体内研究 影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

摘要

该手稿描述了一种建立和纵向生长监测原位注射乳腺肿瘤自发性肺转移的方法，适合在转移级联反应的所有阶段进行干预。

摘要

转移仍然是癌症相关死亡的主要原因。表征转移级联反应的连续事件为治疗干预提供了多种机会，在小鼠中准确建模它们的能力对于评估其效果至关重要。在这里，提出了一个循序渐进的方案，用于建立原位原发性乳腺肿瘤，并随后使用 体内 生物发光成像监测肺部转移病灶的建立和生长。该方法允许沿整个转移发展范围（从原发性肿瘤逃逸到肺部生长）评估治疗或其生物学效应。通过在第 4 乳腺中注射荧光素酶标记的细胞悬液，在小鼠中产生乳腺原位肿瘤。让肿瘤生长和播散特定时间，然后手术切除。切除后，检测到自发性肺转移，并使用 体内 生物发光成像监测随时间的生长。在所需的实验终点，可以收集肺组织用于下游分析。已确定的、临床上明显的转移的治疗对于改善 IV 期癌症患者的预后至关重要，并且可以通过实验性肺转移的尾静脉模型进行评估。然而，转移播散发生在乳腺癌的早期，许多患者在手术后有潜伏的亚临床播散性疾病。利用诸如此类的自发模型提供了研究疾病全谱的机会，尤其是由原发肿瘤治疗驱动的全身效应，例如转移前生态位启动，并评估手术后休眠和亚临床疾病的治疗。

引言

转移 - 癌细胞从原发肿瘤扩散到身体的其他部位 - 仍然是超过 90% 的癌症患者死亡的原因。这个过程很复杂，涉及肿瘤细胞从原发肿瘤中迁移并内渗到循环中，在血液中存活，在靶器官中外渗和存活，重新形成增殖状态，并生长¹。自发性和可移植小鼠癌模型已被用于研究转移的早期或晚期阶段，每种模型都有自己的优点和缺点，这些优点和缺点已经被彻底讨论过 ^2,3,4。

与以前认为的不同，肿瘤细胞在肿瘤发展的早期阶段会遗弃原发肿瘤，有时会在远处组织中保持休眠状态很长时间 5,6,7,8。此外，越来越多的证据表明原发性肿瘤对疾病预后具有很强的全身影响，通常表现为可溶性因子和外泌体的分泌，这些可溶性因子和外泌体在恶病质期间调节转移土壤或刺激肌肉萎缩 9,10,11,12。由于这些原因，在原发肿瘤的初始存在下对转移过程的长度进行建模对于更全面地了解驱动这些过程的生物学特性和测试旨在破坏或延迟该过程的潜在新干预措施变得至关重要。

在这项工作中，描述了一种用于量化从原位注射到乳腺中的可追溯细胞系自发产生的肺转移的方案，该过程模拟了转移级联反应中的所有上述步骤。与自发的、遗传驱动的癌症模型相比，已知的可移植转移模型更能代表人类转移，从而提高了临床可转化性²。此外，该方案利用生物发光成像在活体动物体内实时研究原发性乳腺肿瘤自发性肺转移的生长和进展，从而比更传统的基于组织学的转移传播评估提高效率。该方案还包括手术切除原发肿瘤后自发转移的评估，这既具有临床相关性，又允许研究人员研究微小残留病对转移过程的影响。最后，使用免疫功能正常的小鼠具有允许完整的免疫系统来塑造转移过程的优势，就像人类生物学中的情况一样^10,11。

