JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Nanogels هي منصة ممتازة ومتعددة الاستخدامات للجسيمات النانوية لتقديم الأدوية البيولوجية. تم تصنيع المواد الهلامية النانوية البوليمرية القائمة على البولي (الإيثيلين) جلايكول المستجيبة للمنبهات ، والقادرة على تغليف الحمولات القائمة على البروتين ، باستخدام استراتيجية البلمرة النانوية المشتركة ذات الربط المتقاطع من خطوة واحدة في الظروف المائية. يتم تقديم التصنيع والتوصيف الأمثل لهذه الجسيمات النانوية الجديدة هنا.

Abstract

تم تطوير الهلاميات النانوية التي تتكون من جزيئات نانوية بوليمرية متشابكة لتقديم العديد من العلاجات الكيميائية والبيولوجية ، نظرا لتوليفها المتعدد الاستخدامات من الأسفل إلى الأعلى والتوافق الحيوي. في حين تم استخدام طرق مختلفة لتخليق الهلام النانوي حتى الآن ، إلا أن القليل جدا منهم حققها دون استخدام مذيبات عضوية قاسية أو درجات حرارة عالية يمكن أن تلحق الضرر بسلامة الحمولة البيولوجية. في المقابل ، فإن المنهجية المعروضة هنا تحقق تخليق المواد الهلامية النانوية المحملة بالبروتين بحجم أقل من 100 نانومتر باستخدام ظروف تفاعل معتدلة. هنا ، نقدم طريقة للتغليف غير التساهمي للحمولات القائمة على البروتين داخل المواد الهلامية النانوية التي تم تصنيعها باستخدام تقنية البلمرة المشتركة القائمة على الماء ، أحادية الخطوة ، المتشابكة. في هذه التقنية ، نقوم في البداية بربط حمولة قائمة على البروتين إلكتروستاتيكيا بمونومر الأمونيوم الرباعي الكاتيوني وفي نفس الوقت نربط البلمرة المشتركة باستخدام بيرسلفات الأمونيوم و N ، N ، N '، N'-tetramethylethylenediamine لتشكيل المواد الهلامية النانوية التي تحبس حمولة البروتين. يتم تحديد حجم ومؤشر التشتت المتعدد للهلاميات النانوية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، بينما يتم تقييم مورفولوجيا السطح عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM). يتم تحديد كتلة البروتين المحاصر داخل المواد الهلامية النانوية عن طريق حساب كفاءة التغليف. علاوة على ذلك ، يتم أيضا تقييم قدرة الإطلاق المتحكم فيها للهلاميات النانوية عبر التحلل التدريجي للعناصر الهيكلية المستجيبة للأكسدة والاختزال في فحوصات الاختزال الأحيائي. نقدم أمثلة على بيانات تحسين الجسيمات النانوية لتوضيح جميع محاذير تخليق الهلام النانوي وتوصيفه باستخدام هذه التقنية. بشكل عام ، تم الحصول على هلاميات نانوية متجانسة الحجم بمتوسط حجم 57 نانومتر وقيمة مؤشر تشتت متعدد تبلغ 0.093. تم تحقيق كفاءة تغليف عالية بنسبة 76٪. علاوة على ذلك ، أظهرت المواد الهلامية النانوية إطلاقا محكما بنسبة تصل إلى 86٪ من البروتين المغلف عن طريق التحلل التدريجي للمكونات الجديدة المستجيبة للأكسدة والاختزال في وجود الجلوتاثيون على مدار 48 ساعة.

Introduction

الهلاميات النانوية عبارة عن هلاميات مائية ثلاثية الأبعاد بحجم ميكرون فرعي مع هياكل شبكة بوليمر متشابكة يمكنها الاحتفاظ بكميات كبيرة من السوائل داخل غلافها الأساسي دون التأثير على سلامتها المورفولوجية1. بشكل عام ، يتم تصنيع الهلاميات النانوية عن طريق بلمرة المونومرات الوظيفية عبر التشابك الفيزيائي أو الكيميائي في الأنظمة الغروية غير المتجانسة ، مثل المستحلبات الدقيقة العكسية للماء في الزيت2،3. يمكن أن تتجمع البوليمرات المشتركة البرمائية ذاتيا في هياكل نانوية في البيئات المائية. ومع ذلك ، يجب تثبيتها باستخدام استراتيجيات التشابك الكيميائية التي تتضمن ثاني كبريتيدات أو اقتران قائم على الأميد ، أو كيمياء النقر ، أو يمكن أن تكون مستحثة جسديا (استراتيجيات كارهة للماء أو إلكتروستاتيكية أو رابطة هيدروجينية) أو مستحثةبالضوء 4. من بين هذه الاستراتيجيات ، تم الإبلاغ عن التجميع الذاتي الفيزيائي للبوليمرات متبوعا بالتشابك الكيميائي كتقنية تصنيع نانوهلامناجحة 5. بينما تاريخيا ، تم تقديم أول نانو هلام في التسعينيات من قبل Vingradov et al.6 و Akiyoshi et al.7 و Lemieux et al.8 ، في الآونة الأخيرة ، تم تطوير واستكشاف مجموعة متنوعة من المواد الهلامية النانوية الذكية المكونة من البوليمرات الطبيعية والاصطناعية لتطبيقات طبية حيويةمتنوعة 9.

