في الجسم الحي تصوير لقياس ورم خبيث في الرئة التلقائي لخلايا ورم الثدي المحقونة تقويم العظام

Summary

تصف المخطوطة منهجية لإنشاء ومراقبة النمو الطولي للورم الخبيث الرئوي التلقائي من أورام الثدي المحقونة تقويم العظام ، والتي يمكن التدخل في جميع مراحل الشلال النقيلي.

Abstract

لا يزال ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان. يوفر تعاقب الأحداث التي تميز الشلال النقيلي فرصا متعددة للتدخل العلاجي ، والقدرة على نمذجتها بدقة في الفئران أمر بالغ الأهمية لتقييم آثارها. هنا ، يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لإنشاء أورام الثدي الأولية لتقويم العظام والمراقبة اللاحقة لتأسيس ونمو الآفات النقيلية في الرئة باستخدام التصوير الحيوي في الجسم الحي . تسمح هذه المنهجية بتقييم العلاج أو آثاره البيولوجية على طول النطاق الكامل للتطور النقيلي ، من هروب الورم الأولي إلى النمو في الرئتين. يتم إنشاء أورام تقويم الثدي في الفئران عن طريق حقن معلق الخلية المسمى لوسيفيراز في الغدة الثديية الرابعة. يسمح للأورام بالنمو والانتشار لفترة زمنية محددة ثم يتم استئصالها جراحيا. عند الاستئصال ، يتم الكشف عن ورم خبيث في الرئة تلقائيا ، ويتم مراقبة النمو بمرور الوقت باستخدام التصوير الحيوي في الجسم الحي . في نقطة النهاية التجريبية المرغوبة ، يمكن جمع أنسجة الرئة لتحليلها في اتجاه مجرى النهر. يعد علاج ورم خبيث راسخ وواضحا سريريا أمرا بالغ الأهمية لتحسين النتائج لمرضى السرطان في المرحلة الرابعة ، ويمكن تقييمه من خلال نماذج وريد الذيل لرم خبيث الرئة التجريبي. ومع ذلك ، يحدث الانتشار النقيلي في وقت مبكر من سرطان الثدي ، ويعاني العديد من المرضى من مرض منتشر كامن تحت السريري بعد الجراحة. يوفر استخدام النماذج العفوية مثل هذا الفرصة لدراسة الطيف الكامل للمرض ، وخاصة التأثيرات الجهازية التي يقودها علاج الورم الأولي مثل التحضير المتخصص قبل النقيلي ، وتقييم العلاجات على الأمراض الخاملة وتحت الإكلينيكية بعد الجراحة.

Introduction

لا يزال ورم خبيث - انتشار الخلايا السرطانية من الورم الأولي إلى أجزاء أخرى من الجسم - سبب الوفاة في أكثر من 90٪ من مرضى السرطان. هذه العملية معقدة ، وتشمل هجرة الخلايا السرطانية من الورم الأساسي والتشفير إلى الدورة الدموية ، والبقاء في الدم ، والتسرب والبقاء على قيد الحياة في العضو المستهدف ، وإعادة تثبيت حالة التكاثر ، والنمو¹. تم استخدام نماذج سرطان الفئران العفوية والقابلة للزرع للتحقيق في المراحل المبكرة أو المتأخرة من ورم خبيث ، ويقدم كل منها مزاياه وعيوبه ، والتي تمت مناقشتها^{بدقة 2،3،4}.

على عكس ما كان يعتقد سابقا ، تتخلى الخلايا السرطانية عن الورم الأساسي في المراحل المبكرة أثناء تطور الورم ، وتظل أحيانا نائمة في الأنسجة البعيدة لفترات طويلة من الزمن^5،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أدلة متزايدة على التأثيرات الجهازية القوية للورم الأساسي على نتائج المرض ، والتي غالبا ما تتجلى من خلال إفراز العوامل القابلة للذوبان والإكسوسومات التي تحدد التربة النقيلية أو تحفز هزال العضلات أثناء دنف^{9،10،11،12}. لهذه الأسباب ، أصبحت نمذجة طول العملية النقيلية في الوجود الأولي للورم الأولي ضرورية لتحقيق فهم أكثر اكتمالا للبيولوجيا التي تقود هذه العمليات واختبار التدخلات الجديدة المحتملة التي تهدف إلى تعطيل العملية أو تأخيرها.