研究方案

此处描述的所有动物程序和方案均已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 注射用细胞的制备

1. 从液氮储存中解冻荧光素酶转导的 EO771 细胞¹³ ，并在完全细胞培养基（RPMI1640 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素 + 1% 两性霉素 B）的 10 cm 组织培养皿中接种 1 x 10⁶ 个细胞。
2. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育，直至 80%-90% 汇合，必要时每 2-3 天更换一次培养基。
3. 要收获细胞，吸出细胞培养基并用 1x PBS 洗涤。在 37 °C 下与 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育约 2-3 分钟，直至细胞分离，然后用 8 mL 完全培养基洗涤以淬灭反应。
   注:细胞长时间暴露于胰蛋白酶将导致细胞表面蛋白从膜上剥离，并最终导致细胞死亡。
4. 将内容物转移到 10 mL 离心管中，并以 350 x g 的离心速度旋转 5 分钟，使细胞沉淀。吸出上清液并将细胞重悬于 10 mL 的 1x PBS 中。
5. 收集 50 μL 样品进行计数，然后以 350 x g 旋转 5 分钟重新沉淀细胞。
   1. 在细胞离心时，向 50 μL 样品中加入 50 μL 台盼蓝，并使用血细胞计数器计数活细胞的数量。细胞膜完整的活细胞会排除染料，并在添加台盼蓝后保持透明，而垂死/死亡的细胞会让染料进入细胞质并变成蓝色。
   2. 使用以下公式确定以 6 x 10⁶ 个活细胞/mL（活细胞浓度 [活细胞/mL]）重悬细胞所需的体积:
      稀释因子× 1 x 10^{4 个细胞}/mL 的 4 组 16 个方块中×活细胞的平均数量
6. 吸出上清液，并将细胞重悬于无菌 1x PBS 中，其体积为将细胞稀释至 6 x 10⁶ 个细胞/mL。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中，并保持在冰上直至准备好注射。

2. 乳腺脂肪垫注射

注意:本方案可用于任何小鼠品系，但鉴于我们对免疫微环境的兴趣，我们使用 C57BL6 小鼠。6-8 周龄的雌性处女小鼠通常用于乳腺癌研究，因为胎次增强了肿瘤发生过程。

1. 在冰上解冻降低生长因子的基底膜基质，并保持在冰上直至准备注射。
2. 使用 4%-5% 异氟醚在诱导室中麻醉小鼠。通过评估缺乏脚趾捏反射来确认足够的麻醉平面，并将气体降低至 2% 异氟醚，以便在手术过程中进行维护。
   注意:异氟醚是一种无味的吸入麻醉剂，已知对眼睛和皮肤有刺激性，对中枢神经系统有毒。应在通风良好的环境中使用。长期或长期接触异氟醚可能会对健康产生不利影响。应使用经过适当校准、利用气体清除系统并由兽医人员经常维护的兽医麻醉设备。
3. 使用电动剪刀剃掉小鼠腹部的毛发，然后以 2% 的维持异氟醚率将仰卧位放置在连接到麻醉机的鼻锥中。将眼药膏涂抹在动物的每一只眼睛上，以防止角膜损伤。
4. 使用 70% 乙醇和聚维酮碘溶液交替轮次，以圆周运动手术擦洗腹部区域 3 次。通过评估缺乏脚趾捏反射来确认足够的麻醉平面。
5. 用剪刀在第 4 乳组织水平的腹部皮肤上做一个小的中线切口（通常为 ~1 厘米），露出但不穿透下面的腹膜。
   注意:可以使用其他将肿瘤细胞植入乳腺的程序，例如皮下注射或导管内接种。虽然有些侵入性，但这种外科手术很容易学习和掌握，并且可视化脂肪垫可显着提高准确性，并且在乳腺外注射的风险很小，这对于随后有效切除肿瘤至关重要。
6. 使用镊子，使皮肤远离腹膜。使用无菌盐水蘸有棉签的棉签将皮肤与腹膜分开，横向移动以露出右侧的乳腺脂肪垫。在左侧重复以露出左侧乳腺脂肪垫。
7. 使用手动移液器重悬 EO771 细胞悬液，并将 100 μL 转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。加入等体积的基底膜基质溶液并充分混合，注意不要引入气泡，并保持在冰上。最终的细胞悬液现在每 50 μL 含有 150,000 个细胞。
8. 将 100 μL 细胞悬液吸入 28G 0.5 mL U-100 胰岛素注射器中，并保持在冰上。
9. 使用镊子提起皮肤，轻轻抓住并露出正确的乳房脂肪垫。将 50 μL 细胞悬液注射到乳腺脂肪垫中，等待 3-5 秒，然后再从乳腺脂肪垫中取出注射器，以使基质开始凝固并减少细胞悬液回流通过注射部位的机会。注射结束时会形成一个小气泡。
10. 从镊子中释放皮肤，让乳腺脂肪垫自然恢复到正常位置。用左乳腺脂肪垫重复该过程，在两次注射之间将含有细胞悬液的注射器放回冰上。
11. 闭合皮肤切口，使用皮肤钉。切口的长度将决定所需的皮肤钉数，大多数手术每个切口需要一到两个钉子。确保订书钉之间至少保持 0.5 厘米的距离。
12. 手术闭合后，将鼠标转移到干净的恢复笼中。根据需要进行监测，直到动物恢复正常行为。每 24 小时皮下注射 40 μL 美洛昔康 （2 mg/mL） 以控制疼痛，持续 3 天。或者，可以在手术时给予缓释制剂剂量的阿片类药物，如丁丙诺啡，这将持续 72 小时。
13. 术后前 5 天每天监测动物，评估动物的体重和任何痛苦迹象，例如未打理的皮毛、驼背和红棕色的鼻腔或眼部分泌物。
14. 检查动物是否有伤口感染的迹象，例如手术部位红斑或坏死以及切口部位的守卫，并人道地牺牲减轻初始体重 >20% 或符合严重痛苦标准的动物，如机构特定的 IACUC 指南所述。

