Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Zusammenfassung

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Zusammenfassung

Metastasierung ist nach wie vor die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle. Die Abfolge von Ereignissen, die die Metastasierungskaskade charakterisieren, bietet vielfältige Möglichkeiten für therapeutische Interventionen, und die Fähigkeit, sie bei Mäusen genau zu modellieren, ist entscheidend, um ihre Auswirkungen zu bewerten. In dieser Arbeit wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Etablierung orthotoper primärer Brusttumoren und die anschließende Überwachung der Etablierung und des Wachstums von metastasierten Läsionen in der Lunge mittels in vivo Biolumineszenzbildgebung vorgestellt. Diese Methodik ermöglicht die Bewertung der Behandlung oder ihrer biologischen Wirkungen entlang des gesamten Spektrums der Metastasierung, von der Flucht des Primärtumors bis zum Auswachsen in der Lunge. Orthotope Brusttumoren werden bei Mäusen durch Injektion einer Luciferase-markierten Zellsuspension in die 4. Brustdrüse erzeugt. Tumore werden für eine bestimmte Zeit wachsen und sich ausbreiten und dann operativ reseziert. Bei der Resektion werden spontane Lungenmetastasen festgestellt und das Wachstum im Laufe der Zeit mit Hilfe der In-vivo-Biolumineszenzbildgebung überwacht. Am gewünschten experimentellen Endpunkt kann Lungengewebe für die nachgelagerte Analyse entnommen werden. Die Behandlung von etablierten, klinisch evidenten Metastasen ist entscheidend für die Verbesserung der Ergebnisse bei Krebspatienten im Stadium IV und kann durch Schwanzvenenmodelle der experimentellen Lungenmetastasierung evaluiert werden. Die metastasierende Ausbreitung erfolgt jedoch früh bei Brustkrebs, und viele Patientinnen haben nach der Operation eine latente, subklinisch disseminierte Erkrankung. Die Verwendung von spontanen Modellen wie diesem bietet die Möglichkeit, das gesamte Spektrum der Krankheit zu untersuchen, insbesondere die systemischen Effekte, die durch die Behandlung des Primärtumors hervorgerufen werden, wie z. B. prämetastasiertes Nischen-Priming, und Behandlungen für ruhende und subklinische Erkrankungen nach der Operation zu bewerten.

Einleitung

Metastasen - die Ausbreitung von Krebszellen vom Primärtumor auf andere Teile des Körpers - sind nach wie vor die Todesursache bei mehr als 90 % der Krebspatienten. Dieser Prozess ist komplex und umfasst die Migration der Tumorzellen aus dem Primärtumor und die Intravasation in den Blutkreislauf, das Überleben im Blut, die Extravasation und das Überleben im Zielorgan, die Wiederherstellung des proliferativen Zustands und das Auswachsen¹. Spontane und transplantierbare Modelle des murinen Krebses wurden verwendet, um frühe oder späte Stadien der Metastasierung zu untersuchen, wobei jedes seine eigenen Vor- und Nachteile aufweist, die ausführlich diskutiert wurden ^2,3,4.

Anders als bisher angenommen, verlassen Tumorzellen den Primärtumor in frühen Stadien der Tumorentwicklung und bleiben manchmal über lange Zeiträume in entfernten Geweben inaktiv 5,6,7,8. Darüber hinaus gibt es immer mehr Hinweise auf die starken systemischen Auswirkungen des Primärtumors auf den Krankheitsverlauf, die sich häufig durch die Sekretion löslicher Faktoren und Exosomen manifestieren, die den metastasierenden Boden konditionieren oder den Muskelschwund während der Kachexie stimulieren 9,10,11,12. Aus diesen Gründen ist die Modellierung der Länge des Metastasierungsprozesses in der Anfangspräsenz des Primärtumors unerlässlich geworden, um ein vollständigeres Verständnis der Biologie zu erlangen, die diese Prozesse antreibt, und um potenzielle neue Interventionen zu testen, die darauf abzielen, den Prozess zu stören oder zu verzögern.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Quantifizierung von Lungenmetastasen beschrieben, die spontan aus rückverfolgbaren Zelllinien entstehen, die orthotop in die Brustdrüse injiziert werden, ein Prozess, der alle oben genannten Schritte in der Metastasierungskaskade modelliert. Es ist bekannt, dass transplantierbare Metastasenmodelle im Vergleich zu spontanen, genetisch bedingten Krebsmodellen repräsentativer für die Metastasierung beim Menschen sind, wodurch die klinische Übertragbarkeit verbessert^{wird 2}. Darüber hinaus nutzt dieses Protokoll die Biolumineszenz-Bildgebung, um das Wachstum und die Progression spontaner Lungenmetastasen von primären Brusttumoren in Echtzeit bei lebenden Tieren zu untersuchen und so die Effizienz gegenüber traditionelleren histologisch basierten Bewertungen der metastasierenden Dissemination zu verbessern. Dieses Protokoll umfasst auch die Bewertung der spontanen Metastasierung nach der chirurgischen Entfernung des Primärtumors, was sowohl klinisch relevant ist als auch es den Forschern ermöglicht, die Auswirkungen einer minimalen Resterkrankung auf den Metastasierungsprozess zu untersuchen. Schließlich bietet die Verwendung immunkompetenter Mäuse den Vorteil, dass ein intaktes Immunsystem den Metastasierungsprozess beeinflussen kann, wie es in der Humanbiologie der Fall ist^10,11.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierverfahren und -protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Virginia Commonwealth University genehmigt.