تمتلك Nanogels قدرة واسعة على الاحتفاظ بالبضائع ، ومساحة سطح كبيرة ، واستقرار في الجسم الحي ، بالإضافة إلى خصائص كيميائية وميكانيكية قابلة للتخصيص10. تخليق الهلاميات النانوية قابل للتطوير أيضا ويمكن أن يكون قائما على الماء. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المحتوى المائي المعزز للهلاميات النانوية يجعلها ناقلات فعالة للحمولات البيولوجيةالحساسة 11. علاوة على ذلك ، يمكن أن تلبي مساحة السطح العالية احتياجات متعددة من الاقتران الحيوي ، مما يسمح بربط طرائق الاستهداف لتمكين الاستهداف النشط. والجدير بالذكر أن تعدد استخدامات تصميم الهلام النانوي يسمح باستخدام مجموعة واسعة من المونومرات المستجيبة للمنبهات التي تسمح بالتحكم الدقيق في خصائصها الفيزيائية والكيميائية9. تتيح هذه الهندسة الفريدة التحسين العقلاني لتصميم النانو هلام ، والذي يصعب تحقيقه باستخدام الجسيمات الشحمية أو المذيلات أو البوليميروسومات المستخدمة تقليديا12،13. من خلال دمج الشقوق المستجيبة للمنبهات داخل المونومرات المصممة خصيصا ، يمكن تصميم الهلاميات النانوية لتحفيز الإطلاق المتحكم فيه لحمولتها استجابة للعديد من المحفزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، مثل الأس الهيدروجيني ، وظروف الأكسدة والاختزال ، والإنزيمات ، وما إلى ذلك.9،14. تعتبر هذه الهلاميات النانوية الذكية أكثر فائدة من الهلاميات النانوية التقليدية ، لأنها تمتلك ثباتا فائقا لدورة الدم الممتدة ، ويمكنها تحمل الظروف الفسيولوجية للحفاظ على سلامة حمولتها والتوسط في إطلاقها المتحكم فيه في المواقع المستهدفةالمرغوبة 15. في الواقع ، نظرا لطبيعتها متعددة الاستخدامات ، اكتسبت المواد الهلامية النانوية زخما في الساحة الطبية الحيوية ، مع تقدم ملحوظ في تطوير الهلاميات النانوية المستجيبة للمنبهات للعديد من التطبيقات العلاجية والتشخيصية2،16،17.

يمكن أن تمثل البيولوجيا فئة من المنتجات الصيدلانية تتكون من البروتينات و / أو الببتيدات و / أو الأحماض النووية وقد أحدثت ثورة في المشهد العلاجي نظرا لانتقائيتها الرائعة ، وبالتالي أصبحت فئة العلاجات الأسرعنموا 18. في الواقع ، يتضح السوق المتنامي لمثل هذه العلاجات في الزيادة الحادة في الموافقة عليها من قبل جمعية الأدوية الفيدرالية الأمريكية (FDA) ، حيث مثلت الأدوية البيولوجية ~ 40٪ من إجمالي الموافقات على الأدوية ، في عام 202319. بالإضافة إلى خصوصيتها وفعاليتها ، أدت الاكتشافات السريعة لأهداف الأدوية الجديدة ، وعمليات الهندسة الحيوية الأكثر كفاءة ومعرفة أكبر بمصير هذه العلاجات في الجسم الحي إلى زيادة استخدامها20. تشمل البيولوجية التقليدية الحمض النووي الريبي المتداخل والبروتينات البديلة والسيتوكينات والهرمونات التي يتم إنشاؤها عادة باستخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف21. منذ الموافقة على الأنسولين المؤتلف البشري في عام 1982 ، تم تطوير الأدوية البيولوجية للعديد من الحالات بما في ذلك السرطان (على سبيل المثال ، trastuzumab ، avelumab) ، ومرض التهاب الأمعاء (على سبيل المثال ، adalimumab ، certolizumab) والأمراض الوراثية النادرة (على سبيل المثال ، mipomersan ، myozyme ، aldurazyme ، fabrazyme) 21. في حين أن الخصوصية العالية لتفاعلات الأدوية البيولوجية مع أهدافها يجب أن تعوض نظريا أي تأثيرات خارج الهدف ، فقد ظهرت العديد من المخاوف السريرية مع استخدامها فيما يتعلق بالآثار الجانبية غير المرغوبفيها 22. يمكن تجميع هذه الآثار الجانبية في فئتين ، بما في ذلك علم الأدوية المبالغ فيه (التحفيز المفرط للأهداف) والمناعة. علاوة على ذلك ، فإن نصف عمرها القصير ، والتوافر البيولوجي المحدود ، وتلف البروتياز ، وقصر العمر الافتراضي ، وعمليات الإنتاج المكلفة تحد من فوائدها العلاجية21. تتضمن الطرق التقليدية للتخفيف من هذه المشكلات التعديل التساهمي لهذه البيولوجيا التي يمكن أن تضر بوظيفتها ، وبالتالي الفعالية23. بدلا من ذلك ، يمكن أن يمنح نهج الطب النانوي لتغليف الحمولات العلاجية العديد من المزايا للخصائص الدوائية ، وأهمها الاستهداف السلبي للموقع الملتهب عبر تأثير النفاذية والاحتفاظ المحسن (EPR)24. يمكن أن تشمل الفوائد الأخرى المرتبطة بالجسيمات النانوية أوقات الدورة الدموية المحسنة ، وانخفاض معدل التصفية ، وزيادة مرونة الصياغة ، وتحسين نفاذية الأوعية الدموية والامتصاص الخلوي25. في حين أن مجموعة كبيرة ومتنوعة من تركيبات الجسيمات النانوية قيد التحقيق حاليا لتوصيل الحمولات البيولوجية ، إلا أن القليل منها يمكنه محاكاة الوظائف المتعددة للهلاميات النانوية. في الواقع ، تتجاوز المواد الهلامية النانوية قدرات التحميل التي تحققها الجسيمات النانوية القائمة على الدهون والمذيلات ، وتظهر استقرارا غرويا أكبر من معظم الجسيمات النانوية غير العضوية. على هذا النحو ، تقدم المواد الهلامية النانوية منصة قيمة لتقديم العلاجات البيولوجية المختلفة.