3. 肿瘤切除

1. 通过测量原发性肿瘤长度 （L） 和宽度 （W），使用卡尺监测原位乳腺肿瘤病灶的生长 3 次/周。使用以下公式计算肿瘤体积:
   πLW²/6
   1. 根据注射的特定细胞系凭经验确定肿瘤切除。始终以尽可能小的大小切除肿瘤，以减少重新生长的机会。对于本协议中描述的 EO771 细胞，当肿瘤体积达到 150 mm³ 时进行肿瘤切除。
      注意:需要确定单个细胞系的最佳切除时间，但 150 mm³ 是一个很好的起点，因为一旦用户体验过，该程序就可以有效地切除所有肿瘤。
2. 使用 4% 异氟醚在诱导室中麻醉小鼠。皮下注射 40 μL 美洛昔康 （2 mg/mL） 以控制疼痛，然后将小鼠仰卧在连接到麻醉机的鼻锥中，维持异氟醚率为 2%。将眼药膏涂抹在动物的每一只眼睛上，以防止角膜损伤。
   注意:镇痛药需要每 24 小时给药一次，持续 3 天。或者，可以在手术时给予缓释制剂剂量的阿片类药物，如丁丙诺啡，这将持续 72 小时。
3. 如有必要，去除先前的手术钉，并使用 70% 乙醇和聚维酮碘溶液交替轮换，以圆周运动手术擦洗腹部区域 3 次。通过评估缺乏脚趾捏反射来确认足够的麻醉平面。用剪刀在第 4 乳组织水平的腹部皮肤上做一个小的中线切口（通常为 ~1 厘米），露出但不穿透下面的腹膜。
4. 使用钝性解剖将原位肿瘤与腹膜和上覆皮肤分开。用剪刀切开位于肿瘤近端和远端的正常乳腺组织，去除原位肿瘤，并将肿瘤组织丢弃到生物危害袋中。对对侧肿瘤重复此操作。如果发生出血，请迅速烧灼脉管系统。
   注意:如果原位肿瘤已浸润到腹膜中，由肿瘤不明确或容易通过钝性解剖与腹膜分离来证明，则应处死动物，因为肿瘤的切除不会完全完成，它会重新生长，导致背景生物发光信号和发病率的混淆。
5. 使用一到三个订书钉关闭手术部位，并将鼠标转移到干净的恢复笼中，下面有温暖的加热垫，以改善肿瘤切除手术后动物的恢复。根据需要进行监测，直到动物恢复正常行为。
   1. 对于在手术过程中失血的动物，在手术部位闭合后腹膜内注射 300 μL 无菌 0.9% 生理盐水。
   2. 如果需要，如步骤 4 中所述，此时对动物进行生物发光信号成像，以评估肿瘤切除的完整性和基线微小残留病。如果切除不完全并且在原发肿瘤区域仍有生物发光信号，请人道处死动物，因为剩余肿瘤细胞的生长可能导致背景生物发光信号的混淆。
6. 在手术后的前 5 天每天监测动物，评估动物的体重和任何痛苦的迹象，例如未打理的皮毛、驼背和红棕色的鼻腔或眼部分泌物。
7. 检查动物是否有伤口感染的迹象，例如手术部位红斑或坏死以及切口部位的守卫。人道地牺牲减轻初始体重 >20% 或符合严重痛苦标准的动物，如机构特定的 IACUC 指南所述。