1. Vorbereitung der Zellen für die Injektion

1. Auftauen von Luciferase-transduzierten EO771-Zellen¹³ aus Flüssigstickstofflagerung und Platte 1 x 10^{6 Zellen} in einer 10 cm großen Gewebekulturschale in vollständigem Zellkulturmedium (RPMI1640 + 10 % FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin + 1 % Amphotericin B).
2. Inkubieren bei 37 °C und 5 % CO₂ bis zu 80 %-90 % konfluent, bei Bedarf alle 2-3 Tage ein Mediumwechsel.
3. Um Zellen zu ernten, aspirieren Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie es mit 1x PBS. Mit 2 ml 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung ca. 2-3 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen ablösen, und dann mit 8 ml vollständigem Medium waschen, um die Reaktion zu löschen.
   HINWEIS: Eine längere Exposition der Zellen gegenüber Trypsin führt dazu, dass die Zelloberflächenproteine von der Membran abgestreift werden und letztendlich zum Zelltod führen.
4. Den Inhalt in ein 10 mL Zentrifugenröhrchen umfüllen und die Zellen durch Schleudern bei 350 x g für 5 min pelletieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL 1x PBS.
5. Entnehmen Sie eine 50-μl-Probe zum Zählen und pelletieren Sie die Zellen dann erneut, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 350 x g drehen.
   1. Während die Zellen zentrifugieren, fügen Sie der 50 μl Probe 50 μl Trypanblau hinzu und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämazytometer. Lebensfähige Zellen mit intakten Zellmembranen schließen den Farbstoff aus und bleiben nach der Zugabe von Trypanblau klar, während sterbende/tote Zellen den Farbstoff in das Zytoplasma eindringen und sich blau färben lassen.
   2. Bestimmen Sie das Volumen, das für die Resuspendierung von Zellen bei 6 x 10⁶ lebensfähigen Zellen/ml (Konzentration lebensfähiger Zellen [lebensfähige Zellen/ml]) erforderlich ist, indem Sie die folgende Formel verwenden:
      Durchschnittliche Anzahl lebensfähiger Zellen in den 4 Sätzen à 16 Quadrate × Verdünnungsfaktor × 1 x 10⁴ Zellen/ml
6. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in sterilem 1x PBS in dem berechneten Volumen, das zur Verdünnung der Zellen auf 6 x 10⁶ Zellen/ml erforderlich ist. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie sie bis zur Injektion auf Eis auf.

2. Injektionen von Brustfettpolstern

HINWEIS: Das vorliegende Protokoll kann mit jedem Mausstamm verwendet werden, aber aufgrund unseres Interesses an der Immunmikroumgebung verwenden wir C57BL6-Mäuse. Weibliche, jungfräuliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen werden in der Regel für Brustkrebsstudien verwendet, da die Parität die Tumorentstehungsprozesse verbessert.

