In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Resumen

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

Resumen

La metástasis sigue siendo la causa principal de muerte relacionada con el cáncer. La sucesión de eventos que caracterizan la cascada metastásica presenta múltiples oportunidades para la intervención terapéutica, y la capacidad de modelarlos con precisión en ratones es fundamental para evaluar sus efectos. En este trabajo se presenta un protocolo paso a paso para el establecimiento de tumores de mama primarios ortotópicos y el posterior seguimiento del establecimiento y crecimiento de lesiones metastásicas en pulmón mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo . Esta metodología permite evaluar el tratamiento o sus efectos biológicos a lo largo de todo el rango de desarrollo metastásico, desde el escape del tumor primario hasta el crecimiento en los pulmones. Los tumores ortotópicos de mama se generan en ratones mediante la inyección de una suspensión celular marcada con luciferasa en la 4ª glándula mamaria. Se permite que los tumores crezcan y se diseminen durante un período de tiempo específico y luego se resecan quirúrgicamente. Tras la resección, se detecta la metástasis pulmonar espontánea y el crecimiento a lo largo del tiempo se monitoriza mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo . En el criterio de valoración experimental deseado, se puede recolectar tejido pulmonar para su análisis posterior. El tratamiento de las metástasis establecidas y clínicamente evidentes es fundamental para mejorar los desenlaces de los pacientes de cáncer en estadio IV, y se puede evaluar mediante modelos de metástasis pulmonares experimentales en las venas de cola. Sin embargo, la diseminación metastásica ocurre temprano en el cáncer de mama, y muchas pacientes tienen enfermedad latente y subclínica diseminada después de la cirugía. La utilización de modelos espontáneos como este brinda la oportunidad de estudiar todo el espectro de la enfermedad, especialmente los efectos sistémicos impulsados por el tratamiento del tumor primario, como el cebado de nicho premetastásico, y evaluar los tratamientos sobre la enfermedad latente y subclínica después de la cirugía.

Introducción

La metástasis, la diseminación de las células cancerosas desde el tumor primario a otras partes del cuerpo, sigue siendo la causa de muerte en más del 90% de los pacientes con cáncer. Este proceso es complejo e implica la migración de las células tumorales fuera del tumor primario y la intravasación en la circulación, la supervivencia en la sangre, la extravasación y la supervivencia en el órgano diana, la reinstauración del estado proliferativo y el crecimiento¹. Para investigar estadios tempranos o tardíos de metástasis se han utilizado modelos de cáncer murino espontáneo y trasplantable, cada uno con sus propias ventajas y desventajas, que han sido ampliamente discutidas ^2,3,4.

A diferencia de lo que se pensaba anteriormente, las células tumorales abandonan el tumor primario en etapas tempranas durante el desarrollo del tumor, a veces permaneciendo latentes en tejidos distantes durante lo que pueden ser largos períodos de tiempo 5,6,7,8. Además, cada vez hay más evidencias de los fuertes efectos sistémicos que tiene el tumor primario en los resultados de la enfermedad, a menudo manifestados a través de la secreción de factores solubles y exosomas que condicionan el suelo metastásico o estimulan el desgaste muscular durante la caquexia 9,10,11,12. Por estas razones, modelar la duración del proceso metastásico en la presencia inicial del tumor primario se ha vuelto esencial para lograr una comprensión más completa de la biología que impulsa estos procesos y probar posibles nuevas intervenciones destinadas a interrumpir o retrasar el proceso.

En este trabajo se describe un protocolo para cuantificar las metástasis pulmonares que surgen espontáneamente a partir de líneas celulares trazables inyectadas ortotópicamente en la glándula mamaria, un proceso que modela todos los pasos anteriores en la cascada metastásica. Se sabe que los modelos trasplantables de metástasis son más representativos de la metástasis humana en comparación con los modelos de cáncer espontáneos impulsados genéticamente, lo que mejora la traducibilidad clínica². Además, este protocolo utiliza imágenes de bioluminiscencia para estudiar el crecimiento y la progresión de la metástasis pulmonar espontánea de tumores de mama primarios en tiempo real en animales vivos, mejorando así la eficiencia en comparación con las evaluaciones más tradicionales basadas en histología de la diseminación metastásica. Este protocolo también incluye la evaluación de la metástasis espontánea después de la extirpación quirúrgica del tumor primario, que es clínicamente relevante y permite a los investigadores estudiar el efecto de la enfermedad residual mínima en el proceso metastásico. Finalmente, el uso de ratones inmunocompetentes confiere la ventaja de permitir que un sistema inmune intacto dé forma al proceso metastásico, como es el caso de la biología humana^10,11.