4. 自发性肺转移的 体内 定量

1. 在肿瘤切除当天对动物进行 体内 成像以建立基线信号，然后此后每周 2-3 次以评估自发性转移性肺肿瘤病灶的生长。
2. 单击 Initialize 启动成像仪器进行预热，同时动物为该程序做好准备。
3. 使用 4% 异氟醚在诱导室中麻醉小鼠，并通过评估缺乏脚趾捏反射来确认足够的麻醉平面。确认氧气和异氟醚麻醉剂正在流向成像仪器。
4. 通过将针头与鼻子成 45° 角插入眼睛的内眦中，使用眼眶后注射向动物注射 100 μL D-荧光素溶液（15 mg/mL 在无菌 PBS 中）。插入针头直到感觉到骨阻力，此时将针头抽出 ~1 毫米，然后再注射 D-荧光素溶液，以确保针头放置在眶后静脉窦内。
   注意:D-荧光素溶液可以通过其他途径输送，例如腹膜内或皮下注射，但是，底物代谢的动力学会更长，并且分布到不同器官是异质的。
5. 通过交付时没有冲洗任何液体来确认注射成功，并等待 2 分钟后再成像。等待时，将动物以仰卧位转移到位于生物发光成像仪内部的鼻锥上，并将异氟醚降低至 2% 的维持率。
6. 在获取动物的生物发光图像之前，请确保选中 Photograph 旁边的复选框，以同时使用中等像素合并和 f/stop 8 获取动物的照片。确保选中 Overlay 旁边的复选框，以将照片与生物发光图像叠加。将曝光时间设置为 1 分钟，使用中等像素合并，f/stop = 1，然后单击 Acquire 捕获图像。
7. 按如下方式测量光子通量。使用 ROI 工具下拉菜单为图像中描述的每只动物创建方形 ROI，方法是单击 Square ROI 按钮。通过单击并拖动鼠标，将自动生成的 ROI 重新定位在每只动物的胸部上。
8. 单击 Measure ROIs（测量 ROI） 按钮，确保数据显示为辐射度 （photons/s） 而不是计数，以便可以比较以不同曝光时间采集的图像。

5. 收集肺组织进行组织学分析

注意:根据机构特定的 IACUC 指南，可以在任何实验时间点或当动物符合人道牺牲标准时，按如下所述处死动物。根据我们的经验，小鼠在切除原发肿瘤后约 21-28 天到达人道终点。

1. 使用 4% 异氟醚在诱导室中麻醉小鼠，并通过评估缺乏脚趾捏反射来确认足够的麻醉平面。然后，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
2. 用剪刀在剑突下方做一个中线切口，切开皮肤、肌肉组织和腹膜，露出胸腔的下部，直到看到横膈膜。刺穿横膈膜以使肺部塌陷，然后切开横膈膜。
3. 切开左右两侧的胸腔，然后用止血钳抓住剑突并将胸腔移开，露出心脏和肺。用剪刀剪断右心房。
4. 通过左心室用 10 mL 冰冷的 PBS 灌注动物，并通过确认从右心房流出的液体变得清澈并且肝脏变为淡黄色来评估灌注的完整性。
5. 识别气管并插入一个装有 22 mL 3% 多聚甲醛的 4G 针头注射器，使其与气管平行。以缓慢的速度输送溶液，直到肺部完全充气。用镊子将气管固定在针头上，然后慢慢取出针头以防止回流。
   注意:在注射固定剂之前将缝合线穿入气管下方，然后在注射后将缝合线系在气管周围，可能是防止固定剂回流的另一种选择。
6. 继续轻轻握住气管，用镊子上方的剪刀剪断，然后开始小心地提起组织，同时去除所有结缔组织。将心脏与肺部分开。
7. 将肺组织置于 PBS 中的 4% 多聚甲醛中过夜，并在 4 °C 下储存固定。将组织转移到含有 0.05% 叠氮化钠的 PBS 中，以便长期储存或根据需要进一步加工以进行组织学分析。

结果

将小鼠癌细胞系原位注射到小鼠的第 4 乳腺脂肪垫中是诱导小鼠原发性肿瘤的可重复且可靠的程序。在本方案描述的条件下利用用荧光素酶转导的 EO771 细胞系，原发性肿瘤变得可触及，并且可以在注射后约 7 天使用卡尺测量，并在初次注射后约 14 天达到约 150 mm³ 的体积（图 1）。也可以根据需要监测这些病变的生物发光生长。原发性肿瘤切...

讨论

随着转移播散的早期性质和癌症的全身影响得到更广泛的认识，需要考虑这两个关键因素的模型成为必要。该方案允许研究人员监测原发性乳腺肿瘤自发发生的微小残留病灶和肺转移的生长，解释影响转移过程的癌症的全身影响。原发性肿瘤切除对于实时评估肺转移生长是必要的，但它也具有临床意义，因为大多数患者在临床环境中接受肿瘤切除或乳房切除术。此外，这...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061