1. Wachstumsfaktor-reduzierte Basalmembran-Matrix auf Eis auftauen und bis zur Injektion auf Eis aufbewahren.
2. Betäuben Sie Mäuse in einer Induktionskammer mit 4%-5% Isofluran. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesieebene, indem Sie das Fehlen eines Zehenquetschreflexes beurteilen und das Gas auf 2 % Isofluran zur Aufrechterhaltung während des Eingriffs senken.
   ACHTUNG: Isofluran ist ein geruchloses Inhalationsanästhetikum, das bekanntermaßen die Augen und die Haut reizt und für das Zentralnervensystem giftig ist. Es sollte in einer Umgebung mit ausreichender Belüftung verwendet werden. Eine langfristige oder chronische Exposition gegenüber Isofluran kann gesundheitsschädliche Auswirkungen haben. Es sollten veterinärmedizinische Anästhesiegeräte verwendet werden, die ordnungsgemäß kalibriert sind, Gasabsaugsysteme verwenden und häufig von tierärztlichem Personal gewartet werden.
3. Rasieren Sie die Haare am Bauch der Maus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und legen Sie sie dann in Rückenlage in einen Nasenkonus, der an einem Anästhesiegerät befestigt ist, mit einer Erhaltungsisofluranrate von 2%. Tragen Sie eine Augensalbe auf jedes Auge des Tieres auf, um Hornhautverletzungen zu vermeiden.
4. Schrubben Sie die Bauchregion dreimal in kreisenden Bewegungen mit abwechselnden Runden von 70% Ethanol und Povidon-Jod-Lösung. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesieebene, indem Sie das Fehlen eines Zehenquetschreflexes beurteilen.
5. Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Mittellinienschnitt (normalerweise ~1 cm) durch die Bauchhaut auf Höhe des 4. Brustgewebes, wobei Sie das darunter liegende Peritoneum freilegen, aber nicht durchdringen.
   HINWEIS: Andere Verfahren zur Implantation von Tumorzellen in die Brustdrüse, wie z. B. eine subkutane Injektion oder eine intraduktale Inokulation, können verwendet werden. Obwohl dieser chirurgische Eingriff etwas invasiv ist, ist er einfach zu erlernen und zu beherrschen, und die Visualisierung des Fettpolsters verbessert die Genauigkeit erheblich, da das Risiko einer Injektion außerhalb der Brustdrüse gering ist, was für die anschließende effektive Entfernung des Tumors entscheidend ist.
6. Halten Sie die Haut mit einer Pinzette vom Bauchfell fern. Verwenden Sie sterile, in Kochsalzlösung getauchte Wattestäbchen, um die Haut vom Bauchfell zu trennen, und bewegen Sie sie seitlich, um das rechte Brustfettpolster freizulegen. Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite, um das Fettpolster der linken Brust freizulegen.
7. Resuspendieren Sie die EO771-Zellsuspension mit einer manuellen Pipette und übertragen Sie 100 μl in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Basalmembran-Matrix-Lösung hinzu und mischen Sie gut, achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen, und bewahren Sie sie auf Eis auf. Die endgültige Zellsuspension wird nun 150.000 Zellen pro 50 μl enthalten.
8. 100 μl Zellsuspension in eine 28G 0,5 mL U-100 Insulinspritze aufziehen und auf Eis legen.
9. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und greifen Sie vorsichtig nach dem rechten Brustfettpolster und legen Sie es frei. Injizieren Sie 50 μl Zellsuspension in das Brustfettpad und warten Sie 3-5 s, bevor Sie die Spritze aus dem Brustfettpad entfernen, damit sich die Matrix zu verfestigen beginnt und die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass die Zellsuspension durch die Injektionsstelle zurückfließt. Am Ende der Injektion bildet sich eine kleine Blase.
10. Lösen Sie die Haut von der Pinzette, so dass das Brustfettpolster auf natürliche Weise in seine normale Position zurückkehren kann. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Fettpolster der linken Brust und legen Sie die Spritze mit der Zellsuspension zwischen den Injektionen wieder auf Eis.
11. Schließen Sie den Hautschnitt und tragen Sie Hautklammern auf. Die Länge des Schnittes bestimmt die Anzahl der erforderlichen Hautklammern, wobei bei den meisten Eingriffen ein bis zwei Klammern pro Schnitt erforderlich sind. Achten Sie darauf, dass zwischen den Klammern ein Mindestabstand von 0,5 cm eingehalten wird.
12. Bringen Sie die Maus nach dem chirurgischen Verschluss in einen sauberen Aufwachkäfig. Überwachen Sie bei Bedarf, bis sich das Tier wieder beruhigt und sein normales Verhalten wieder aufnimmt. Verabreichen Sie 3 Tage lang alle 24 Stunden 40 μl Meloxicam (2 mg/ml) subkutan zur Schmerzkontrolle. Alternativ kann zum Zeitpunkt des Eingriffs eine Dosis eines Opioids wie Buprenorphin mit langsamer Freisetzung verabreicht werden, die 72 Stunden anhält.
13. Überwachen Sie die Tiere in den ersten 5 Tagen nach der Operation täglich und beurteilen Sie das Gewicht der Tiere und alle Anzeichen von Beschwerden, wie z. B. ungepflegtes Fell, gekrümmter Rücken und rötlich-brauner Nasen- oder Augenausfluss.
14. Untersuchen Sie die Tiere auf Anzeichen einer Wundinfektion, wie z. B. Erythem oder Nekrosen an der Operationsstelle und Schutz der Inzisionsstelle, und töten Sie Tiere, die >20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren oder die Kriterien für schwere Beschwerden erfüllen, wie sie in den institutsspezifischen IACUC-Richtlinien beschrieben sind.

3. Tumor-Resektionen

1. Verwenden Sie Messschieber, um das Wachstum der orthotopen Brusttumorläsion 3 Mal pro Woche zu überwachen, indem Sie die Länge (L) und Breite des Primärtumors (W) messen. Berechnen Sie das Tumorvolumen nach der Formel:
   πLW²/6
   1. Bestimmen Sie die Tumorresektion empirisch in Abhängigkeit von der spezifischen injizierten Zelllinie. Entfernen Sie Tumore immer in der kleinstmöglichen Größe, um die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Wachstums zu verringern. Bei den in diesem Protokoll beschriebenen EO771-Zellen ist eine Tumorresektion durchzuführen, wenn die Tumoren ein Volumen von 150 mm³ erreichen.
      HINWEIS: Der optimale Zeitpunkt für Resektionen muss für einzelne Zelllinien bestimmt werden, aber 150 mm³ ist ein guter Ausgangspunkt, da das Verfahren den gesamten Tumor effizient herausschneiden kann, sobald der Benutzer erfahren ist.
2. Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran. Verabreichen Sie 40 μl Meloxicam (2 mg/ml) subkutan zur Schmerzkontrolle und setzen Sie die Maus dann in Rückenlage in einen Nasenkonus, der an einem Anästhesiegerät befestigt ist, mit einer Erhaltungsisofluranrate von 2%. Tragen Sie eine Augensalbe auf jedes Auge des Tieres auf, um Hornhautverletzungen zu vermeiden.
   HINWEIS: Das Analgetikum muss 3 Tage lang alle 24 Stunden verabreicht werden. Alternativ kann zum Zeitpunkt des Eingriffs eine Dosis eines Opioids wie Buprenorphin mit langsamer Freisetzung verabreicht werden, die 72 Stunden anhält.
3. Entfernen Sie bei Bedarf vorherige chirurgische Klammern und schrubben Sie die Bauchregion dreimal in kreisenden Bewegungen mit abwechselnden Runden von 70%igem Ethanol und Povidon-Jod-Lösung. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesieebene, indem Sie das Fehlen eines Zehenquetschreflexes beurteilen. Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Mittellinienschnitt (normalerweise ~1 cm) durch die Bauchhaut auf Höhe des 4. Brustgewebes, wobei Sie das darunter liegende Peritoneum freilegen, aber nicht durchdringen.
4. Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den orthotopen Tumor vom Peritoneum und der darüber liegenden Haut zu trennen. Entfernen Sie den orthotopen Tumor, indem Sie das normale Brustgewebe, das sich proximal und distal zum Tumor befindet, mit einer Schere durchtrennen und das Tumorgewebe in einen Biohazard-Beutel entsorgen. Wiederholen Sie dies mit dem kontralateralen Tumor. Wenn Blutungen auftreten, verätzen Sie das Gefäßsystem schnell.
   HINWEIS: Wenn orthotope Tumoren in das Peritoneum eingedrungen sind, was sich in einem Tumor zeigt, der nicht gut umschrieben ist oder sich durch stumpfe Dissektion leicht vom Peritoneum trennen lässt, sollten Tiere getötet werden, da die Entfernung des Tumors nicht abgeschlossen ist und er nachwächst, was zu einer Verwirrung des Hintergrund-Biolumineszenzsignals und der Morbidität führt.
5. Verwenden Sie ein bis drei Klammern, um die Operationsstelle zu verschließen, und bringen Sie die Maus in einen sauberen Aufwachkäfig mit einem warmen Heizkissen darunter, um die Genesung des Tieres nach der Tumorresektion zu verbessern. Überwachen Sie bei Bedarf, bis sich das Tier wieder beruhigt und sein normales Verhalten wieder aufnimmt.
   1. Bei Tieren, die während des Eingriffs etwas Blut verloren haben, verabreichen Sie eine 300-μl-Injektion mit steriler 0,9%iger normaler Kochsalzlösung, die intraperitoneal nach dem Verschluss der Operationsstelle verabreicht wird.
   2. Falls erforderlich, die Tiere zu diesem Zeitpunkt auf ein Biolumineszenzsignal abbilden, wie in Schritt 4 beschrieben, um die Vollständigkeit der Tumorresektion und die minimale Resterkrankung zu Studienbeginn zu beurteilen. Wenn die Resektion unvollständig war und in der primären Tumorregion ein Biolumineszenzsignal verbleibt, ist das Tier human zu töten, da das Wachstum der verbleibenden Tumorzellen zu einer Verwirrung des Hintergrund-Biolumineszenzsignals führen kann.
6. Überwachen Sie die Tiere in den ersten 5 Tagen nach der Operation täglich und beurteilen Sie das Gewicht der Tiere und alle Anzeichen von Beschwerden, wie z. B. ungepflegtes Fell, gekrümmter Rücken und rötlich-brauner Nasen- oder Augenausfluss.
7. Untersuchen Sie die Tiere auf Anzeichen einer Wundinfektion, wie z. B. Erythem oder Nekrosen an der Operationsstelle und Schutz der Inzisionsstelle. Tiere, die >20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren oder die Kriterien für schwere Belastungen erfüllen, wie sie in den institutsspezifischen IACUC-Richtlinien beschrieben sind, human zu töten.

4. In vivo Quantifizierung spontaner Lungenmetastasen

1. Führen Sie eine In-vivo-Bildgebung der Tiere am Tag der Tumorresektion durch, um ein Ausgangssignal zu ermitteln, und danach 2-3 Mal pro Woche, um das Wachstum spontaner metastasierender Lungentumorläsionen zu beurteilen.
2. Klicken Sie auf Initialisieren , um das bildgebende Instrument zum Aufwärmen zu starten, während die Tiere auf den Eingriff vorbereitet werden.
3. Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran und bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesieebene, indem Sie das Fehlen eines Zehenquetschreflexes beurteilen. Vergewissern Sie sich, dass die Sauerstoff- und Isoflurananästhesie zum bildgebenden Instrument fließt.
4. Injizieren Sie den Tieren 100 μl D-Luciferin-Lösung (15 mg/ml in sterilem PBS) unter Verwendung einer retroorbitalen Injektion, indem Sie die Nadel in einem Winkel von 45° von der Nase in den medialen Canthus des Auges einführen. Führen Sie die Nadel ein, bis ein knöcherner Widerstand zu spüren ist, und ziehen Sie die Nadel dann um ~1 mm zurück, bevor Sie D-Luciferin-Lösung injizieren, um sicherzustellen, dass die Nadel in der retroorbitalen Venenhöhle platziert wird.
   HINWEIS: D-Luciferin-Lösung kann auf anderen Wegen verabreicht werden, wie z. B. intraperitoneale oder subkutane Injektion, jedoch ist die Kinetik der Substratmetabolisierung länger und die Verteilung an verschiedene Organe heterogen.
5. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion durch das Fehlen einer Rückspülung der Flüssigkeit bei der Verabreichung und warten Sie 2 Minuten vor der Bildgebung. Während des Wartens werden die Tiere in Rückenlage in die Nasenkegel im Biolumineszenz-Imager gebracht und der Isofluran auf eine Erhaltungsrate von 2 % reduziert.
6. Bevor Sie ein Biolumineszenzbild des Tieres aufnehmen, stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben Foto aktiviert ist, um gleichzeitig ein Foto des Tieres mit Medium Binning und Blende 8 aufzunehmen. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben "Überlagerung " aktiviert ist, um das Foto mit dem Biolumineszenzbild zu überlagern. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 1 Minute ein, mit mittlerem Binning, f/stop = 1, und nehmen Sie ein Bild auf, indem Sie auf Acquire klicken.
7. Messen Sie den Photonenfluss wie folgt. Erstellen Sie einen quadratischen ROI mithilfe des Dropdown-Menüs der ROI-Tools für jedes im Bild abgebildete Tier, indem Sie auf die Schaltfläche Quadratischer ROI klicken. Positionieren Sie den automatisch generierten ROI über dem Brustkorb jedes Tieres, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen.
8. Klicken Sie auf die Schaltfläche ROIs messen und stellen Sie sicher, dass die Daten als Strahldichte (Photonen/s) und nicht als Zählungen angezeigt werden, damit Bilder, die mit unterschiedlichen Belichtungszeiten aufgenommen wurden, verglichen werden können.

5. Entnahme von Lungengewebe für die histologische Analyse

HINWEIS: Tiere können wie unten beschrieben zu jedem Versuchszeitpunkt oder wenn Tiere die Kriterien für eine humane Tötung erfüllen, gemäß den institutionsspezifischen IACUC-Richtlinien getötet werden. Nach unseren Erfahrungen erreichen Mäuse den humanen Endpunkt etwa 21-28 Tage nach der Resektion der Primärtumoren.

1. Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran und bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesieebene, indem Sie das Fehlen eines Zehenquetschreflexes beurteilen. Dann werden die Mäuse durch Zervixluxation eingeschläfert.
2. Verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt unterhalb des Xyphoid-Prozesses zu machen, und schneiden Sie durch die Haut, die Muskulatur und das Bauchfell, um den unteren Teil der Brusthöhle freizulegen, bis das Zwerchfell sichtbar ist. Durchstechen Sie das Zwerchfell, um die Lunge zu kollabieren, und schneiden Sie dann durch das Zwerchfell.
3. Schneiden Sie den Brustkorb auf der rechten und linken Seite durch und verwenden Sie dann ein Blutstillungsmittel, um den Xyphoid-Prozess zu erfassen und den Brustkorb aus dem Weg zu schieben, wodurch Herz und Lunge freigelegt werden. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer Schere ab.
4. Perfundieren Sie das Tier mit 10 ml eiskaltem PBS durch den linken Ventrikel und beurteilen Sie die Vollständigkeit der Perfusion, indem Sie bestätigen, dass die aus dem rechten Vorhof fließende Flüssigkeit klar wird und die Leber eine blassgelbe Farbe annimmt.
5. Identifizieren Sie die Luftröhre und führen Sie eine 22G-Nadelspritze mit 3 ml 4% Paraformaldehyd ein und halten Sie sie parallel zur Luftröhre. Geben Sie die Lösung in einem langsamen Tempo ab, bis sich die Lunge vollständig aufgebläht hat. Halten Sie die Luftröhre mit einer Pinzette über die Nadel und entfernen Sie die Nadel langsam, um einen Rückfluss zu verhindern.
   HINWEIS: Das Einfädeln einer Naht unter die Luftröhre vor der Injektion des Fixiermittels und das anschließende Binden der Naht um die Luftröhre nach der Injektion kann eine weitere Option sein, um einen Rückfluss des Fixiermittels zu verhindern.
6. Halten Sie die Luftröhre weiterhin vorsichtig, schneiden Sie sie mit einer Schere über der Pinzette ab und beginnen Sie vorsichtig, das Gewebe anzuheben, während Sie das gesamte Bindegewebe entfernen. Präparieren Sie das Herz von der Lunge weg.
7. Lungengewebe über Nacht in 4%iges Paraformaldehyd in PBS legen und zur Fixierung bei 4 °C lagern. Übertragen Sie das Gewebe zur Langzeitlagerung in PBS mit 0,05 % Natriumazid oder verarbeiten Sie es bei Bedarf für die histologische Analyse weiter.

Ergebnisse

Die orthotope Injektion von Maus-Krebszelllinien in das 4. Brustfettpolster von Mäusen ist ein reproduzierbares und zuverlässiges Verfahren zur Induktion von Maus-Primärtumoren. Unter Verwendung der EO771-Zelllinie, die unter den in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen mit Luciferase transduziert wurde, werden Primärtumoren tastbar und können etwa 7 Tage nach der Injektion mit Messschiebern gemessen werden und erreichen etwa 14 Tage nach der ersten Injektion ein Volumen von et...

Diskussion

In dem Maße, in dem die frühe Natur der Metastasierung und die systemischen Auswirkungen von Krebs immer mehr anerkannt werden, wird der Bedarf an Modellen, in denen diese beiden kritischen Faktoren berücksichtigt werden, zu einer Notwendigkeit. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, die minimale Resterkrankung und das Auswachsen von Lungenmetastasen zu überwachen, die spontan von primären Brusttumoren auftreten, unter Berücksichtigung der systemischen Auswirkungen von Kreb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061