Protocolo

Todos los procedimientos y protocolos para animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Commonwealth de Virginia.

1. Preparación de las células para la inyección

1. Descongele las células EO771 transducidas con luciferasa¹³ del almacenamiento de nitrógeno líquido y la placa 1 x 10⁶ células en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm en un medio de cultivo celular completo (RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina + 1% anfotericina B).
2. Incubar a 37 °C y 5% de CO₂ hasta 80%-90% confluente, con cambios de medio cada 2-3 días según sea necesario.
3. Para recolectar células, aspire el medio de cultivo celular y lave con 1x PBS. Incubar con 2 mL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% durante unos 2-3 min a 37 °C hasta que las células se desprendan y luego lavar con 8 mL de medio completo para apagar la reacción.
   NOTA: La exposición celular prolongada a la tripsina dará lugar a la eliminación de las proteínas de la superficie celular de la membrana y, en última instancia, causará la muerte celular.
4. Transfiera el contenido a un tubo de centrífuga de 10 mL y granule las celdas girando a 350 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de 1x PBS.
5. Recoja una muestra de 50 μL para contar y luego vuelva a pellet las células girando a 350 x g durante 5 min.
   1. Mientras las células se centrifugan, agregue 50 μL de azul de tripán a la muestra de 50 μL y cuente el número de células viables con un hematitómetro. Las células viables con membranas celulares intactas excluirán el tinte y permanecerán claras después de la adición de azul de tripano, mientras que las células moribundas/muertas permitirán que el tinte ingrese al citoplasma y se vuelva azul.
   2. Determine el volumen necesario para resuspender las células a 6 x 10⁶ células viables/mL (concentración de células viables [células viables/mL]) utilizando la siguiente fórmula:
      Número medio de células viables en los 4 conjuntos de 16 cuadrados × factor de dilución × 1 x 10⁴ células/ml
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1x PBS estéril en el volumen calculado necesario para diluir las células a 6 x 10⁶ células/mL. Transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y manténgala en hielo hasta que esté lista para la inyección.

2. Inyecciones de almohadillas de grasa mamaria

NOTA: El presente protocolo se puede utilizar con cualquier cepa de ratón, pero dado nuestro interés en el microambiente inmunitario, utilizamos ratones C57BL6. Las hembras de ratones vírgenes de 6-8 semanas de edad se utilizan normalmente para los estudios de cáncer de mama, ya que la paridad mejora los procesos de tumorigénesis.

1. Descongele la matriz de membrana basal reducida en factor de crecimiento en hielo y manténgala en hielo hasta que esté lista para la inyección.
2. Anestesiar ratones en una cámara de inducción con isoflurano al 4%-5%. Confirme un plano suficiente de anestesia evaluando la ausencia de reflejo de pinzamiento de los dedos del pie y baje el gas al 2% de isoflurano para el mantenimiento durante el procedimiento.
   PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico inhalado inodoro que es un irritante conocido para los ojos y la piel y tóxico para el sistema nervioso central. Debe utilizarse en un ambiente con una ventilación adecuada. La exposición prolongada o crónica al isoflurano puede tener efectos adversos para la salud. Se debe utilizar un equipo de anestesia veterinario que esté debidamente calibrado, que utilice sistemas de eliminación de gases y que sea mantenido con frecuencia por el personal veterinario.
3. Afeitar el vello del abdomen del ratón con una maquinilla eléctrica y luego colocarlo en posición supina en un cono de nariz conectado a una máquina de anestesia con una tasa de isoflurano de mantenimiento del 2%. Aplique ungüento oftálmico en cada ojo del animal para prevenir lesiones en la córnea.
4. Frote quirúrgicamente la región abdominal tres veces con movimientos circulares utilizando rondas alternas de etanol al 70% y solución de povidona yodada. Confirme un plano suficiente de anestesia evaluando la ausencia de reflejo de pellizco de los dedos de los pies.
5. Con unas tijeras, haga una pequeña incisión en la línea media (generalmente ~ 1 cm) a través de la piel abdominal a nivel del 4º tejido mamario, exponiendo pero no penetrando a través del peritoneo subyacente.
   NOTA: Se pueden utilizar otros procedimientos para la implantación de células tumorales en la glándula mamaria, como una inyección subcutánea o una inoculación intraductal. Si bien es algo invasivo, este procedimiento quirúrgico es fácil de aprender y dominar, y la visualización de la almohadilla de grasa mejora significativamente la precisión, con poco riesgo de inyección fuera de la glándula mamaria, que es fundamental para la posterior extirpación efectiva del tumor.
6. Con fórceps, mantenga la piel alejada del peritoneo. Use hisopos de algodón estériles humedecidos en solución salina para separar la piel del peritoneo, moviéndose lateralmente para exponer la almohadilla de grasa mamaria derecha. Repita en el lado izquierdo para exponer la almohadilla de grasa mamaria izquierda.
7. Vuelva a suspender la suspensión de celdas EO771 con una pipeta manual y transfiera 100 μL a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Agregue un volumen igual de solución de matriz de membrana basal y mezcle bien, teniendo cuidado de no introducir burbujas, y mantenga el hielo. La suspensión celular final ahora contendrá 150.000 celdas por 50 μL.
8. Extraiga 100 μL de suspensión celular en una jeringa de insulina U-100 de 0,5 mL de 28G y manténgala en hielo.
9. Con pinzas, levante la piel y agarre y exponga suavemente la almohadilla de grasa mamaria derecha. Inyecte 50 μL de suspensión celular en la almohadilla de grasa mamaria y espere de 3 a 5 segundos antes de retirar la jeringa de la almohadilla de grasa mamaria para permitir que la matriz comience a solidificarse y disminuya la posibilidad de que la suspensión celular refluya a través del sitio de inyección. Se formará una pequeña burbuja al final de la inyección.
10. Libere la piel de las pinzas, permitiendo que la almohadilla de grasa mamaria vuelva naturalmente a su posición normal. Repita el procedimiento con la almohadilla de grasa mamaria izquierda, colocando la jeringa que contiene la suspensión celular nuevamente en hielo entre inyecciones.
11. Cierre la incisión en la piel, aplicando grapas cutáneas. La longitud de la incisión determinará el número de grapas cutáneas necesarias, y la mayoría de los procedimientos requieren una o dos grapas por incisión. Asegúrese de que haya una distancia mínima de 0,5 cm entre las grapas.
12. Tras el cierre quirúrgico, transfiera el ratón a una jaula de recuperación limpia. Monitoree según sea necesario hasta que el animal se recupere y reanude su comportamiento normal. Administrar 40 μL de meloxicam (2 mg/mL) por vía subcutánea para el control del dolor cada 24 h durante 3 días. Alternativamente, se puede administrar una dosis de formulación de liberación lenta de un opioide como la buprenorfina en el momento del procedimiento, que durará 72 horas.
13. Monitoree a los animales diariamente durante los primeros 5 días después de la operación, evaluando el peso de los animales y cualquier signo de angustia, como pelaje descuidado, espalda encorvada y secreción nasal u ocular de color marrón rojizo.
14. Examinar a los animales en busca de signos de infección de la herida, como eritema o necrosis del sitio quirúrgico y protección del sitio de la incisión, y sacrificar de manera humanitaria a los animales que pierdan >20% de su peso corporal inicial o que cumplan con los criterios de sufrimiento grave, según lo descrito por las pautas de la IACUC específicas de la institución.