لقد نجحنا سابقا في تقديم إنزيم مضاد للأكسدة داخل المواد الهلامية النانوية البوليمرية المتشابكة المستجيبة للبروتين المعدني ، حيث حافظت استراتيجية التغليف الخفيفة المستخدمة على النشاط الحيوي للبروتين عند الإصدار26. في هذا العمل ، نوضح التوليف الأمثل للهلاميات النانوية المستجيبة للأكسدة والاختزال لإيصال الحمولات القائمة على البروتين. والجدير بالذكر أن المنهجية التركيبية تمكن من تخليق الهلام النانوي باستخدام ظروف معتدلة لتغليف الحمولة المطلوبة ، دون استخدام مذيبات عضوية قاسية أو درجات حرارة عالية. لقد استغلنا توازن الأكسدة والاختزال داخل البيئة داخل الخلايا لتنظيم إطلاق الحمولة المغلفة27،28. عادة ما يتحكم الجلوتاثيون المضاد للأكسدة الوفيرة بشكل طبيعي (GSH) في إمكانات الأكسدة والاختزال خارج الخلية وداخل الخلايا ، حيث يتراوح تركيزه بين 2-20 ميكرومتر و 1-10 ملي مولار ، على التوالي29،30. حتى الآن ، تم الإبلاغ عن العديد من الجسيمات النانوية الحساسة للأكسدة والاختزال ، مما يجعل هذه استراتيجية مجربة وموثوقة لتمكين الإطلاق الخاضع للرقابة من الأدوية في الجسم الحي27،28. في الواقع ، تم تركيب روابط ثاني كبريتيد داخل المواد النانوية البوليمرية باستخدام الروابط المتشابكة المحتوية على ثاني كبريتيد31،32 ، والتجميع الذاتي للبوليمرات القابلة للتحلل الحيوي من المونومرات المحتوية على ثاني كبريتيد33 ، والأدوية الأولية البوليمرية المستجيبة للأكسدة والاختزال أو مترافقات الدواء / البوليمر34،35. لذلك ، تبحث هذه الدراسة في دمج الوصلة المتشابكة لثاني كبريتيد فريدة وحساسة للغاية ل GSH داخل الجسيمات النانوية البوليمرية ، مما يتيح الإطلاق المتحكم فيه لحمولة البروتين المغلفة.

في هذه الدراسة ، تركز تصميم النانو هلام على المعايير التالية لمعالجة الخصوصية وتسليم الحمولة: الحجم الصغير (~ 100 نانومتر) وتوزيع الحجم المنتظم (مؤشر التشتت المتعدد (PI)<0.3) لضمان الاختراق الفعال للبطانة والاستقرار في الجسم الحي 27. تغليف فعال لحمولة البروتين ، والتحكم في إطلاق الحمولة استجابة ل GSH. أبلغنا عن تخليق الهلاميات النانوية المتشابكة المستجيبة ل GSH ، والتي أظهرت جسيمات نانوية متجانسة بحجم 100 نانومتر ، مع كفاءة تغليف 76٪ لحمولة البروتين المطلوبة.