في هذا العمل ، تم وصف بروتوكول لقياس ورم خبيث في الرئة ينشأ تلقائيا من خطوط الخلايا التي يمكن تتبعها والتي يتم حقنها تقويم العظام في الغدة الثديية ، وهي عملية تصمم جميع الخطوات المذكورة أعلاه في الشلال النقيلي. من المعروف أن النماذج القابلة للزرع من ورم خبيث أكثر تمثيلا للورم الخبيث البشري مقارنة بنماذج السرطان العفوية التي تحركها وراثيا ، وبالتالي تحسين قابلية الترجمة^{السريرية 2}. علاوة على ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول التصوير الحيوي لدراسة نمو وتطور ورم خبيث في الرئة التلقائي من أورام الثدي الأولية في الوقت الفعلي داخل الحية ، وبالتالي تحسين الكفاءة مقارنة بالتقييمات التقليدية القائمة على الأنسجة للانتشار النقيلي. يتضمن هذا البروتوكول أيضا تقييم ورم خبيث تلقائي بعد الاستئصال الجراحي للورم الأولي ، وهو أمر مهم سريريا ويسمح للباحثين بدراسة تأثير الحد الأدنى من المرض المتبقي على العملية النقيلية. أخيرا ، يمنح استخدام الفئران ذات الكفاءة المناعية ميزة السماح لجهاز مناعي سليم بتشكيل العملية النقيلية ، كما هو الحال في علم الأحياء البشري^10،11.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات والبروتوكولات الحيوانية الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها بجامعة فرجينيا كومنولث.

1. تحضير الخلايا للحقن

1. قم بإذابة خلايا EO771 المنقولة باللوسيفيراز¹³ من تخزين النيتروجين السائل ولوحة 1 × 10⁶ خلايا في طبق زراعة أنسجة 10 سم في وسط زراعة الخلايا الكامل (RPMI1640 + 10٪ FBS + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين + 1٪ أمفوتريسين ب).
2. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى 80٪ -90٪ ملتقى ، مع تغييرات متوسطة كل 2-3 أيام حسب الضرورة.
3. لحصاد الخلايا ، قم بشفط وسط زراعة الخلايا وغسله باستخدام 1x PBS. احتضن ب 2 مل من محلول Trypsin-EDTA 0.25٪ لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا ثم تغسل ب 8 مل من الوسط الكامل لإخماد التفاعل.
   ملاحظة: سيؤدي التعرض المطول للخلايا للتربسين إلى تجريد بروتينات سطح الخلية من الغشاء ، وفي النهاية يتسبب في موت الخلايا.
4. انقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 10 مل وقم بتكسير الخلايا عن طريق الدوران عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من 1x PBS.
5. اجمع عينة سعة 50 ميكرولتر للعد ثم أعد تكوير الخلايا عن طريق الدوران عند 350 × جم لمدة 5 دقائق.
   1. أثناء الطرد المركزي للخلايا ، أضف 50 ميكرولتر من التريبان الأزرق إلى عينة 50 ميكرولتر واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم. ستستبعد الخلايا القابلة للحياة ذات أغشية الخلايا السليمة الصبغة وتبقى صافية بعد إضافة التريبان الأزرق ، بينما تسمح الخلايا المحتضرة / الميتة للصبغة بدخول السيتوبلازم وتتحول إلى اللون الأزرق.
   2. حدد الحجم المطلوب لإعادة تعليق الخلايا عند 6 × 10⁶ خلايا قابلة للحياة / مل (تركيز الخلية القابلة للحياة [خلايا قابلة للحياة / مل]) باستخدام الصيغة التالية:
      متوسط عدد الخلايا القابلة للحياة في 4 مجموعات من 16 مربعا × عامل التخفيف × 1 × 10⁴ خلايا / مل
6. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1x PBS معقم بالحجم المحسوب اللازم لتخفيف الخلايا إلى 6 × 10⁶ خلايا / مل. انقل معلق الخلية إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل واحتفظ بها على الثلج حتى تصبح جاهزة للحقن.

2. حقن وسادة الدهون الثديية

ملاحظة: يمكن استخدام البروتوكول الحالي مع أي سلالة من الفأر ، ولكن نظرا لاهتمامنا بالبيئة المكروية المناعية ، فإننا نستخدم الفئران C57BL6. عادة ما تستخدم إناث الفئران البكر التي تتراوح أعمارها بين 6 و 8 أسابيع لدراسات سرطان الثدي ، حيث يعزز التكافؤ عمليات تكوين الأورام.