3. Resecciones tumorales

1. Use calibradores para monitorear el crecimiento de la lesión ortotópica del tumor de mama 3 veces por semana tomando medidas de la longitud (L) y el ancho (W) del tumor primario. Calcule el volumen del tumor usando la fórmula:
   πLW²/6
   1. Determinar empíricamente la resección tumoral en función de la línea celular específica inyectada. Siempre extirpe los tumores del tamaño más pequeño posible para reducir las posibilidades de que vuelvan a crecer. Para las células EO771 descritas en este protocolo, se debe realizar la resección tumoral cuando los tumores alcancen un volumen de 150^mm3 .
      NOTA: Es necesario determinar el momento óptimo de las resecciones para las líneas celulares individuales, pero 150^mm3 es un buen punto de partida, ya que el procedimiento puede extirpar todo el tumor de manera eficiente una vez que el usuario tiene experiencia.
2. Anestesiar a los ratones en una cámara de inducción con isoflurano al 4%. Administrar 40 μL de meloxicam (2 mg/mL) por vía subcutánea para el control del dolor y, a continuación, colocar al ratón en posición supina en un cono nasal conectado a una máquina de anestesia utilizando una tasa de isoflurano de mantenimiento del 2%. Aplique ungüento oftálmico en cada ojo del animal para prevenir lesiones en la córnea.
   NOTA: El analgésico debe administrarse cada 24 h durante 3 días. Alternativamente, se puede administrar una dosis de formulación de liberación lenta de un opioide como la buprenorfina en el momento del procedimiento, que durará 72 horas.
3. Retire las grapas quirúrgicas anteriores, si es necesario, y frote quirúrgicamente la región abdominal tres veces con movimientos circulares utilizando rondas alternas de etanol al 70% y solución de povidona yodada. Confirme un plano suficiente de anestesia evaluando la ausencia de reflejo de pellizco de los dedos de los pies. Con unas tijeras, haga una pequeña incisión en la línea media (generalmente ~ 1 cm) a través de la piel abdominal a nivel del 4º tejido mamario, exponiendo pero no penetrando a través del peritoneo subyacente.
4. Use una disección roma para separar el tumor ortotópico del peritoneo y la piel suprayacente. Extirpar el tumor ortotópico cortando el tejido mamario normal ubicado proximal y distalmente al tumor con unas tijeras y desechar el tejido tumoral en una bolsa de riesgo biológico. Repita con el tumor contralateral. Si se produce sangrado, cauterice rápidamente la vasculatura.
   NOTA: Si los tumores ortotópicos se han infiltrado en el peritoneo, evidenciado por un tumor que no está bien circunscrito o que no se puede separar fácilmente del peritoneo mediante disección roma, los animales deben ser sacrificados, ya que la extirpación del tumor no será completa y volverá a crecer, lo que lleva a confusión de la señal de bioluminiscencia de fondo y morbilidad.
5. Use de una a tres grapas para cerrar el sitio quirúrgico y transfiera al ratón a una jaula de recuperación limpia con una almohadilla térmica tibia debajo para mejorar la recuperación del animal después del procedimiento de resección del tumor. Monitoree según sea necesario hasta que el animal se recupere y reanude su comportamiento normal.
   1. Para los animales que hayan perdido algo de sangre durante el procedimiento, administrar una inyección de 300 μL de solución salina normal estéril al 0,9% administrada por vía intraperitoneal después del cierre del sitio quirúrgico.
   2. Si es necesario, tome imágenes de los animales en este punto para detectar la señal de bioluminiscencia, como se describe en el paso 4, para evaluar la integridad de la resección tumoral y la enfermedad residual mínima basal. Si la resección fue incompleta y queda una señal de bioluminiscencia en la región tumoral primaria, se sacrificará al animal de manera humanitaria, ya que el crecimiento de las células tumorales restantes puede resultar en confusión de la señal de bioluminiscencia de fondo.
6. Monitoree a los animales diariamente durante los primeros 5 días después de la operación, evaluando el peso de los animales y cualquier signo de angustia, como pelaje descuidado, espalda encorvada y secreción nasal u ocular de color marrón rojizo.
7. Examinar a los animales en busca de signos de infección de la herida, como eritema o necrosis en el sitio quirúrgico y proteger el sitio de la incisión. Sacrificar humanamente a los animales que pierdan el >20% de su peso corporal inicial o que cumplan con los criterios de sufrimiento severo, según lo descrito por las pautas específicas de la IACUC de la institución.

4. Cuantificación in vivo de metástasis pulmonares espontáneas

1. Realizar imágenes in vivo de los animales el día de la resección del tumor para establecer una señal basal, y luego 2-3 veces por semana a partir de entonces para evaluar el crecimiento de lesiones tumorales de pulmón metastásicas espontáneas.
2. Haga clic en Inicializar para iniciar el instrumento de imágenes para el calentamiento mientras los animales se preparan para el procedimiento.
3. Anestesiar a los ratones en una cámara de inducción con isoflurano al 4% y confirmar un plano suficiente de anestesia evaluando la ausencia de reflejo de pinzamiento de los dedos de los pies. Confirme que el oxígeno y la anestesia con isoflurano están fluyendo hacia el instrumento de imagen.
4. Inyectar a los animales 100 μl de solución de D-luciferina (15 mg/ml en PBS estéril) mediante una inyección retroorbital insertando la aguja en el canto medial del ojo en un ángulo de 45° con respecto a la nariz. Inserte la aguja hasta que se sienta la resistencia ósea, momento en el que retire la aguja ~ 1 mm antes de inyectar la solución de D-luciferina para asegurarse de que la aguja se coloque dentro del seno venoso retroorbitario.
   NOTA: La solución de D-luciferina puede administrarse por otras vías, como la inyección intraperitoneal o subcutánea, sin embargo, la cinética de metabolización del sustrato será más larga y la distribución a los diferentes órganos heterogénea.
5. Confirme el éxito de la inyección por la falta de enjuague de cualquier líquido en el momento de la entrega y espere 2 minutos antes de la toma de imágenes. Mientras espera, transfiera a los animales a los conos de la nariz ubicados dentro del generador de imágenes de bioluminiscencia en posición supina y disminuya el isoflurano a una tasa de mantenimiento del 2%.
6. Antes de adquirir una imagen de bioluminiscencia del animal, asegúrese de que la casilla de verificación situada junto a Fotografía esté marcada para adquirir simultáneamente una fotografía del animal utilizando el agrupamiento de medio y f/stop 8. Asegúrese de que la casilla de verificación junto a Superposición esté marcada para superponer la fotografía con la imagen de bioluminiscencia. Establezca el tiempo de exposición en 1 min, con agrupación media, f/stop = 1, y capture una imagen haciendo clic en Adquirir.
7. Mida el flujo de fotones de la siguiente manera. Cree un ROI cuadrado utilizando el menú desplegable de herramientas de ROI para cada animal representado en la imagen, haciendo clic en el botón ROI cuadrado . Vuelva a colocar el ROI generado automáticamente sobre el tórax de cada animal haciendo clic y arrastrando con el ratón.
8. Haga clic en el botón Medir el retorno de la inversión y asegúrese de que los datos se muestren como radiación (fotones/s) y no como recuentos, de modo que se puedan comparar las imágenes adquiridas con diferentes tiempos de exposición.

