Sintesi di nanogel responsivi agli stimoli mediante reticolazione acquosa in un solo passaggio e co-nanopolimerizzazione

Riepilogo

I nanogel sono un'eccellente e versatile piattaforma di nanoparticelle per la somministrazione di farmaci biologici. I nano-gel polimerici a base di poli(etilene) glicole responsivi agli stimoli, in grado di incapsulare carichi utili basati su proteine, sono stati sintetizzati utilizzando una strategia di co-nanopolimerizzazione cross-linking in un'unica fase in condizioni acquose. La fabbricazione e la caratterizzazione ottimali di queste nuove nanoparticelle sono presentate qui.

Abstract

I nanogel costituiti da nanoparticelle polimeriche reticolate sono stati sviluppati per la somministrazione di numerose terapie chimiche e biologiche, grazie alla loro versatile sintesi dal basso verso l'alto e alla biocompatibilità. Mentre fino ad oggi sono stati impiegati vari metodi per la sintesi di nanogel, pochissimi l'hanno raggiunta senza l'uso di solventi organici aggressivi o alte temperature che possono danneggiare l'integrità del carico biologico. Al contrario, la metodologia qui presentata realizza la sintesi di nanogel caricati con proteine di dimensioni inferiori a 100 nm utilizzando condizioni di reazione blande. Qui, presentiamo un metodo per l'incapsulamento non covalente di carichi utili basati su proteine all'interno di nano-gel che sono stati sintetizzati utilizzando una tecnica di copolimerizzazione reticolante a base acquosa, a passaggio singolo. In questa tecnica, inizialmente leghiamo elettrostaticamente un carico utile basato su proteine a un monomero cationico di ammonio quaternario e contemporaneamente lo reticoliamo e lo copolimerizziamo utilizzando persolfato di ammonio e N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina per formare nanogel che intrappolano il carico utile proteico. La dimensione e l'indice di polidispersione dei nanogel sono determinati utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS), mentre la morfologia della superficie è valutata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La massa di proteina intrappolata all'interno dei nanogel viene determinata calcolando l'efficienza di incapsulamento. Inoltre, la capacità di rilascio controllato dei nanogel attraverso la graduale degradazione di elementi strutturali redento-reattivi viene valutata anche nei saggi di bioriduzione. Forniamo esempi di dati di ottimizzazione delle nanoparticelle per dimostrare tutti gli avvertimenti della sintesi e della caratterizzazione dei nanogel utilizzando questa tecnica. In generale, sono stati ottenuti nanogel di dimensioni uniformi con una dimensione media di 57 nm e un valore dell'indice di polidispersione di 0,093. È stata raggiunta un'elevata efficienza di incapsulamento del 76%. Inoltre, i nanogel hanno mostrato un rilascio controllato fino all'86% della proteina incapsulata mediante degradazione graduale di nuovi componenti redentori in presenza di glutatione nell'arco di 48 ore.

Introduzione

I nanogel sono idrogel tridimensionali, di dimensioni inferiori al micron, con strutture di rete polimerica reticolata che possono trattenere grandi quantità di fluidi all'interno del loro guscio centrale senza comprometterne l'integrità morfologica¹. In generale, i nanogel sono sintetizzati mediante polimerizzazione di monomeri funzionali tramite reticolazione fisica o chimica in sistemi colloidali eterogenei, come le microemulsioni inverse acqua-in-olio ^2,3. I copolimeri anfifilici possono auto-assemblarsi in strutture su scala nanometrica in ambienti....

Protocollo

1. Sintesi di reticolante reattivo alla redox

1. Aggiungere il cloridrato di 2-amminoetilmetacrilato (44,79 mg, 0,270 mmol) e 0,063 mL di trietilammina a 3 mL di diclorometano anidro e lasciare miscelare per 20 minuti sotto un gas inerte N₂ in un pallone a fondo tondo da 25 mL.
2. Sciogliere 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-ditiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl estere (100 mg, 0,045 mmol) in 1 mL di diclorometano anidro e aggiungere al pallone.
3. Aggiungere 4 ml di diclorometano anidro al pallone. Avvolgere il pallone di reazione in u....

Risultati

Sintesi e caratterizzazione di reticolante di poli(etilenglicole) (PEG) disolfuro diacrilato Il reticolante redox reattivo è stato sintetizzato mediante la sostituzione nucleofila di un estere N-idrossisuccinimide (NHS) con il 2-amminoetilmetacrilato attraverso la formazione di un legame ammidico (Figura 1). La sintesi del prodotto richiesto è stata validata principalmente mediante ¹H NMR (Figura Supplementare 1.......

Discussione

La crescente domanda di farmaci biologici specifici per l'industria biofarmaceutica ha determinato la necessità di tecnologie in grado di migliorare i profili farmacologici in vivo, prevenendone la rapida degradazione fisiologica e compensando eventuali effetti collaterali indesiderati. Con questo in mente, viene descritta una procedura semplice per la sintesi di nanogel caricati con proteine. Come indicato nel protocollo, il reticolante redento-reattivo deve essere sintetizzat.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2-( acryloyloxy)ethyl]trimethylammonium chloride solution	Sigma Aldrich	496146
2-aminoethyl methacrylatehydrochloride	Sigma Aldrich	516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41, 44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl ester	Sigma Aldrich	671630
Acrylamide	Sigma Aldrich	23701
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	248614
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	B6917
Cy7- labelled bovine serum albumin	Nanocs	BS1-S7-1
Deuterated dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	547239
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270997 (anhydrous) and D65100
Glutathione	Sigma Aldrich	G4251
Methanol	Sigma Aldrich	34860
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine	Sigma Aldrich	411019
Phosphate buffered saline	ThermoFisher	10010023
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	436143
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283
Uranyl Acetate	Agar Scientific	AGR1260A
Equipment necessary for nanogel synthesis and characterisation
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter units (100kDa MWCO)	Merck Millipore	C7715
Camera	Olympus	Veleta
Carbon-coated copper grids	Agar Scientific	AGS160
Dialysis tubing (100kDa MWCO)	Spectrum labs	11405949
Dynamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano Ultra
Freeze dryer	Labconco	WZ-03336-01
Infrared spectroscopy	Agilent	Cary 630 FTIR
iTEM software	Olympus
Mass spectrometry	Waters	Micromass MALDI microMX MALDI Q-ToF
MF-MilliporeTM membrane filter (0.45/0.2μm pore size)	Merck Millipore, UK	HAWP04700, GSWP04700
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Plate reader	Beckman	Coulter-PARADIGM
Proton and Carbon-13 nuclear magnetic resonance data	Bruker	400MHz AV-400 NMR spectrometer
Rotary evaporator	Buchi	R-114 Rotary Vap System
Single-use needles	Sterican	4665643
Suba-Seal septa	Sigma Aldrich	Z124575
Transmission electron microscopy	Phillips	CM 100 TEM
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	Nanodrop One/One C microvolume