1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي المخفضة بعامل النمو على الجليد واحتفظ بها على الثلج حتى تصبح جاهزة للحقن.
2. تخدير الفئران في غرفة الحث باستخدام 4٪ -5٪ إيزوفلوران. تأكد من مستوى تخدير كاف عن طريق تقييم عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم وخفض الغاز إلى 2٪ من الأيزوفلوران للصيانة أثناء العملية.
   تنبيه: الأيزوفلوران هو مخدر استنشاق عديم الرائحة وهو مهيج معروف للعينين والجلد وسام للجهاز العصبي المركزي. يجب استخدامه في بيئة ذات تهوية كافية. قد يكون للتعرض طويل الأمد أو المزمن للإيزوفلوران آثار صحية ضارة. يجب استخدام معدات التخدير البيطري التي تمت معايرتها بشكل صحيح ، وتستخدم أنظمة تنظيف الغاز ، ويتم صيانتها بشكل متكرر من قبل الطاقم البيطري.
3. احلق الشعر على بطن الفأر باستخدام المقص الكهربائي ثم ضعه في وضع ضعيف في مخروط أنف متصل بآلة التخدير باستخدام معدل إيزوفلوران للصيانة بنسبة 2٪. ضع مرهم العين على كل عين من عين لمنع إصابة القرنية.
4. فرك منطقة البطن جراحيا ثلاث مرات بحركة دائرية باستخدام جولات متناوبة من 70٪ من الإيثانول ومحلول بوفيدون اليود. تأكد من مستوى تخدير كاف من خلال تقييم عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
5. باستخدام المقص ، قم بعمل شق صغير في خط الوسط (عادة ~ 1 سم) عبر جلد البطن على مستوى الأنسجة الثديية الرابعة ، مما يعرض البريتونيوم الأساسي ولكن لا يخترقه.
   ملاحظة: يمكن استخدام إجراءات أخرى لزرع الخلايا السرطانية في الغدة الثديية ، مثل الحقن تحت الجلد أو التلقيح داخل القناة. على الرغم من أن هذا الإجراء الجراحي غازي إلى حد ما ، إلا أنه سهل التعلم والإتقان ، كما أن تصور وسادة الدهون يحسن الدقة بشكل كبير ، مع القليل من خطر الحقن خارج الغدة الثديية ، وهو أمر بالغ الأهمية للإزالة الفعالة اللاحقة للورم.
6. باستخدام الملقط ، امسك الجلد بعيدا عن الصفاق. استخدم مسحات قطنية معقمة مغموسة بالمحلول الملحي لفصل الجلد بعيدا عن الصفاق ، وتحرك بشكل جانبي لكشف وسادة دهون الثدي اليمنى. كرر على الجانب الأيسر لفضح وسادة الدهون الثديية اليسرى.
7. أعد تعليق معلق الخلية EO771 باستخدام ماصة يدوية وانقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. أضف حجما متساويا من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي واخلطه جيدا ، مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات ، والحفاظ على الجليد. سيحتوي معلق الخلية النهائي الآن على 150.000 خلية لكل 50 ميكرولتر.
8. ارسم 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة أنسولين 28G 0.5 مل U-100 واستمر في وضع الثلج.
9. باستخدام الملقط ، ارفعي الجلد وامسكي بلطف وكشف ضمادة دهون الثدي اليمنى. حقن 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في وسادة الدهون الثديية وانتظر لمدة 3-5 ثوان قبل إزالة المحقنة من وسادة الدهون الثديية للسماح للمصفوفة بالبدء في التصلب وتقليل فرصة ارتداد تعليق الخلية عبر موقع الحقن. سوف تتشكل فقاعة صغيرة بنهاية الحقن.
10. حرر الجلد من الملقط ، مما يسمح لوسادة الدهون الثديية بالعودة بشكل طبيعي إلى وضعها الطبيعي. كرر الإجراء باستخدام وسادة الدهون الثديية اليسرى ، مع وضع المحقنة التي تحتوي على تعليق الخلية مرة أخرى على الجليد بين الحقن.
11. أغلق شق الجلد ، ووضع دبابيس الجلد. سيحدد طول الشق عدد دبابيس الجلد المطلوبة ، حيث تتطلب معظم الإجراءات دبابيس واحدة إلى اثنتين لكل شق. تأكد من وجود مسافة لا تقل عن 0.5 سم بين الدبابيس.
12. عند الإغلاق الجراحي ، انقل الماوس إلى قفص انتعاش نظيف. راقب حسب الحاجة حتى يحق نفسه ويستأنف السلوك الطبيعي. يجب تطبيق 40 ميكرولتر من ميلوكسيكام (2 ملغ/مل) تحت الجلد للسيطرة على الألم كل 24 ساعة لمدة 3 أيام. بدلا من ذلك ، يمكن إعطاء جرعة تركيبة بطيئة الإطلاق من مادة أفيونية مثل البوبرينورفين في وقت الإجراء ، والتي ستستمر لمدة 72 ساعة.
13. راقب يوميا خلال الأيام الخمسة الأولى بعد العملية ، وقم بتقييم وزن وأي علامات للضيق ، مثل الفراء غير المحفوظ ، والظهر المنحني ، وإفرازات الأنف أو العين ذات اللون البني المحمر.
14. افحص بحثا عن علامات عدوى الجرح ، مثل حمامي موقع الجراحة أو النخر وحراسة موقع الشق ، والتضحية بالحيوانات التي تفقد >20٪ من وزنها الأولي أو التي تستوفي معايير الضيق الشديد ، كما هو موضح في إرشادات IACUC الخاصة بالمؤسسة.

3. استئصال الورم

1. استخدم الفرجار لمراقبة نمو آفة ورم الثدي التقويمي 3 مرات في الأسبوع عن طريق أخذ قياسات طول الورم الأساسي (L) وعرضه (W). احسب حجم الورم باستخدام الصيغة:
   πLW²/6
   1. تحديد استئصال الورم تجريبيا اعتمادا على خط الخلية المحدد الذي يتم حقنه. قم دائما بإزالة الأورام بأصغر حجم ممكن لتقليل فرص إعادة النمو. بالنسبة لخلايا EO771 الموضحة في هذا البروتوكول ، قم بإجراء استئصال الورم عندما يصل حجم الأورام إلى 150 مم³ .
      ملاحظة: يجب تحديد الوقت الأمثل للاستئصال لخطوط الخلايا الفردية ، ولكن 150 مم³ هي نقطة انطلاق جيدة ، حيث يمكن للإجراء استئصال كل الورم بكفاءة بمجرد تجربة المستخدم.
2. قم بتخدير الفئران في غرفة الحث باستخدام 4٪ إيزوفلوران. قم بإعطاء 40 ميكرولتر من الميلوكسيكام (2 مجم / مل) تحت الجلد للسيطرة على الألم ، ثم ضع الفأر في وضع ضعيف في مخروط أنف متصل بآلة التخدير باستخدام معدل إيزوفلوران للصيانة بنسبة 2٪. ضع مرهم العين على كل عين من عين لمنع إصابة القرنية.
   ملاحظة: يجب إعطاء المسكن كل 24 ساعة لمدة 3 أيام. بدلا من ذلك ، يمكن إعطاء جرعة تركيبة بطيئة الإطلاق من مادة أفيونية مثل البوبرينورفين في وقت الإجراء ، والتي ستستمر لمدة 72 ساعة.
3. قم بإزالة الدبابيس الجراحية السابقة ، إذا لزم الأمر ، وفرك منطقة البطن جراحيا ثلاث مرات بحركة دائرية باستخدام جولات متناوبة من 70٪ من الإيثانول ومحلول بوفيدون اليود. تأكد من مستوى تخدير كاف من خلال تقييم عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. باستخدام المقص ، قم بعمل شق صغير في خط الوسط (عادة ~ 1 سم) عبر جلد البطن على مستوى الأنسجة الثديية الرابعة ، مما يعرض البريتونيوم الأساسي ولكن لا يخترقه.
4. استخدم تشريحا غير حاد لفصل الورم التقويمي عن الصفاق والجلد المغطى. قم بإزالة الورم التقويمي عن طريق قطع الأنسجة الثديية الطبيعية الموجودة بالقرب من الورم وبعده باستخدام المقص وتخلص من أنسجة الورم في كيس بيولوجي. كرر مع الورم المقابل. في حالة حدوث نزيف ، قم بكي الأوعية الدموية بسرعة.
   ملاحظة: إذا تسللت أورام تقويم العظام إلى الصفاق ، كما يتضح من ورم غير مقيد جيدا أو يمكن فصله بسهولة عن الصفاق عن طريق التشريح الحاد ، فيجب التضحية بالحيوانات ، لأن إزالة الورم لن تكتمل ، وسوف ينمو مرة أخرى ، مما يؤدي إلى الخلط بين إشارة التلألؤ البيولوجي في الخلفية والمراضة.
5. استخدم دبابيس واحدة إلى ثلاث دبابيس لإغلاق موقع الجراحة ونقل الفأر إلى قفص نقاهة نظيف مع وسادة تسخين دافئة تحتها لتحسين تعافي بعد إجراء استئصال الورم. راقب حسب الحاجة حتى يحق نفسه ويستأنف السلوك الطبيعي.
   1. بالنسبة للحيوانات التي فقدت بعض الدم أثناء العملية، يجب إعطاء حقنة 300 ميكرولتر من محلول ملحي طبيعي معقم 0.9٪ يتم إعطاؤه داخل الصفاق بعد إغلاق موقع الجراحة.
   2. إذا لزم الأمر ، قم بتصوير في هذه المرحلة للحصول على إشارة التلألؤ البيولوجي ، كما هو موضح في الخطوة 4 ، لتقييم اكتمال استئصال الورم والحد الأدنى من المرض المتبقي في خط الأساس. إذا كان الاستئصال غير مكتمل وكانت هناك إشارة تلألؤ بيولوجي متبقية في منطقة الورم الأولية ، فقم بالتضحية بالحيوان بشكل إنساني ، لأن نمو الخلايا السرطانية المتبقية قد يؤدي إلى إرباك إشارة التلألؤ البيولوجي في الخلفية.
6. راقب يوميا خلال أول 5 أيام بعد العملية ، وقم بتقييم وزن وأي علامات للضيق ، مثل الفراء غير المحفوظ ، والظهر المنحني ، وإفرازات الأنف أو العين ذات اللون البني المحمر.
7. افحص بحثا عن علامات عدوى الجرح ، مثل حمامي الموقع الجراحي أو النخر وحراسة موقع الشق. التضحية الإنسانية بالحيوانات التي تفقد >20٪ من وزن الجسم الأولي أو التي تستوفي معايير الضائقة الشديدة ، كما هو موضح في إرشادات IACUC الخاصة بالمؤسسة.

4. في الجسم الحي القياس الكمي للورم الخبيث التلقائي في الرئة

1. إجراء التصوير في الجسم الحي للحيوانات في يوم استئصال الورم لإنشاء إشارة أساسية ، ثم 2-3 مرات / أسبوع بعد ذلك لتقييم نمو آفات ورم الرئة النقيلي التلقائي.
2. انقر فوق تهيئة لبدء تشغيل أداة التصوير للإحماء أثناء استعداد للإجراء.
3. قم بتخدير الفئران في غرفة الحث باستخدام 4٪ من الأيزوفلوران وتأكد من مستوى التخدير الكافي من خلال تقييم عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. تأكد من تدفق تخدير الأكسجين والأيزوفلوران إلى جهاز التصوير.
4. حقن ب 100 ميكرولتر من محلول D-luciferin (15 مجم / مل في PBS المعقم) باستخدام حقن مداري رجعي عن طريق إدخال الإبرة في القناة الإنسية للعين بزاوية 45 درجة من الأنف. أدخل الإبرة حتى تشعر بالمقاومة العظمية ، وعند هذه النقطة اسحب الإبرة بمقدار ~ 1 مم قبل حقن محلول D-luciferin لضمان وضع الإبرة داخل الجيوب الأنفية الوريدية خلف الحجاج.
   ملاحظة: يمكن توصيل محلول D-luciferin بطرق أخرى ، مثل الحقن داخل الصفاق أو تحت الجلد ، ومع ذلك ، فإن حركية استقلاب الركيزة ستكون أطول والتوزيع على أعضاء مختلفة غير متجانس.
5. تأكد من الحقن الناجح بسبب عدم وجود تدفق خلفي لأي سائل عند الولادة وانتظر 2 دقيقة قبل التصوير. أثناء الانتظار ، انقل إلى مخاريط الأنف الموجودة داخل جهاز تصوير التلألؤ البيولوجي في وضع ضعيف وقلل الأيزوفلوران إلى معدل صيانة قدره 2٪.
6. قبل الحصول على صورة تلألؤ بيولوجي للحيوان ، تأكد من تحديد مربع الاختيار بجوار الصورة الفوتوغرافية للحصول على صورة للحيوان في نفس الوقت باستخدام التجميع المتوسط و f / stop 8. تأكد من تحديد خانة الاختيار بجوار التراكب لتراكب الصورة الفوتوغرافية مع صورة التلألؤ الحيوي. اضبط وقت التعرض على 1 دقيقة ، مع تجميع متوسط ، f / stop = 1 ، والتقط صورة بالنقر فوق اكتساب.
7. قم بقياس تدفق الفوتون على النحو التالي. قم بإنشاء عائد استثمار مربع باستخدام القائمة المنسدلة أدوات عائد الاستثمار لكل موضح في الصورة ، بالنقر فوق الزر Square ROI . أعد وضع عائد الاستثمار الذي تم إنشاؤه تلقائيا فوق صدر كل عن طريق النقر والسحب بالماوس.
8. انقر فوق الزر قياس عائد الاستثمار وتأكد من عرض البيانات كإشعاع (فوتونات / ثانية) وليس احتسابها ، بحيث يمكن مقارنة الصور التي تم الحصول عليها بأوقات تعرض مختلفة.

5. جمع أنسجة الرئة للتحليل النسيجي

ملاحظة: يمكن التضحية بالحيوانات كما هو موضح أدناه في أي نقطة زمنية تجريبية أو عندما تفي بمعايير التضحية الإنسانية ، وفقا لإرشادات IACUC الخاصة بالمؤسسة. في تجربتنا ، تصل الفئران إلى نقطة النهاية الإنسانية بعد حوالي 21-28 يوما من استئصال الأورام الأولية.

1. قم بتخدير الفئران في غرفة الحث باستخدام 4٪ من الأيزوفلوران وتأكد من مستوى التخدير الكافي من خلال تقييم عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. ثم قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
2. استخدم المقص لعمل شق في خط الوسط أسفل عملية الجفاف ، وقطع الجلد والعضلات والصفاق لكشف الجزء السفلي من التجويف الصدري ، حتى يصبح الحجاب الحاجز مرئيا. ثقب الحجاب الحاجز لانهيار الرئتين ثم قطع الحجاب الحاجز.
3. اقطع القفص الصدري على الجانب الأيمن والأيسر ثم استخدم hemostat للاستيلاء على عملية xyphoid وتحريك القفص الصدري بعيدا عن الطريق ، مما يؤدي إلى تعريض القلب والرئتين. قص الأذين الأيمن باستخدام المقص.
4. قم بتنقية ب 10 مل من PBS المثلج من خلال البطين الأيسر وقم بتقييم اكتمال التروية من خلال التأكد من أن السائل المتدفق من الأذين الأيمن يتحول إلى اللون الأصفر الباهت.
5. حدد القصبة الهوائية وأدخل حقنة إبرة 22G مع 3 مل من 4٪ بارافورمالدهيد ، مع تثبيتها بالتوازي مع القصبة الهوائية. قم بتوصيل المحلول بوتيرة بطيئة حتى تنتفخ الرئتان بالكامل. أمسك القصبة الهوائية بالملقط فوق الإبرة ، وقم بإزالة الإبرة ببطء لمنع التدفق العكسي.
   ملاحظة: قد يكون خيوط خياطة أسفل القصبة الهوائية قبل حقن المثبت ، متبوعا بربط الخيط حول القصبة الهوائية بعد الحقن ، خيارا آخر لمنع التدفق العكسي للمثبت.
6. استمر في إمساك القصبة الهوائية برفق ، وقصها بالمقص فوق الملقط ، وابدأ في رفع الأنسجة بعناية أثناء إزالة كل النسيج الضام. تشريح القلب بعيدا عن الرئتين.
7. ضع أنسجة الرئة في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS طوال الليل واحفظها في 4 درجات مئوية للتثبيت. نقل الأنسجة إلى PBS التي تحتوي على 0.05٪ أزيد الصوديوم للتخزين طويل الأجل أو المعالجة لمزيد من التحليل النسيجي ، حسب الحاجة.

النتائج

الحقن تقويم العظام لخطوط الخلايا السرطانية للفئران في وسادة الدهون الثديية 4 للفئران هو إجراء قابل للتكرار وموثوق به لإحداث أورام الفئران الأولية. باستخدام خط خلايا EO771 المنقول مع لوسيفيراز في الظروف الموضحة في هذا البروتوكول ، تصبح الأورام الأولية واضحة ويمكن قياسها ب...

Discussion

نظرا لأن الطبيعة المبكرة للانتشار النقيلي والآثار الجهازية للسرطان أصبحت معترف بها على نطاق واسع ، فإن الحاجة إلى نماذج يتم فيها أخذ هذين العاملين الحرمين في الاعتبار أمرا ضروريا. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بمراقبة الحد الأدنى من الأمراض المتبقية ونمو ورم خبيث في ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061