5. Recolección de tejidos pulmonares para análisis histológico

NOTA: Los animales pueden ser sacrificados como se describe a continuación en cualquier momento experimental o cuando los animales cumplen con los criterios para el sacrificio humanitario, de acuerdo con las pautas específicas de la IACUC de la institución. En nuestra experiencia, los ratones alcanzan el criterio de valoración humanitario aproximadamente 21-28 días después de la resección de los tumores primarios.

1. Anestesiar a los ratones en una cámara de inducción con isoflurano al 4% y confirmar un plano suficiente de anestesia evaluando la ausencia de reflejo de pinzamiento de los dedos de los pies. Luego, sacrificar a los ratones por dislocación cervical.
2. Use tijeras para hacer una incisión en la línea media debajo de la apófisis xifoidea, cortando la piel, la musculatura y el peritoneo para exponer la parte inferior de la cavidad torácica, hasta que el diafragma sea visible. Perfore el diafragma para colapsar los pulmones y luego corte a través del diafragma.
3. Corte a través de la caja torácica en el lado derecho e izquierdo y luego use un hemostático para agarrar la apófisis xifoidea y mover la caja torácica fuera del camino, exponiendo el corazón y los pulmones. Corta la aurícula derecha con unas tijeras.
4. Perfundir al animal con 10 mL de PBS helado a través del ventrículo izquierdo y evaluar la integridad de la perfusión confirmando que el líquido que fluye desde la aurícula derecha se vuelve transparente y que el hígado se vuelve de un color amarillo pálido.
5. Identifique la tráquea e inserte una jeringa de aguja 22G con 3 mL de paraformaldehído al 4%, sosteniéndola paralela a la tráquea. Administre la solución a un ritmo lento hasta que los pulmones se hayan inflado por completo. Sostenga la tráquea con pinzas sobre la aguja y retírela lentamente para evitar el reflujo.
   NOTA: Enhebrar una sutura debajo de la tráquea antes de la inyección del fijador, seguido de atar la sutura alrededor de la tráquea después de la inyección, puede ser otra opción para prevenir el reflujo del fijador.
6. Continúe sosteniendo suavemente la tráquea, córtela con unas tijeras por encima de las pinzas y comience a levantar con cuidado el tejido mientras retira todo el tejido conectivo. Disecciona el corazón lejos de los pulmones.
7. Coloque el tejido pulmonar en paraformaldehído al 4% en PBS durante la noche y almacene a 4 °C para su fijación. Transfiera el tejido a PBS que contenga azida de sodio al 0,05% para su almacenamiento a largo plazo o procese más para el análisis histológico, según sea necesario.

Resultados

La inyección ortotópica de líneas celulares de cáncer de ratón en la 4ª almohadilla de grasa mamaria de ratones es un procedimiento reproducible y fiable para inducir tumores primarios de ratón. Utilizando la línea celular EO771 transducida con luciferasa en las condiciones descritas en este protocolo, los tumores primarios se vuelven palpables y se pueden medir con calibradores aproximadamente 7 días después de la inyección y alcanzan aproximadamente 150^mm3 de volu...

Discusión

A medida que se reconoce más ampliamente la naturaleza temprana de la diseminación metastásica y los efectos sistémicos del cáncer, se hace necesario contar con modelos en los que se tengan en cuenta estos dos factores críticos. Este protocolo permite a los investigadores monitorear la enfermedad residual mínima y el crecimiento de la metástasis pulmonar que ocurre espontáneamente a partir de tumores de mama primarios, teniendo en cuenta los efectos sistémicos del cáncer que i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061