Protocol

1. توليف الرابط المتشابك المستجيب للأكسدة والاختزال

  1. أضف 2-أمينوإيثيل ميثاكريليت هيدروكلوريد (44.79 مجم ، 0.270 ملليمول) و 0.063 مل من ثلاثي إيثيل أمين إلى 3 مل من ثنائي كلورو الميثان اللامائي واتركه يخلط لمدة 20 دقيقة تحت غاز N2 الخامل في قارورة دائرية القاع سعة 25 مل.
  2. قم بإذابة 4،7،10،13،16،19،22،25،32،35،38،41،44،47،50،53-Hexadecaoxa-28،29-dithiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl ester (100 مجم ، 0.045 مليمول) في 1 مل من ثنائي كلورو ميثان اللامائي وأضفه إلى القارورة.
  3. أضف 4 مل من ثنائي كلورو الميثان اللامائي إلى القارورة. لف قارورة التفاعل بورق الألمنيوم واتركها لتقلب تحت N2 في درجة حرارة الغرفة.
  4. تأكيد تكوين المنتج بواسطة كروماتوغرافيا طبقة رقيقة. تأكد من المراجع الصحيحة للمواد الأولية مع تأكيد تشكيل المنتج بهذه الطريقة.
    1. كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة هي طريقة قائمة على التقارب تستخدم لفصل المركبات المرغوبة عن خليط التفاعل. هنا ، استخدم صفيحة السيليكا شديدة القطبية والممتزة كمرحلة ثابتة. ضع عينة المادة الأولية وعينة خليط التفاعل على أحد طرفي صفيحة السيليكا وضعها عموديا في دورق زجاجي مغلق مع المادة المساءلة (المرحلة المتنقلة: 5٪ ميثانول: ثنائي كلورو ميثان).
    2. من خلال العمل الشعري ، تتحرك المرحلة المتحركة لأعلى صفيحة السيليكا وتهاجر مركبات العينة لمسافات متفاوتة اعتمادا على صلاتها للمرحلتين الثابتة والمتنقلة. عندما تعبر مقدمة المذيب 3/4من اللوحة ، قم بإزالة اللوحة وجففها. تظهر المركبات المنفصلة على شكل بقع على اللوحة. حدد كمية عامل الاحتفاظ (Rf) للمركب المطلوب كمسافة يقطعها المركب / المسافة المقطوعة بواسطة المذيب. هنا ، كان Rf للمنتج 0.35. يمكن استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو التلوين لتصور البقع (برمنجنات البوتاسيوم).
  5. تركيز الخليط في الفراغ وتنقيته عن طريق كروماتوغرافيا عمود الفلاش (خليط متساوي من 5٪ ميثانول: ثنائي كلورو ميثان)36. أدخل خليط التفاعل على الجزء العلوي من عمود زجاجي معبأ بالسيليكا (الطور الثابت) ثم قم بإزالته بنظام المذيبات (المرحلة المتنقلة)36. اجمع كل الكسور وفحصها باستخدام TLC لتمييز كسور المنتج باستخدام قيمة Rf المحددة مسبقا.
  6. قم بتركيز الكسور المنقاة عن طريق تبخير المذيب باستخدام مبخر دوار (درجة الحرارة: 40 درجة مئوية) ، واضبط ضغط الفراغ على الضغط الجوي لإزالة ثنائي كلورو ميثان الغليان المنخفض أولا. عندما يتوقف مستوى المذيب عن الانخفاض ، اضبط ضغط الفراغ على 337 ملي بار لإزالة الميثانول والحصول على زيت أصفر باهت ، والذي سيخضع بعد ذلك لمزيد من التوصيف لتأكيد تكوين المنتج37.
  7. إجراء تحليل الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FT-IR)38 ، 1H NMR (في ثنائي ميثيل سلفوكسيد مزيل (DMSO-d 6)) 39 ، 13C NMR39 وتحليل وقت الامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-ToF) 40 لتأكيد تكوين المنتج قبل تنفيذ الخطوات التالية.
    1. لتحليل FT-IR ، قم بتحميل 1 مجم من الزيت على الجهاز للحصول على الأطياف.
    2. لتحليلات الرنين المغناطيسي النووي ، أعد إذابة 10 مجم من المنتج في 0.75 مل من مذيب الرنين المغناطيسي النووي ذي الصلة ، ونقله إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وأغلقه بإحكام لمنع التسرب. قم بتحميل العينة على أداة الرنين المغناطيسي النووي ، وبعد ذلك يتم الحصول على الأطياف39.
    3. لتحليل قياس الطيف الكتلي ، قم بإغلاق 1 مجم من المنتج في قارورة ، ثم قم بإذابته في DMSO وتحميله على الجهاز.
      ملاحظة: يوفر تحليل الأشعة تحت الحمراء معلومات تتعلق بالمجموعات الوظيفية الرئيسية في المنتج المطلوب ، وهي امتدادات الكربونيل (C = O) التي تم تحديدها بواسطة الذروة الحادة عند 1650 سم -1 تشير إلى تكوين رابطة الأميد ، وبالتالي تسليط الضوء على تكوين المنتج. يوفر الرنين المغناطيسي النووي 1H و 13C معلومات عن البيئات الكيميائية وبالتالي يمكن استخدامها لتحديد التركيب الكيميائي للمنتج المطلوب من خلال تحديد البيئات الكيميائية الموجودة في المركب. أخيرا ، يمكن أن يؤدي استخدام قياس الطيف الكتلي إلى التحقق من الكتلة الدقيقة للمنتج المطلوب.

2. اختبار انقسام الرابط المتقاطع ثنائي كبريتيد مع الجلوتاثيون

  1. احتضان الرابط المتقاطع لثاني كبريتيد (إلى تركيز نهائي يبلغ 4.55 مجم / مل) مع عامل الجلوتاثيون المختزل (النهائي [GSH]: 10 مل) ، إلى حجم نهائي قدره 1 مل ، لمدة 24 ساعة في قارورة زجاجية سعة 1.5 مل.
  2. لتأكيد انقسام رابط ثاني كبريتيد ، أرسل القارورة لتحليل MALDI-ToF26،40.

3. تخليق nanogel المستجيب للأكسدة والاختزال

  1. تأكد من خلو جميع الأواني الزجاجية التي سيتم استخدامها في التفاعل من الغبار عن طريق الغسيل بالماء منزوع الأيونات المصفى (0.20 ميكرومتر) ثم تجفيف الأواني الزجاجية باستخدام الهواء المضغوط الذي يمكن الوصول إليه عبر أداة الهواء المضغوط على جانب الدخان. قم بتوصيل فوهة آمنة بمخرج الهواء المضغوط لتسهيل إمكانية الوصول. أمسك القارورة بإحكام وضع الفوهة فيها. قم بتنشيط الهواء المضغوط ، وإطلاق تيار متحكم فيه في القارورة. راقب العملية لضمان التجفيف الفعال ، والتحقق من وجود أي ملوثات أو رطوبة متبقية.
  2. قم بإعداد قارورة زجاجية سعة 10 مل عن طريق ملئها بالماء منزوع الأيونات وإغلاق القارورة بحاجز مطاطي. قم بإزالة الأكسجين من الماء عن طريق فقاعات N2 من خلاله لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء التفاعل. للقيام بذلك ، املأ بالونا بغاز N2 وقم بإرفاق إبرة بالبالون ؛ ضعه على الحاجز واستخدم الإبرة لاختراق الحاجز المطاطي والسماح بتدفق N2 . قم بتوصيل إبرة خروج بالقارورة لضمان التدفق المستمر ل N2.
  3. قم بإذابة ألبومين مصل الأبقار (BSA ؛ 2 مجم ، 30 نانومول) أو BSA الموسم ب Cy7 (2 مجم ، 30 نانومول) في 1 مل من الماء منزوع الأيونات منزوع الأكسجين وأضفه إلى قارورة زجاجية نظيفة أخرى سعة 10 مل.
  4. أضف محلول [2- (أكريلويل لوكسي) إيثيل] ثلاثي ميثيل أمونيوم كلوريد (AETC) (12.00 مجم / 10.86 ميكرولتر ، 0.060 ملليمول) إلى القارورة وأغلقها باستخدام حاجز مطاطي آخر. تأكد من الاحتفاظ بخليط التفاعل تحت تدفق مستمر من غاز N2 وحركه لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بإذابة مادة الأكريلاميد (9.21 مجم ، 0.13 ملليمول) في 1 مل من الماء منزوع الأيونات منزوع الأكسجين وأضفه إلى الخليط في القارورة.
  6. قم بإذابة الوصلة المتشابكة بثاني كبريتيد (4.44 مجم ، 0.004 ملليمول) في 1 مل من الماء منزوع الأيونات وأضفه إلى الخليط في القارورة. اغسل الخليط بغاز N2 لمدة 20 دقيقة.
  7. قم بإذابة كبريتات دوديسيل الصوديوم (2 مجم ، 0.007 ملليمول) في 1 مل من الماء منزوع الأيونات منزوع الأكسجين وأضفه إلى الخليط عبر حقنة مغسولة بغاز N2 وحرك الخليط لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: عن طريق شطف المحقنة ب N2 ، نقلل من تعرض خليط التفاعل للأكسجين في الغلاف الجوي الذي يمكن أن يثبط تفاعل البلمرة الجذرية.
  8. أضف N ، N ، N '، N'-tetramethylethylenediamine (1.5 ميكرولتر ، 0.010 مليمول) واترك خليط التفاعل يزيل الأكسجين لمدة 3 دقائق تحت غاز N2 .
  9. قم بإذابة بيرسلفات الأمونيوم (1 مجم ، 0.004 ملليمول) في 1 مل من الماء منزوع الأيونات منزوع الأكسجين وأضفه إلى خليط التفاعل. تأكد من أن غاز N2 يتدفق عبر خليط التفاعل لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: إذا تم حذف خطوة الجمع N2 ، فمن المحتمل أن تتشكل جسيمات بيضاء في قارورة التفاعل. هذه جزيئات و / أو مجاميع أكبر حجما ويمكن أن تربك أي توصيف آخر.
  10. أغلق القارورة تحت جو N2 واتركها لتقليب لمدة 3 ساعات و 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. لإنهاء التفاعل ، قم بإزالة الختم من القارورة واترك خليط التفاعل يتحرك لمدة 10 دقائق على الأقل. هذا من شأنه أن يعرض خليط التفاعل لمستويات الغلاف الجوي لغاز O2 ، والذي من شأنه بعد ذلك إخماد أي جذور متبقية في خليط التفاعل. ينتهي التفاعل عندما يفترض الخليط مظهرا أزرق لامعا صافيا.
  12. من أجل تنقية المواد الهلامية النانوية ، أضف خليط التفاعل إلى وحدة مرشح الطرد المركزي سعة 15 مل (100 كيلو دالتون MWCO) وأضف الماء منزوع الأيونات لملء وحدة الطرد المركزي. الطرد المركزي خليط التفاعل عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق. سيؤدي ذلك إلى إزالة أي مواد كيميائية غير متفاعلة (أو حمولة غير مغلفة) أصغر من 100 كيلو دالتون وتركيز عينة الهلام النانوي.
  13. بمجرد انخفاض مستوى الماء في وحدة الطرد المركزي ، أضف 2 مل من الماء منزوع الأيونات لتخفيف عينة الهلام النانوي وجهاز الطرد المركزي لتركيز المنتج. كرر هذه الخطوة 3x.
  14. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمنع تدهور البروتين المغلف.
  15. إجراء تحليل FT-IR و 1H NMR (في ثنائي ميثيل سلفوكسيد مزيل (DMSO-d 6)) لتأكيد البلمرة39،41. لتحضير العينة ، جفف 1 مل من محلول النانو في قارورة سعة 1.5 مل. تتضمن عملية التجفيف بالتجميد تجميد العينة ثم تطبيق فراغ لإزالة المذيب المجمد من خلال التسامي ، تاركا وراءه بقايا مسحوق. بعد التجفيف بالتجميد ، أعد إذابة العينة في مذيب الرنين المغناطيسي النووي ذي الصلة ، وانقلها إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وأغلقها بإحكام. قم بتحميل العينة على جهاز الرنين المغناطيسي النووي ، كما هو موضح سابقا39. لتحليل FT-IR ، يجب تحميل 1 مجم من المسحوق الجاف على الجهاز للحصول على الأطياف.

4. التوصيف المورفولوجي نانوجيل

  1. تشتت الضوء الديناميكي (DLS)
    ملاحظة: تم قياس القطر الهيدروديناميكي (نانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد (PI) وإمكانات زيتا عند 25 درجة مئوية ، وطول موجة ليزر 632.8 نانومتر وكاشف إشارة 173 درجة باستخدام جهاز DLS. تم قياس كل تشغيل 25 دورة مسح فرعية.
    1. قياس الحجم الهيدروديناميكي (نانومتر)
      1. قم بإعداد كوفيت أو خلية شعرية مطوية يمكن التخلص منها عن طريق تنظيفها بالماء منزوع الأيونات المصفى. نفخ الهواء المضغوط في الكوفيت (مناسب لكل من قياسات DLS و zeta) لضمان خلوها من جزيئات الغبار الكبيرة.
      2. املأ الكوفيت بما لا يقل عن 50-100 ميكرولتر من العينة وخفف في 750-1000 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات المصفى. أثناء استخدام كوفيت زيتا المحتمل ، تأكد من ملء الكوفيت بعينة دون تكوين فقاعات ، مما قد يزعج القياسات.
      3. ضع الكوفيت داخل أداة DLS ، مع التأكد من إدخالها بشكل صحيح. للقيام بذلك ، افتح غطاء حجرة العينة لأداة DLS. أمسك الكوفيت من حوافها العلوية لتجنب بصمات الأصابع على النوافذ البصرية. تأكد من تثبيت الكوفيت بشكل صحيح في حامل الكوفيت مع التأكد من أنه مستوي ومحاذاة مع المسار البصري للجهاز. أغلق حجرة العينة لمنع تداخل الإضاءة المحيطة.
        ملاحظة: يتم تصفية وسائط التخفيف باستخدام مرشح حقنة بحجم المسام 0.45 ميكرومتر.
      4. انقر لبدء قياس حجم الجسيمات على برنامج آلة DLS ذي الصلة.
      5. حدد النتائج المقابلة للعينة للحصول على المتوسط z (متوسط حجم الجسيمات) ، ومتوسط PI ، وعدد الكيلوغرامات في الثانية (kcps) ، وإمكانات zeta والرسومات ذات الصلة. تأكد من أن وظيفة الارتباط تظهر منحنى سيني سلس ، لأن هذا يشير إلى عينة موحدة.
      6. بمجرد اكتمال التحليل ، قم بإزالة الكوفيت من DLS.
  2. الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM)
    1. تحضير العينات عن طريق وضع 10 ميكرولتر من محلول الجسيمات النانوية (0.077 مجم / مل) على شبكات نحاسية مطلية بالكربون. يجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    2. اغسل الشبكات بالماء منزوع الأيونات المصفى وصمة عار ب 5 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل المصفاة بنسبة 1٪ في الماء لمدة دقيقتين.
    3. بعد نقع عامل التلوين الزائد بورق الترشيح ، جفف الشبكات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. التقط صور TEM في اليوم التالي بتكبير 45,000 مرة باستخدام كاميرا المجال الساطع.
    4. استخدم البرنامج المقدم لمعالجة الصور (الدقة: 2048 × 2048 بكسل).

5. القياس الكمي للبروتين (BSA) المغلف داخل الهلاميات النانوية باستخدام مقايسة حمض البيسينشونيك الصغير (BCA)

  1. وفقا لبروتوكول فحص microBCA (الموجود على موقع الشركة المصنعة) ، قم بإنشاء منحنى قياسي بناء على تركيز بروتين محددمسبقا 42.
  2. بعد تخليقها ، قم بتنقية المواد الهلامية النانوية المغلفة بالبروتين باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي سعة 15 مل مع 100 كيلو دالتون MWCO (1000 × جم ، 10 دقائق) كما هو موضح في الخطوات 3.12-3.14.
  3. اجمع الترشيح وقم بتحليله باستخدام مقايسة microBCA (البروتوكول المتاح على موقع الشركة المصنعة). قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. نظرا لأن هذا القياس يرتبط بتركيز البروتين غير المغلف ، حدد كتلة البروتين المغلف. لحساب كفاءة التغليف (EE) ٪ ، استخدم المعادلة التالية:
    figure-protocol-11999

6. القياس الكمي لإطلاق البروتين من الهلاميات النانوية في وجود الجلوتاثيون

  1. احتضان 200 ميكرولتر من 5 مجم / مل من المواد الهلامية النانوية المحملة ب Cy7BSA مع 200 ميكرولتر من 10 ملي مولار من الجلوتاثيون (GSH) في وحدات مرشح الطرد المركزي 0.5 مل (100 كيلو دالتون MWCO). ضع وحدات الفلتر في حمام مائي للحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
  2. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق كل 10 دقائق لمدة ساعة واحدة على الأقل - ثم كل 2-8 ساعات.
  3. اجمع المرشح واستخدمه لمزيد من التحليل. حافظ على حجم المرشح داخل وحدات مرشح الطرد المركزي عند 500 ميكرولتر عن طريق إضافة المزيد من الماء منزوع الأيونات أو PBS.
  4. قم بقياس كمية البروتين في المرشحات من خلال الرجوع إلى منحنى قياسي للهلاميات النانوية المحملة ب Cy7BSA ، حيث تم قياس امتصاص البروتين الفلوري باستخدام أداة قطرة نانوية عند 750 نانومتر.
    ملاحظة: يمكن حساب هذا المنحنى القياسي عن طريق إعداد التخفيفات التسلسلية ل Cy7BSA في نطاق 0 مجم / مل إلى 2 مجم / مل. يمكن استيفاء القيم التي تم الحصول عليها من القطرة النانوية مقابل منحنى المعايرة هذا لتحديد كفاءة التغليف.

النتائج

تخليق وتوصيف الوصلة المتشابكة متعددة (الإيثيلين جلايكول) (PEG) ثاني كبريتيد دياكريليت تم تصنيع الرابط المتقاطع المستجيب للأكسدة والاختزال عن طريق الاستبدال النووي لإستر N-hydroxysuccinimide (NHS) بواسطة 2-aminoethyl methacrylate عن طريق تكوين ارتباط أميد (الشكل 1)....

Discussion

أدى الطلب المتزايد على الأدوية البيولوجية المحددة للأهداف في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية إلى الحاجة إلى تقنيات يمكن أن تحسن ملامحها الدوائية في الجسم الحي ، مع منع تدهورها الفسيولوجي السريع وتعويض أي آثار جانبية غير مرغوب فيها. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يتم...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنهم. لا توجد تفاصيل مالية للإعلان عنها.

Acknowledgements

نشكر قسم الكيمياء في إمبريال كوليدج لندن ومعهد مجلس البحوث الطبية لعلوم الحياة على دعمهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
2-(
acryloyloxy)ethyl]trimethylammonium chloride solution 		Sigma Aldrich496146
2-aminoethyl methacrylatehydrochloride Sigma Aldrich516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,
44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl ester 		Sigma Aldrich671630
AcrylamideSigma Aldrich23701
Ammonium persulfateSigma Aldrich248614
Bovine serum albuminSigma AldrichB6917
Cy7- labelled bovine serum albuminNanocsBS1-S7-1
Deuterated dimethyl sulfoxideSigma Aldrich547239
DichloromethaneSigma Aldrich270997 (anhydrous) and D65100
GlutathioneSigma AldrichG4251
MethanolSigma Aldrich34860
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine Sigma Aldrich411019
Phosphate buffered saline ThermoFisher10010023
Sodium dodecyl sulfateSigma Aldrich436143
TriethylamineSigma Aldrich471283
Uranyl AcetateAgar Scientific AGR1260A
Equipment necessary for nanogel synthesis and characterisation
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter units (100kDa MWCO) Merck MilliporeC7715
CameraOlympus Veleta
Carbon-coated copper gridsAgar Scientific AGS160
Dialysis tubing (100kDa MWCO)Spectrum labs11405949
Dynamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano Ultra
Freeze dryerLabconcoWZ-03336-01
Infrared spectroscopyAgilent Cary 630 FTIR
iTEM softwareOlympus 
Mass spectrometryWatersMicromass MALDI microMX MALDI Q-ToF 
MF-MilliporeTM membrane filter (0.45/0.2μm pore size)Merck Millipore, UKHAWP04700, GSWP04700 
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher23235
Plate readerBeckmanCoulter-PARADIGM
Proton and Carbon-13 nuclear magnetic resonance dataBruker400MHz AV-400 NMR spectrometer
Rotary evaporator Buchi R-114 Rotary Vap System
Single-use needles Sterican4665643
Suba-Seal septaSigma AldrichZ124575
Transmission electron microscopyPhillips CM 100 TEM 
UV-vis spectrophotometerNanodropNanodrop One/One C microvolume 

References

  1. Zhang, X., Malhotra, S., Molina, M., Haag, R. Micro- and nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chem Soc Rev. 44 (7), 1948-1973 (2015).
  2. Chacko, R. T., Ventura, J., Zhuang, J., Thayumanavan, S. Polymer nanogels: A versatile nanoscopic drug delivery platform. Adv Drug Del Rev. 64 (9), 836-851 (2012).
  3. Hajebi, S., et al. Stimulus-responsive polymeric nanogels as smart drug delivery systems. Acta Biomaterialia. 92, 1-18 (2019).
  4. Lee, V. Y., et al. Nanogel star polymer architectures: A nanoparticle platform for modular programmable macromolecular self-assembly, intercellular transport, and dual-mode cargo delivery. Adv Mat. 23 (39), 4509-4515 (2015).
  5. Ekkelenkamp, A., Rachèl Elzes, M., Engbersen, J. F., Paulusse, J. M. Responsive crosslinked polymer nanogels for imaging and therapeutics delivery. J Mat Chem B. 6 (2), 210-235 (2018).
  6. Vinogradov, S. V., Zeman, A. D., Batrakova, E. V., Kabanov, A. V. Polyplex nanogel formulations for drug delivery of cytotoxic nucleoside analogs. J Control Rel. 107 (1), 143-157 (2015).
  7. Akiyoshi, K., Deguchi, S., Moriguchi, N., Yamaguchi, S., Sunamoto, J. Self-aggregates of hydrophobized polysaccharides in water. Formation and characteristics of nanoparticles. Macromol. 26 (12), 3062-3068 (1993).
  8. Lemieux, P., et al. Block and graft copolymers and NanoGel copolymer networks for DNA delivery into cell. J Drug Target. 8 (2), 91-105 (2000).
  9. Preman, N. K., Barki, R. R., Vijayan, A., Sanjeeva, S. G., Johnson, R. P. Recent developments in stimuli-responsive polymer nanogels for drug delivery and diagnostics: A review. Euro J Pharma Biopharmac. 157, 121-153 (2020).
  10. Oh, J. K., Drumright, R., Siegwart, D. J., Matyjaszewski, K. The development of microgels/nanogels for drug delivery applications. Prog Poly Sci. 33 (4), 448-477 (2008).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Deng, C., Suuronen, E. J., Zhong, Z. Click hydrogels, microgels and nanogels: Emerging platforms for drug delivery and tissue engineering. Biomat. 35 (18), 4969-4985 (2014).
  12. Napier, M. E., DeSimone, J. M. Nanoparticle drug delivery platform. Poly Rev. 47 (3), 321-327 (2007).
  13. Malmsten, M. Soft drug delivery systems. Soft Matt. 2 (9), 760-769 (2006).
  14. Kamaly, N., Yameen, B., Wu, J., Farokhzad, O. C. Degradable controlled-release polymers and polymeric nanoparticles: Mechanisms of controlling drug release. Che Rev. 116 (4), 2602-2663 (2016).
  15. Molina, M., et al. Stimuli-responsive nanogel composites and their application in nanomedicine. Chem Soc Rev. 44 (17), 6161-6186 (2015).
  16. Ma, Y., Ge, Y., Li, L. Advancement of multifunctional hybrid nanogel systems: Construction and application in drug co-delivery and imaging technique. Mat Sci Eng: C. 71, 1281-1292 (2017).
  17. Wang, H., Qian, J., Ding, F. Recent advances in engineered chitosan-based nanogels for biomedical applications. J Mat Chem B. 5 (34), 6986-7007 (2017).
  18. Durán-Lobato, M., Niu, Z., Alonso, M. J. Oral delivery of biologics for precision medicine. Adv Mat. 32 (13), 1901935 (2020).
  19. de la Torre, B. G., Albericio, F. The pharmaceutical industry in 2022: An analysis of FDA drug approvals from the perspective of molecules. Molecules. 28 (3), 1038 (2023).
  20. Škalko-Basnet, N. Biologics: The role of delivery systems in improved therapy. Biologics. 8, 107-114 (2014).
  21. Andrews, L., Ralston, S., Blomme, E., Barnhart, K. A snapshot of biologic drug development: Challenges and opportunities. Human Exp Toxicol. 34 (12), 1279-1285 (2015).
  22. Sathish, J. G., et al. Challenges and approaches for the development of safer immunomodulatory biologics. Nat Rev Drug Disc. 12 (4), 306-324 (2013).
  23. Pfister, D., Morbidelli, M. Process for protein PEGylation. J Control Rel. 180, 134-149 (2014).
  24. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  25. Golombek, S. K., et al. Tumor targeting via EPR: Strategies to enhance patient responses. Adv Drug Del Rev. 130, 17-38 (2018).
  26. Basak, S., et al. Simultaneous cross-linking and cross-polymerization of enzyme responsive polyethylene glycol nanogels in confined aqueous droplets for reduction of low-density lipoprotein oxidation. Biomacromol. 22 (2), 386-398 (2021).
  27. Morgulchik, N., Kamaly, N. Meta-analysis of in vitro drug-release parameters reveals predictable and robust kinetics for redox-responsive drug-conjugated therapeutic nanogels. ACS Appl Nano Mat. 4 (5), 4256-4268 (2021).
  28. Ghorbani, M., Hamishehkar, H. Redox-responsive smart nanogels for intracellular targeting of therapeutic agents: Applications and recent advances. J Drug Target. 27 (4), 408-422 (2019).
  29. Bajic, V. P., et al. Glutathione "redox homeostasis" and its relation to cardiovascular disease. Oxi Med Cell Long. 2019, e5028181 (2019).
  30. Forman, H. J., Zhang, H., Rinna, A. Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Mol Asp Med. 30 (1-2), 1-12 (2009).
  31. Wang, Y. C., et al. Core-shell-corona micelle stabilized by reversible cross-linkage for intracellular drug delivery. Macromol Rapid Comm. 31 (13), 1201-1206 (2010).
  32. Elkassih, S. A., Kos, P., Xiong, H., Siegwart, D. J. Degradable redox-responsive disulfide-based nanogel drug carriers via dithiol oxidation polymerization. Biomat Sci. 7 (2), 607-617 (2019).
  33. Hu, X., et al. Stimuli-responsive polymersomes for biomedical applications. Biomacromol. 18 (3), 649-673 (2017).
  34. Navath, R. S., Wang, B., Kannan, S., Romero, R., Kannan, R. M. Stimuli-responsive star poly(ethylene glycol) drug conjugates for improved intracellular delivery of the drug in neuroinflammation. J Control Release. 142 (3), 447-456 (2010).
  35. Ling, X., et al. Glutathione-responsive prodrug nanoparticles for effective drug delivery and cancer therapy. ACS Nano. 13 (1), 357-370 (2019).
  36. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. J Org Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
  37. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry. Rotary evaporation to remove solvent. JoVE. , (2023).
  38. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry II. Infrared spectroscopy. JoVE. , (2024).
  39. JoVE. science education database - Organic chemistry. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. JoVE. , (2023).
  40. Kim, J. Sample preparation for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Mass Spec Lett. 6, 27-30 (2015).
  41. Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353 (2019).
  42. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  43. Yu, M., Wu, J., Shi, J., Farokhzad, O. C. Nanotechnology for protein delivery: Overview and perspectives. J Control Release. 240, 24-37 (2016).
  44. Zhang, Y., Zhang, D., Wang, J. T., Zhang, X., Yang, Y. Fabrication of stimuli-responsive nanogels for protein encapsulation and traceless release without introducing organic solvents, surfactants, or small-molecule cross-linkers. Poly Chem. 12 (4), 554-563 (2021).
  45. Kamaly, N., et al. Targeted interleukin-10 nanotherapeutics developed with a microfluidic chip enhance resolution of inflammation in advanced atherosclerosis. ACS Nano. 10 (5), 5280-5292 (2016).
  46. Lu, R., et al. Probing the secondary structure of bovine serum albumin during heat-induced denaturation using mid-infrared fiberoptic sensors. Analyst. 140 (3), 765-770 (2015).
  47. Abrosimova, K. V., Shulenina, O. V., Paston, S. V. FTIR study of secondary structure of bovine serum albumin and ovalbumin. J Phys: Conf Ser. 769, 012016 (2016).
  48. Kabanov, A. V., Vinogradov, S. V. Nanogels as pharmaceutical carriers: Finite networks of infinite capabilities. Ang Chem Int Ed Eng. 48 (30), 5418-5429 (2009).
  49. Li, C., Obireddy, S. R., Lai, W. F. Preparation and use of nanogels as carriers of drugs. Drug Del. 28 (1), 1594-1602 (2021).
  50. Kulkarni, J. A., et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 16 (6), 630-643 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved