Использование прецизионно разрезанного среза легких для изучения сократительной регуляции дыхательных путей и внутрилегочных артериальных гладких мышц

Резюме

Настоящий протокол описывает подготовку и использование прецизионных срезов легких мышей для оценки сократимости дыхательных путей и внутрилегочных артерий гладкой мускулатуры в среде почти in vivo .

Аннотация

Гладкомышечные клетки (SMC) опосредуют сокращение дыхательных путей и внутрилегочной артерии для изменения сопротивления воздушного потока и легочного кровообращения соответственно, играя, следовательно, играя решающую роль в гомеостазе легочной системы. Дерегуляции сократимости СМЦ способствует развитию ряда легочных заболеваний, включая астму и легочную гипертензию. Однако из-за ограниченного доступа к тканям и отсутствия систем культивирования для поддержания фенотипов SMC in vivo молекулярные механизмы, лежащие в основе дерегулированной сократимости SMC при этих заболеваниях, остаются полностью идентифицированными. Прецизионный срез легких (PCLS) предлагает модель ex vivo , которая обходит эти технические трудности. Как живой, тонкий участок легочной ткани, PCLS сохраняет SMC в естественной среде и позволяет in situ отслеживать сокращение SMC и внутриклеточную передачу сигналов Ca^{2 +} , которая регулирует сократимость SMC. Здесь представлен подробный протокол подготовки PCLS для мыши, который сохраняет интактные дыхательные пути и внутрилегочные артерии. Этот протокол включает в себя два основных шага перед тем, как подвергнуть долю легкого нарезке: надувание дыхательных путей агарозой с низкой температурой плавления через трахею и заполнение легочных сосудов желатином через правый желудочек. PCLS, приготовленный с использованием этого протокола, может быть использован для биоанализов для оценки Ca²⁺ -опосредованной сократительной регуляции SMC как в дыхательных путях, так и во внутрилегочных артериальных компартментах. При применении к мышиным моделям респираторных заболеваний этот протокол позволяет проводить функциональное исследование SMC, тем самым давая представление о базовом механизме дерегуляции сократимости SMC при заболеваниях.

Введение

Гладкомышечные клетки (SMC) являются основным типом структурных клеток в легких, в основном находящихся в медиа-стенке дыхательных путей и легочных сосудов. SMC сокращаются, чтобы изменить просветный калибр, тем самым регулируя воздух и кровоток ^1,2. Поэтому сократительная регуляция SMC имеет важное значение для поддержания гомеостаза вентиляции воздуха и легочного кровообращения. Напротив, аберрантная сократимость SMC провоцирует обструктивные заболевания дыхательных путей или легочных сосудов, такие как астма и легочная артериальная гипертензия. Однако функциональная оценка легких SMC была затруднена огранич....

протокол

Весь уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Массачусетской больницы общего профиля. Для настоящего исследования использовались самцы мышей дикого типа C57/B6 в возрасте 8 недель.

1. Экспериментальная подготовка

1. Подготовьте рабочий раствор.
   1. Приготовьте 1x сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS, с Ca²⁺ и Mg²⁺, и pH сбалансирован с 20 мМ HEPES, см. Таблицу материалов). Используйте решение HBSS для подготовки и обработки PCLS. Держите раствор HBSS холодным на льду ....

Результаты

Мышиный препарат PCLS, сохраняющий интактные внутрилегочные дыхательные пути и артерии
PCLS толщиной 150 мкм наблюдался под перевернутым фазоконтрастным микроскопом. В легких мышей проводящие дыхательные пути сопровождаются внутрилегочными артериями, идущими от хилуса к периф.......

Обсуждение

Подготовка PCLS включает в себя несколько критических этапов. Во-первых, важно равномерно надувать долю легкого, чтобы избежать изменения жесткости тканей от неравномерного распределения агарозы. Поскольку жидкая агароза быстро гелится в тонких катетерах или дыхательных путях при темп.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter