для заполнения катетера, а затем протолкнуть катетер через предварительно разрезанное отверстие в трахею на 5-8 мм в длину.
    7. Медленно вводят раствор агарозы со скоростью около 1 мл/5 с. Легкое будет расширяться вдоль проксимально-дистальной оси. Прекратите инъекцию, когда край каждой доли легкого раздут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перегружайте легкое, так как это может разорвать его. Объем раствора агарозы для раздувания всего легкого молодой взрослой мыши составляет около 1,3 ± 0,1 мл.
    8. Введите 0,2-0,3 мл воздуха из другого шприца, чтобы протолкнуть остаточную агарозу в катетере и проводящих дыхательных путях в дистальное пространство альвеол.
    9. Зажмите замыкание трахеи парой изогнутых гемостатических щипцов (см. Таблицу материалов).
  3. Заполняют легочную сосудистую систему.
    1. Наполните шприц объемом 1 мл теплым 6% желатином. Подключите к игле катетер вены кожи головы, наполните катетер раствором желатина, а затем проколите иглой правый желудочек близко к нижней стенке.
    2. Протолкните иглу в правый желудочек на 2-3 мм в длину и направьте кончик иглы на главную легочную артерию.
    3. Медленно вводят 0,2 мл раствора желатина в правый желудочек и легочные артериальные сосуды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доли легких кажутся немного бледнее при соответствующей инфляции желатина.
    4. Держите иглу на месте в течение 5 минут после инъекции, охладите доли легких, вылив холодный раствор HBSS на сердце и легкое, затем поместите тело с рассеченной доской в холодильник с температурой 4 °C или на лед в общей сложности 10 минут.
    5. Удалите легкие и сердце мыши из окружающих соединительных тканей ножницами. Затем отделите каждую долю легкого и держите их в растворе HBSS на льду.

3. Сечение долей легких на тонкие ломтики

  1. Обрежьте и прикрепите легочную долю в верхней части колонки образца с помощью суперклея и сориентируйте долю (рисунок 1A, B), чтобы направление разреза было перпендикулярно большинству дыхательных путей от хилы до поверхности легкого.
  2. Используйте вибратом со свежим тонким лезвием бритвы, чтобы разрезать долю легкого на 150 мкм срезов. Соберите ломтики в 100 мм стерильных чашек Петри, предварительно заполненных холодным раствором HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите соответствующую скорость движения лезвия и частоту колебаний перед началом нарезки. Типичной настройкой для Compresstom является уровень скорости 4 и уровень колебаний 4.
  3. Переложите ломтики в чашки Петри, наполненные питательной средой DMEM/F-12 (20 ломтиков/15 мл среды/тарелки), и выдержите их в инкубаторе с температурой 37 °C в течение ночи перед экспериментами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные PCLS могут поддерживаться в культуре в течение примерно 7 дней без потери сократительных реакций дыхательных путей17. Продолжительность жизни легочных артерий не была тщательно оценена. По нашим наблюдениям, они сохраняют неповрежденную структуру и вазореакцию в течение не менее 3 дней в среде DMEM/F12. Для длительного хранения мышиные ПКС могут быть помещены в криовиалы, заполненные средой DMEM/F12, содержащей 10% DMSO (5 ломтиков в среде 1 мл на флакон), замороженными в контейнере, наполненном изопропиловым спиртом, при -80 °C на ночь, и криоконсервированы в жидком азоте в течение недель домесяцев 21.

4. Анализ сократительных реакций внутрилегочных дыхательных путей и артерий

  1. Поместите PCLS в заполненную HBSS 24-луночную культуральную пластину, по одной в каждой скважине. Расположите PCLS в середине скважины, затем удалите раствор HBSS пипеткой.
  2. Найдите целевые дыхательные пути и сосуд в срезе под микроскопом, затем накройте срез с помощью нейлоновой сетки с предварительно вырезанным центральным отверстием (диаметром 2-3 мм), чтобы обнажить целевую область.
  3. Положите полую металлическую шайбу поверх сетки, чтобы удерживать срезы на месте (рисунок 2А).
  4. Добавьте 600 мкл раствора HBSS для погружения PCLS. Отложите срез в течение 10 минут, затем запишите базовые изображения дыхательных путей или сосудов.
  5. Индуцировать сокращение дыхательных путей или сосудов путем осторожного отсасывания пустого раствора HBSS пипеткой и добавления 600 мкл HBSS с агонистом, таким как 1 мкМ метахолина (MCh) или 10 нМ эндотелина (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стимуляция KCl в качестве стандарта набора инструментов не требуется до воздействия метахолина или эндотелина. 100 мМ стимуляции KCl в дыхательных путях мышей вызывает только небольшое и нерегулярное сокращение дыхательных путей (10%-15%)20. Аналогичным образом, стимуляция прайминга метахолином не является обязательной, поскольку мы подтвердили, что один и тот же агонист, например, метахолин или серотонин, вызывает аналогичное сокращение дыхательных путей при первом и повторяющемся воздействии20,22.
  6. Наблюдайте за реакцией под микроскопом до тех пор, пока изменение просветной области не достигнет равновесного состояния, а затем записывайте изображения дыхательных путей или сосудов для анализа.
  7. Удалить раствор MCh или эндотелина пипеткой и добавить новый раствор HBSS 600 мкл с той же концентрацией агониста и релаксантом; наблюдать и регистрировать расслабление дыхательных путей или сосудов.
  8. Количественно оцените дыхательные пути или сосудистую реакцию, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Загрузите изображения в свободное программное обеспечение FIJI, спонсируемое NIH.
    2. Выберите Polygon Selection на панели инструментов, чтобы очертить дыхательные пути или сосудистый просвет на каждом кадре.
    3. Выберите «Анализировать > устанавливать измерения > области».
    4. Выберите «Анализировать > меру», чтобы количественно оценить интересующую область. Результаты отображаются в отдельном окне для статистического анализа.

5. Анализ сигналов Ca2+ дыхательных путей или сосудистых SMC

  1. Подготовьте буфер загрузки красителя Ca2+ .
    1. Растворяют краситель Ca2+ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (см. Таблицу материалов), 50 мкг (один флакон) с 10 мкл ДМСО.
    2. Растворить 0,2 г порошка Pluronic F-12 (см. Таблицу материалов) в 1 мл DMSO для получения 20% раствора Pluronic.
    3. Смешайте 10 мкл 20% раствора Плуронов с 10 мкл раствора красителяCa2+ DMSO.
    4. Сделать буфер загрузки красителя Ca2+ , добавив 20 мкл смеси в 2 мл раствора HBSS с 200 мкМ сульфобромофталеина (см. Таблицу материалов).
  2. Поместите 15 мышиных PSS в 2 мл буфера загрузки Ca2+ и инкубируйте при 30 °C в течение 1 ч. Затем переместите срезы до 2 мл раствора HBSS со 100 мкМ сульфобромофталеина в течение дополнительных 30 мин для деэтерификации флуоресцентного красителя при комнатной температуре.
  3. Обнаружение сигналов Ca2+ для SMC.
    1. Поместите ломтики, загруженные красителем Ca2+ , на большой покровный стакан.
    2. Наполните шприц объемом 3 мл силиконовой смазкой с высоким вакуумом. Сожмите смазку через затупленную иглу весом 18 г, чтобы провести две параллельные линии через покровное стекло над и под срезом.
    3. Накройте срез нейлоновой сеткой между двумя линиями смазки. Поместите второе покровное стекло поверх сетки, чтобы создать камеру, герметизированную смазкой по бокам (рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейлоновая сетка необходима для удержания среза прикрепленным к нижнему крышке и, таким образом, оставаться в пределах рабочего расстояния перевернутого объектива высокой величины, такого как 40-кратное масло.
    4. Добавьте раствор HBSS или агониста в камеру с одного конца путем пипетки вручную или с помощью перфузионной системы. Удалите жидкость из камеры путем всасывания с другого конца папиросной бумагой или вакуумом в случае непрерывной перфузии жидкости.
    5. Поместите камеру PCLS на ступень микроскопа. Обнаружение сигналов Ca2+ SMC23 с помощью специально построенного резонансного сканирующего конфокального микроскопа со скоростью лазерного сканирования 15 или 30 изображений / с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, высокоскоростной коммерческий лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, широко доступный в настоящее время, может быть применен в сигнальном анализе Ca2+ легочных SMC в PCLS.
  4. Количественная оценка флуоресценции Ca2+ в SMC.
    1. Загрузите записанную последовательность изображений в FIJI и выберите Image > Type > 8-битных оттенках серого.
    2. Выберите «Выделение прямоугольника» на панели инструментов и определите интересующую область (ROI) размером 5 x 5 пикселей в гладкомышечной ячейке.
    3. Выберите «Анализировать > набор измерений > «Среднее значение серого цвета », представляющее интенсивность флуоресценции Ca2+ .
    4. Если положение ROI изменяется с сокращением SMC, выберите «Анализировать > измерять интенсивность флуоресценции Ca2+ кадр за кадром.
    5. Если рентабельность инвестиций SMC остается в аналогичном положении в стеке изображений, выберите «Стеки изображений > > измерить стек флуоресцентной интенсивности Ca2+ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательский макрос может быть подключен для отслеживания ROI в SMC, когда он перемещается с сокращением в стеке изображений, и автоматически измеряет интенсивность Ca2+ (серое значение) ROI кадр за кадром.

Результаты

Мышиный препарат PCLS, сохраняющий интактные внутрилегочные дыхательные пути и артерии
PCLS толщиной 150 мкм наблюдался под перевернутым фазоконтрастным микроскопом. В легких мышей проводящие дыхательные пути сопровождаются внутрилегочными артериями, идущими от хилуса к периф...

Обсуждение

Подготовка PCLS включает в себя несколько критических этапов. Во-первых, важно равномерно надувать долю легкого, чтобы избежать изменения жесткости тканей от неравномерного распределения агарозы. Поскольку жидкая агароза быстро гелится в тонких катетерах или дыхательных путях при темп...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантами NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309626
15 mL sterile centrifuge tubesCelltreat229411
3 mL syringeBD309585
50 mL sterile centrifuge tubesCelltreat229422
Acetyl-beta-methacholineMillipore Sigma62-51-1
Antibiotic-anitmycoticThermo Fisher15240-062
CCD-cameraNikonNikon Ds-Ri2 camera
Cover glassessFisher Scientific12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vialsFisher Scientific430488
Custom-built laser scanning confocal microscopeDetails in Reference 18
DMEM/F12Fisher ScientificMT-10-092-CM
Endothelin 1Millipore SigmaE7764
Fine dissecting scissorFisher ScientificNC9702861
Freezing containerSigma-AldrichC1562
Gelatin from porcine skinSigma-Aldrich9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher14025092
Hemostatic forcepFisher Scientific16-100-117
HEPESThermo Fisher15630080
High vaccum silicone greaseFisher Scientific146355d
Isopropyl alcoholSigma-AldrichW292907-1KG-K
Metal washersHome Depot Product Authority800442Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcepSigma-AldrichF4142
Needle scalp vein set (25 G)EXELINT26708
NOC-5Cayman Chemical16534
Nylon meshComponent SupplyU-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AMLife Technologieso-6807
Phase-contrast microscopeNikonNikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127Thermo FisherP-6867
Razor bladesPersonnaPersonna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
SulfobromophthaleinSigma-AldrichS0252
SuperglueKrazy GlueKrazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agaroseThermo Fisher16520050
VibratomePrecisionaryVF 310-0Z
Vibratome chilling blockPrecisionarySKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tubePrecisionarySKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheterBD383336BD Saf-T-Intima closed IV catheter

Ссылки

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены