In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Resumo

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

Resumo

A metástase continua sendo a principal causa de morte relacionada ao câncer. A sucessão de eventos que caracterizam a cascata metastática apresenta múltiplas oportunidades de intervenção terapêutica, e a capacidade de modelá-los com precisão em camundongos é fundamental para avaliar seus efeitos. Aqui, um protocolo passo a passo é apresentado para o estabelecimento de tumores primários ortotópicos da mama e o subsequente monitoramento do estabelecimento e crescimento de lesões metastáticas no pulmão usando imagens de bioluminescência in vivo . Essa metodologia permite a avaliação do tratamento ou de seus efeitos biológicos ao longo de toda a gama de desenvolvimento metastático, desde o escape do tumor primário até o crescimento nos pulmões. Os tumores ortotópicos de mama são gerados em camundongos por meio da injeção de uma suspensão celular marcada com luciferase na 4ª glândula mamária. Os tumores podem crescer e se disseminar por um período específico de tempo e, em seguida, são ressecados cirurgicamente. Após a ressecção, a metástase pulmonar espontânea é detectada e o crescimento ao longo do tempo é monitorado usando imagens de bioluminescência in vivo . No desfecho experimental desejado, o tecido pulmonar pode ser coletado para análise a jusante. O tratamento de metástases estabelecidas e clinicamente evidentes é fundamental para melhorar os resultados de pacientes com câncer em estágio IV e pode ser avaliado por meio de modelos de metástase pulmonar experimental. No entanto, a disseminação metastática ocorre precocemente no câncer de mama, e muitos pacientes apresentam doença disseminada latente e subclínica após a cirurgia. A utilização de modelos espontâneos como este oferece a oportunidade de estudar todo o espectro da doença, especialmente os efeitos sistêmicos impulsionados pelo tratamento do tumor primário, como priming de nicho pré-metastático, e avaliar tratamentos em doenças dormentes e subclínicas após a cirurgia.

Introdução

A metástase - a disseminação de células cancerígenas do tumor primário para outras partes do corpo - continua sendo a causa da morte em mais de 90% dos pacientes com câncer. Esse processo é complexo, envolvendo migração das células tumorais para fora do tumor primário e intravasamento para a circulação, sobrevivência no sangue, extravasamento e sobrevivência no órgão-alvo, reinstauração do estado proliferativo e crescimento¹. Modelos espontâneos e transplantáveis de câncer murino têm sido usados para investigar estágios iniciais ou tardios de metástase, cada um apresentando suas próprias vantagens e desvantagens, que têm sido amplamente discutidas ^2,3,4.

Ao contrário do que se pensava anteriormente, as células tumorais abandonam o tumor primário em estágios iniciais durante o desenvolvimento do tumor, às vezes permanecendo dormentes em tecidos distantes por longos períodos de tempo 5,6,7,8. Além disso, há evidências crescentes dos fortes efeitos sistêmicos que o tumor primário tem nos resultados da doença, muitas vezes manifestados através da secreção de fatores solúveis e exossomos que condicionam o solo metastático ou estimulam a perda de massa muscular durante a caquexia 9,10,11,12. Por essas razões, modelar a duração do processo metastático na presença inicial do tumor primário tornou-se essencial para alcançar uma compreensão mais completa da biologia que impulsiona esses processos e testar novas intervenções potenciais destinadas a interromper ou atrasar o processo.

Neste trabalho, é descrito um protocolo para quantificar metástases pulmonares surgindo espontaneamente de linhagens celulares rastreáveis injetadas ortotopicamente na glândula mamária, um processo que modela todas as etapas acima na cascata metastática. Sabe-se que os modelos transplantáveis de metástase são mais representativos da metástase humana em comparação com os modelos de câncer espontâneo e geneticamente orientado, melhorando assim a traduzibilidade clínica². Além disso, este protocolo utiliza imagens de bioluminescência para estudar o crescimento e a progressão da metástase pulmonar espontânea de tumores primários de mama em tempo real em animais vivos, melhorando assim a eficiência em relação às avaliações mais tradicionais baseadas em histologia da disseminação metastática. Este protocolo também inclui a avaliação da metástase espontânea após a remoção cirúrgica do tumor primário, o que é clinicamente relevante e permite aos pesquisadores estudar o efeito da doença residual mínima no processo metastático. Por fim, o uso de camundongos imunocompetentes confere a vantagem de permitir que um sistema imunológico intacto molde o processo metastático, como é o caso da biologia humana ^10,11.

Protocolo

Todos os procedimentos e protocolos de animais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Virginia Commonwealth University.

1. Preparação de células para injeção

1. Descongele as células EO771 transduzidas com luciferase¹³ do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque 1 x 10⁶ células em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm em meio de cultura de células completo (RPMI1640 + 10% FBS + 1% de penicilina/estreptomicina + 1% de anfotericina B).
2. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ até 80%-90% confluente, com trocas de meio a cada 2-3 dias, conforme necessário.
3. Para colher células, aspire o meio de cultura celular e lave com 1x PBS. Incube com 2 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,25% por cerca de 2-3 min a 37 ° C até que as células se desprendam e, em seguida, lave com 8 mL de meio completo para extinguir a reação.
   NOTA: A exposição celular prolongada à tripsina resultará na remoção das proteínas da superfície celular da membrana e, em última análise, causará a morte celular.
4. Transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de 10 mL e pelete as células girando a 350 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de 1x PBS.
5. Colete uma amostra de 50 μL para contagem e, em seguida, reproduza as células girando a 350 x g por 5 min.
   1. Enquanto as células estão centrifugando, adicione 50 μL de azul de tripano à amostra de 50 μL e conte o número de células viáveis usando um hemacitômetro. Células viáveis com membranas celulares intactas excluirão o corante e permanecerão claras após a adição de azul de tripano, enquanto células mortas/mortas permitirão que o corante entre no citoplasma e fique azul.
   2. Determine o volume necessário para ressuspender as células a 6 x 10⁶ células viáveis/ml (concentração de células viáveis [células viáveis/ml]) utilizando a seguinte fórmula:
      Número médio de células viáveis nos 4 conjuntos de 16 quadrados × fator de diluição × 1 x 10⁴ células/ml
6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em PBS estéril 1x no volume calculado necessário para diluir as células para 6 x 10⁶ células/ml. Transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha no gelo até que esteja pronto para a injeção.

2. Injeções de almofada de gordura mamária

NOTA: O presente protocolo pode ser usado com qualquer cepa de camundongo, mas devido ao nosso interesse no microambiente imunológico, utilizamos camundongos C57BL6. Camundongos virgens fêmeas de 6 a 8 semanas de idade são normalmente usados para estudos de câncer de mama, pois a paridade aumenta os processos de tumorigênese.

1. Descongele a matriz da membrana basal reduzida pelo fator de crescimento no gelo e mantenha no gelo até que esteja pronto para a injeção.
2. Anestesiar camundongos em uma câmara de indução usando 4% -5% de isoflurano. Confirme um plano de anestesia suficiente avaliando a falta de reflexo de pinça do dedo do pé e reduza o gás para 2% de isoflurano para manutenção durante o procedimento.
   CUIDADO: O isoflurano é um anestésico inalatório inodoro que é um conhecido irritante para os olhos e a pele e tóxico para o sistema nervoso central. Deve ser usado em um ambiente com ventilação adequada. A exposição prolongada ou crônica ao isoflurano pode ter efeitos adversos à saúde. Deve-se usar equipamento de anestesia veterinária devidamente calibrado, que utilize sistemas de eliminação de gás e que seja frequentemente mantido pela equipe veterinária.
3. Raspe o cabelo do abdômen do camundongo usando uma tesoura elétrica e, em seguida, coloque-o em decúbito dorsal em um cone nasal conectado a uma máquina de anestesia usando uma taxa de isoflurano de manutenção de 2%. Aplique pomada oftálmica em cada olho do animal para evitar lesões na córnea.
4. Esfregue cirurgicamente a região abdominal três vezes em movimentos circulares usando rodadas alternadas de etanol a 70% e solução de iodopovidona. Confirme um plano de anestesia suficiente avaliando a falta de reflexo de pinça do dedo do pé.
5. Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão na linha média (geralmente ~ 1 cm) através da pele abdominal no nível do 4º tecido mamário, expondo, mas não penetrando, através do peritônio subjacente.
   NOTA: Outros procedimentos para implantação de células tumorais na glândula mamária, como injeção subcutânea ou inoculação intraductal, podem ser utilizados. Embora um tanto invasivo, esse procedimento cirúrgico é simples de aprender e dominar, e visualizar a almofada de gordura melhora significativamente a precisão, com pouco risco de injeção fora da glândula mamária, o que é fundamental para a subsequente remoção eficaz do tumor.
6. Usando uma pinça, segure a pele longe do peritônio. Use cotonetes estéreis mergulhados em solução salina para separar a pele do peritônio, movendo-se lateralmente para expor a almofada de gordura mamária direita. Repita no lado esquerdo para expor a almofada de gordura mamária esquerda.
7. Ressuspenda a suspensão de células EO771 usando uma pipeta manual e transfira 100 μL para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione um volume igual de solução de matriz de membrana basal e misture bem, tomando cuidado para não introduzir bolhas, e mantenha no gelo. A suspensão celular final agora conterá 150.000 células por 50 μL.
8. Retire 100 μL de suspensão celular para uma seringa de insulina U-100 de 28G 0,5 mL e mantenha no gelo.
9. Usando uma pinça, levante a pele e agarre e exponha suavemente a almofada de gordura mamária direita. Injete 50 μL de suspensão celular na almofada de gordura mamária e aguarde 3-5 s antes de remover a seringa da almofada de gordura mamária para permitir que a matriz comece a solidificar e diminuir a chance de a suspensão celular refluir através do local da injeção. Uma pequena bolha se formará no final da injeção.
10. Solte a pele da pinça, permitindo que a almofada de gordura mamária retorne naturalmente à sua posição normal. Repita o procedimento com a almofada de gordura mamária esquerda, colocando a seringa contendo a suspensão celular de volta no gelo entre as injeções.
11. Feche a incisão na pele, aplicando grampos na pele. O comprimento da incisão determinará o número de grampos de pele necessários, com a maioria dos procedimentos exigindo de um a dois grampos por incisão. Certifique-se de que haja uma distância mínima de 0,5 cm entre os grampos.
12. Após o fechamento cirúrgico, transfira o mouse para uma gaiola de recuperação limpa. Monitore conforme necessário até que o animal se endireitar e retome o comportamento normal. Administrar 40 μL de meloxicam (2 mg/ml) por via subcutânea para controlo da dor de 24 em 24 h durante 3 dias. Alternativamente, uma dose de formulação de liberação lenta de um opioide como a buprenorfina pode ser administrada no momento do procedimento, que durará 72 h.
13. Monitore os animais diariamente durante os primeiros 5 dias após a operação, avaliando o peso dos animais e quaisquer sinais de angústia, como pêlo não cuidado, costas curvadas e secreção nasal ou ocular marrom-avermelhada.
14. Verifique os animais quanto a sinais de infecção da ferida, como eritema ou necrose do local cirúrgico e proteção do local da incisão, e sacrifique humanamente os animais que perdem >20% de seu peso corporal inicial ou que atendem aos critérios de sofrimento grave, conforme descrito pelas diretrizes IACUC específicas da instituição.

3. Ressecções tumorais

1. Use paquímetros para monitorar o crescimento da lesão do tumor ortotópico da mama 3 vezes por semana, medindo o comprimento do tumor primário (L) e a largura (W). Calcule o volume do tumor usando a fórmula:
   πLW²/6
   1. Determine a ressecção do tumor empiricamente, dependendo da linhagem celular específica injetada. Sempre remova os tumores no menor tamanho possível para reduzir as chances de crescimento. Para as células EO771 descritas neste protocolo, realizar a ressecção do tumor quando os tumores atingirem 150 mm³ de volume.
      NOTA: O tempo ideal de ressecções precisa ser determinado para linhagens celulares individuais, mas 150 mm³ é um bom ponto de partida, pois o procedimento pode extirpar com eficiência todo o tumor assim que o usuário for experiente.
2. Anestesiar os camundongos em uma câmara de indução usando isoflurano a 4%. Administre 40 μL de meloxicam (2 mg / mL) por via subcutânea para controle da dor e, em seguida, coloque o camundongo em decúbito dorsal em um cone nasal conectado a uma máquina de anestesia usando uma taxa de manutenção de isoflurano de 2%. Aplique pomada oftálmica em cada olho do animal para evitar lesões na córnea.
   NOTA: O analgésico precisa ser administrado a cada 24 h por 3 dias. Alternativamente, uma dose de formulação de liberação lenta de um opioide como a buprenorfina pode ser administrada no momento do procedimento, que durará 72 h.
3. Remova os grampos cirúrgicos anteriores, se necessário, e esfregue cirurgicamente a região abdominal três vezes em movimentos circulares usando rodadas alternadas de etanol a 70% e solução de iodopovidona. Confirme um plano de anestesia suficiente avaliando a falta de reflexo de pinça do dedo do pé. Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão na linha média (geralmente ~ 1 cm) através da pele abdominal no nível do 4º tecido mamário, expondo, mas não penetrando, através do peritônio subjacente.
4. Use dissecção romba para separar o tumor ortotópico do peritônio e da pele sobrejacente. Remova o tumor ortotópico cortando o tecido mamário normal localizado proximal e distalmente ao tumor usando uma tesoura e descarte o tecido tumoral em uma bolsa de risco biológico. Repita com o tumor contralateral. Se ocorrer sangramento, cauterize rapidamente a vasculatura.
   NOTA: Se tumores ortotópicos se infiltraram no peritônio, evidenciados por um tumor que não é bem circunscrito ou facilmente separável do peritônio por dissecção romba, os animais devem ser sacrificados, pois a remoção do tumor não será completa e ele crescerá novamente, levando à confusão do sinal de bioluminescência de fundo e morbidade.
5. Use de um a três grampos para fechar o local da cirurgia e transfira o mouse para uma gaiola de recuperação limpa com uma almofada de aquecimento quente embaixo para melhorar a recuperação do animal após o procedimento de ressecção do tumor. Monitore conforme necessário até que o animal se endireitar e retome o comportamento normal.
   1. Para animais que perderam algum sangue durante o procedimento, administre uma injeção de 300 μL de solução salina normal estéril a 0,9% administrada por via intraperitoneal após o fechamento do local da cirurgia.
   2. Se necessário, faça imagens dos animais neste ponto para sinal de bioluminescência, conforme descrito na etapa 4., para avaliar a completude da ressecção do tumor e a doença residual mínima basal. Se a ressecção foi incompleta e há sinal de bioluminescência remanescente na região do tumor primário, sacrifique humanamente o animal, pois o crescimento das células tumorais restantes pode resultar em confusão do sinal de bioluminescência de fundo.
6. Monitore os animais diariamente durante os primeiros 5 dias após a operação, avaliando o peso dos animais e quaisquer sinais de angústia, como pêlo não cuidado, costas curvadas e secreção nasal ou ocular marrom-avermelhada.
7. Verifique os animais quanto a sinais de infecção da ferida, como eritema ou necrose do local cirúrgico e proteção do local da incisão. Sacrifique humanamente animais que percam >20% de seu peso corporal inicial ou que atendam aos critérios de sofrimento grave, conforme descrito pelas diretrizes da IACUC específicas da instituição.

4. Quantificação in vivo de metástases pulmonares espontâneas

1. Realize imagens in vivo dos animais no dia da ressecção do tumor para estabelecer um sinal basal e, em seguida, 2-3 vezes/semana depois para avaliar o crescimento de lesões tumorais pulmonares metastáticas espontâneas.
2. Clique em Inicializar para iniciar o instrumento de imagem para aquecimento enquanto os animais são preparados para o procedimento.
3. Anestesiar os camundongos em uma câmara de indução usando isoflurano a 4% e confirmar um plano de anestesia suficiente, avaliando a falta de reflexo de pinça do dedo do pé. Confirme se a anestesia com oxigênio e isoflurano está fluindo para o instrumento de imagem.
4. Injectar nos animais 100 μL de solução de D-luciferina (15 mg/ml em PBS estéril) utilizando uma injecção retro-orbital, inserindo a agulha no canto medial do olho num ângulo de 45° em relação ao nariz. Insira a agulha até sentir a resistência óssea, momento em que retire a agulha em ~ 1 mm antes de injetar a solução de D-luciferina para garantir que a agulha seja colocada dentro do seio venoso retroorbital.
   NOTA: A solução de D-luciferina pode ser administrada por outras vias, como injeção intraperitoneal ou subcutânea, no entanto, a cinética de metabolização do substrato será mais longa e a distribuição para diferentes órgãos heterogênea.
5. Confirme a injeção bem-sucedida pela falta de descarga de qualquer líquido no momento do parto e aguarde 2 minutos antes da imagem. Enquanto espera, transfira os animais para os cones nasais localizados dentro do gerador de imagens de bioluminescência em decúbito dorsal e diminua o isoflurano para uma taxa de manutenção de 2%.
6. Antes de adquirir uma imagem de bioluminescência do animal, certifique-se de que a caixa de seleção ao lado de Fotografia esteja marcada para adquirir simultaneamente uma fotografia do animal usando binning médio e f/stop 8. Certifique-se de que a caixa de seleção ao lado de Sobreposição esteja marcada para sobrepor a fotografia com a imagem de bioluminescência. Defina o tempo de exposição para 1 min, com binning médio, f/stop = 1, e capture uma imagem clicando em Adquirir.
7. Meça o fluxo de fótons da seguinte maneira. Crie um ROI quadrado usando o menu suspenso de ferramentas de ROI para cada animal representado na imagem, clicando no botão ROI quadrado . Reposicione a ROI gerada automaticamente sobre o tórax de cada animal clicando e arrastando com o mouse.
8. Clique no botão Medir ROIs e certifique-se de que os dados sejam exibidos como radiância (fótons/s) e não como contagens, para que as imagens adquiridas com diferentes tempos de exposição possam ser comparadas.

5. Coleta de tecidos pulmonares para análise histológica

NOTA: Os animais podem ser sacrificados conforme descrito abaixo em qualquer momento experimental ou quando os animais atenderem aos critérios de sacrifício humanitário, de acordo com as diretrizes da IACUC específicas da instituição. Em nossa experiência, os camundongos atingem o desfecho humano aproximadamente 21-28 dias após a ressecção dos tumores primários.

1. Anestesiar os camundongos em uma câmara de indução usando isoflurano a 4% e confirmar um plano de anestesia suficiente, avaliando a falta de reflexo de pinça do dedo do pé. Em seguida, eutanasiar os camundongos por luxação cervical.
2. Use uma tesoura para fazer uma incisão na linha média abaixo do processo xifóide, cortando a pele, a musculatura e o peritônio para expor a parte inferior da cavidade torácica, até que o diafragma fique visível. Perfure o diafragma para colapsar os pulmões e, em seguida, corte o diafragma.
3. Corte a caixa torácica do lado direito e esquerdo e, em seguida, use um hemostático para agarrar o processo xifóide e mover a caixa torácica para fora do caminho, expondo o coração e os pulmões. Corte o átrio direito usando uma tesoura.
4. Perfunda o animal com 10 mL de PBS gelado através do ventrículo esquerdo e avalie a completude da perfusão, confirmando que o líquido que flui do átrio direito fica claro e que o fígado fica com uma cor amarelo-pálida.
5. Identifique a traqueia e insira uma seringa de agulha 22G com 3 mL de paraformaldeído a 4%, mantendo-a paralela à traqueia. Administre a solução em um ritmo lento até que os pulmões estejam totalmente inflados. Segure a traqueia com uma pinça sobre a agulha e remova lentamente a agulha para evitar o refluxo.
   NOTA: Enfiar uma sutura sob a traqueia antes da injeção do fixador, seguido de amarrar a sutura ao redor da traqueia após a injeção, pode ser outra opção para evitar o refluxo do fixador.
6. Continue segurando suavemente a traqueia, corte-a com uma tesoura acima da pinça e comece a levantar cuidadosamente o tecido enquanto remove todo o tecido conjuntivo. Disseque o coração longe dos pulmões.
7. Coloque o tecido pulmonar em paraformaldeído a 4% em PBS durante a noite e armazene a 4 ° C para fixação. Transfira o tecido para PBS contendo 0,05% de azida sódica para armazenamento de longo prazo ou processe posteriormente para análise histológica, conforme necessário.

Resultados

A injeção ortotópica de linhagens de células cancerígenas de camundongos na 4ª almofada de gordura mamária de camundongos é um procedimento reprodutível e confiável para induzir tumores primários de camundongos. Utilizando a linhagem celular EO771 transduzida com luciferase nas condições descritas neste protocolo, os tumores primários tornam-se palpáveis e podem ser medidos usando paquímetros cerca de 7 dias após a injeção e atingem aproximadamente 150 mm³ d...

Discussão

À medida que a natureza inicial da disseminação metastática e os efeitos sistêmicos do câncer se tornam mais amplamente reconhecidos, torna-se necessária a necessidade de modelos nos quais esses dois fatores críticos sejam levados em consideração. Este protocolo permite que os pesquisadores monitorem a doença residual mínima e o crescimento de metástases pulmonares que ocorrem espontaneamente a partir de tumores primários de mama, levando em conta os efeitos sistêmicos do ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061