In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Résumé

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

Résumé

Les métastases restent la principale cause de décès lié au cancer. La succession d’événements qui caractérisent la cascade métastatique présente de multiples possibilités d’intervention thérapeutique, et la capacité de les modéliser avec précision chez la souris est essentielle pour évaluer leurs effets. Ici, un protocole étape par étape est présenté pour l’établissement de tumeurs mammaires primaires orthotopiques et le suivi ultérieur de l’établissement et de la croissance des lésions métastatiques dans le poumon à l’aide de l’imagerie de bioluminescence in vivo . Cette méthodologie permet d’évaluer le traitement ou ses effets biologiques tout au long de la gamme du développement métastatique, de l’échappement de la tumeur primaire à l’excroissance dans les poumons. Des tumeurs orthotopiques du sein sont générées chez la souris par l’injection d’une suspension cellulaire marquée à la luciférase dans la 4e glande mammaire. Les tumeurs sont laissées se développer et se disséminer pendant une durée déterminée, puis sont réséquées chirurgicalement. Lors de la résection, des métastases pulmonaires spontanées sont détectées et la croissance au fil du temps est surveillée à l’aide de l’imagerie de bioluminescence in vivo . Au point final expérimental souhaité, le tissu pulmonaire peut être prélevé pour une analyse en aval. Le traitement des métastases établies et cliniquement évidentes est essentiel pour améliorer les résultats pour les patients atteints d’un cancer de stade IV, et il peut être évalué à l’aide de modèles expérimentaux de métastases pulmonaires expérimentales dans la veine de la queue. Cependant, la dissémination métastatique se produit tôt dans le cancer du sein, et de nombreuses patientes ont une maladie disséminée latente et subclinique après la chirurgie. L’utilisation de modèles spontanés tels que celui-ci offre la possibilité d’étudier tout le spectre de la maladie, en particulier les effets systémiques induits par le traitement de la tumeur primaire, tels que l’amorçage de niche pré-métastatique, et d’évaluer les traitements sur les maladies dormantes et subcliniques après la chirurgie.

Introduction

Les métastases - la propagation des cellules cancéreuses de la tumeur primaire à d’autres parties du corps - restent la cause de décès chez plus de 90% des patients atteints de cancer. Ce processus est complexe, impliquant la migration des cellules tumorales hors de la tumeur primitive et l’intravasation dans la circulation, la survie dans le sang, l’extravasation et la survie dans l’organe cible, la ré-instauration de l’état prolifératif et l’excroissance¹. Des modèles de cancer murin spontanés et transplantables ont été utilisés pour étudier les stades précoces ou tardifs des métastases, chacun présentant ses propres avantages et inconvénients, qui ont été discutés en détail ^2,3,4.

Contrairement à ce que l’on pensait auparavant, les cellules tumorales abandonnent la tumeur primaire à des stades précoces du développement tumoral, restant parfois dormantes dans des tissus éloignés pendant ce qui peut être de longues périodes de temps 5,6,7,8. De plus, il existe de plus en plus de preuves des effets systémiques importants de la tumeur primaire sur l’issue de la maladie, souvent manifestés par la sécrétion de facteurs solubles et d’exosomes qui conditionnent le sol métastatique ou stimulent la fonte musculaire pendant la cachexie 9,10,11,12. Pour ces raisons, la modélisation de la durée du processus métastatique en présence initiale de la tumeur primaire est devenue essentielle pour parvenir à une compréhension plus complète de la biologie à l’origine de ces processus et tester de nouvelles interventions potentielles visant à perturber ou à retarder le processus.

Dans ce travail, un protocole est décrit pour quantifier les métastases pulmonaires survenant spontanément à partir de lignées cellulaires traçables injectées orthotopiquement dans la glande mammaire, un processus qui modélise toutes les étapes ci-dessus dans la cascade métastatique. Les modèles transplantables de métastases sont connus pour être plus représentatifs des métastases humaines par rapport aux modèles de cancer spontanés et génétiques, améliorant ainsi la traduisibilité clinique². De plus, ce protocole utilise l’imagerie par bioluminescence pour étudier la croissance et la progression des métastases pulmonaires spontanées des tumeurs mammaires primaires en temps réel chez les animaux vivants, améliorant ainsi l’efficacité par rapport aux évaluations plus traditionnelles basées sur l’histologie de la dissémination métastatique. Ce protocole comprend également l’évaluation des métastases spontanées après l’ablation chirurgicale de la tumeur primaire, ce qui est à la fois cliniquement pertinent et permet aux chercheurs d’étudier l’effet d’une maladie résiduelle minime sur le processus métastatique. Enfin, l’utilisation de souris immunocompétentes confère l’avantage de permettre à un système immunitaire intact de façonner le processus métastatique, comme c’est le cas en biologie humaine ^10,11.

Protocole

Toutes les procédures et tous les protocoles pour les animaux décrits ici ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Commonwealth de Virginie.

1. Préparation des cellules pour l’injection

1. Décongeler les cellules EO771¹³ transduites par la luciférase à partir d’un stockage d’azote liquide et mettre en plaque 1 x 10⁶ cellules dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm dans un milieu de culture cellulaire complet (RPMI1640 + 10 % FBS + 1 % pénicilline/streptomycine + 1 % d’amphotéricine B).
2. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’il soit confluent de 80 à 90 %, avec des changements de milieu tous les 2 à 3 jours si nécessaire.
3. Pour récolter des cellules, aspirez le milieu de culture cellulaire et lavez-le avec 1x PBS. Incuber avec 2 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant environ 2 à 3 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent, puis laver avec 8 ml de milieu complet pour éteindre la réaction.
   REMARQUE : Une exposition cellulaire prolongée à la trypsine entraînera l’élimination des protéines de surface cellulaire de la membrane et, en fin de compte, provoquera la mort cellulaire.
4. Transférez le contenu dans un tube à centrifuger de 10 ml et granulez les cellules en les faisant tourner à 350 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et mettez les cellules en suspension dans 10 mL de 1x PBS.
5. Prélever un échantillon de 50 μL pour le comptage, puis granuler à nouveau les cellules en les faisant tourner à 350 x g pendant 5 min.
   1. Pendant que les cellules sont en centrifugation, ajoutez 50 μL de bleu trypan à l’échantillon de 50 μL et comptez le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémacytomètre. Les cellules viables avec des membranes cellulaires intactes excluront le colorant et resteront claires après l’ajout de bleu de trypan, tandis que les cellules mourantes/mortes permettront au colorant de pénétrer dans le cytoplasme et de devenir bleu.
   2. Déterminer le volume nécessaire pour remettre les cellules en suspension à 6 x 10⁶ cellules viables/mL (concentration de cellules viables [cellules viables/mL]) à l’aide de la formule suivante :
      Nombre moyen de cellules viables dans les 4 ensembles de 16 carrés × facteur de dilution × 1 x 10⁴ cellules/mL
6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile 1x dans le volume calculé nécessaire pour diluer les cellules à 6 x 10⁶ cellules/mL. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et conservez-la sur de la glace jusqu’au moment de l’injection.

2. Injections de coussinets adipeux mammaires

REMARQUE : Le protocole actuel peut être utilisé avec n’importe quelle souche de souris, mais compte tenu de notre intérêt pour le microenvironnement immunitaire, nous utilisons des souris C57BL6. Les souris vierges femelles âgées de 6 à 8 semaines sont généralement utilisées pour les études sur le cancer du sein, car la parité améliore les processus de tumorigenèse.

1. Décongeler la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit sur de la glace et la conserver sur la glace jusqu’au moment de l’injection.
2. Anesthésie les souris dans une chambre d’induction à l’aide de 4 à 5 % d’isoflurane. Confirmez un plan d’anesthésie suffisant en évaluant l’absence de réflexe de pincement des orteils et abaissez le gaz à 2 % d’isoflurane pour le maintien pendant la procédure.
   ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique inhalé inodore qui est un irritant connu pour les yeux et la peau et toxique pour le système nerveux central. Il doit être utilisé dans un environnement avec une ventilation adéquate. Une exposition à long terme ou chronique à l’isoflurane peut avoir des effets néfastes sur la santé. Il faut utiliser un équipement d’anesthésie vétérinaire correctement calibré, qui utilise des systèmes de récupération des gaz et qui est fréquemment entretenu par le personnel vétérinaire.
3. Rasez les poils sur l’abdomen de la souris à l’aide d’une tondeuse électrique, puis placez-les en position couchée dans un cône nasal fixé à un appareil d’anesthésie en utilisant un taux d’isoflurane d’entretien de 2%. Appliquez une pommade ophtalmique sur chaque œil de l’animal pour prévenir les lésions cornéennes.
4. Frottez chirurgicalement la région abdominale trois fois dans un mouvement circulaire en utilisant des tours alternés d’éthanol à 70% et de solution de povidone iodée. Confirmez un plan d’anesthésie suffisant en évaluant l’absence de réflexe de pincement des orteils.
5. À l’aide de ciseaux, faites une petite incision médiane (généralement ~ 1 cm) à travers la peau abdominale au niveau du 4e tissu mammaire, exposant mais ne pénétrant pas à travers le péritoine sous-jacent.
   REMARQUE : D’autres procédures pour l’implantation de cellules tumorales dans la glande mammaire, telles qu’une injection sous-cutanée ou une inoculation intracanalaire, peuvent être utilisées. Bien que quelque peu invasive, cette procédure chirurgicale est simple à apprendre et à maîtriser, et la visualisation du coussinet adipeux améliore considérablement la précision, avec peu de risque d’injection à l’extérieur de la glande mammaire, ce qui est essentiel pour l’élimination efficace ultérieure de la tumeur.
6. À l’aide d’une pince, tenez la peau à l’écart du péritoine. Utilisez des cotons-tiges stériles imbibés de solution saline pour séparer la peau du péritoine, en vous déplaçant latéralement pour exposer le coussinet adipeux mammaire droit. Répétez l’opération sur le côté gauche pour exposer le coussinet adipeux mammaire gauche.
7. Remettez en suspension la suspension de cellules EO771 à l’aide d’une pipette manuelle et transférez 100 μL dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Ajouter un volume égal de solution matricielle de membrane basale et bien mélanger, en prenant soin de ne pas introduire de bulles, et garder sur de la glace. La suspension cellulaire finale contiendra désormais 150 000 cellules par 50 μL.
8. Prélevez 100 μL de suspension cellulaire dans une seringue à insuline U-100 de 28 G et 0,5 ml et conservez-la sur de la glace.
9. À l’aide d’une pince, soulevez la peau et saisissez et exposez doucement le coussinet adipeux mammaire droit. Injectez 50 μL de suspension cellulaire dans le coussinet adipeux mammaire et attendez 3 à 5 s avant de retirer la seringue du coussinet adipeux mammaire pour permettre à la matrice de commencer à se solidifier et réduire le risque de reflux de la suspension cellulaire à travers le site d’injection. Une petite bulle se formera à la fin de l’injection.
10. Libérez la peau de la pince, permettant au coussinet adipeux mammaire de revenir naturellement à sa position normale. Répétez la procédure avec le coussinet adipeux mammaire gauche, en remettant la seringue contenant la suspension cellulaire sur de la glace entre les injections.
11. Fermez l’incision cutanée en appliquant des agrafes cutanées. La longueur de l’incision déterminera le nombre d’agrafes cutanées requises, la plupart des procédures nécessitant une à deux agrafes par incision. Assurez-vous qu’il y a une distance minimale de 0,5 cm entre les agrafes.
12. À la fermeture chirurgicale, transférez la souris dans une cage de récupération propre. Surveillez au besoin jusqu’à ce que l’animal se redresse et reprenne un comportement normal. Administrer 40 μL de méloxicam (2 mg/mL) par voie sous-cutanée pour le contrôle de la douleur toutes les 24 h pendant 3 jours. Alternativement, une dose de formulation à libération lente d’un opioïde comme la buprénorphine peut être administrée au moment de l’intervention, qui durera 72 heures.
13. Surveillez les animaux quotidiennement pendant les 5 premiers jours suivant l’opération, en évaluant leur poids et tout signe de détresse, comme une fourrure non entretenue, le dos voûté et un écoulement nasal ou oculaire brun rougeâtre.
14. Vérifiez que les animaux ne présentent pas de signes d’infection de la plaie, tels qu’un érythème ou une nécrose du site chirurgical et la protection du site d’incision, et sacrifiez sans cruauté les animaux qui perdent >20 % de leur poids corporel initial ou qui répondent aux critères de détresse grave, tels que décrits par les directives de l’IACUC spécifiques à l’établissement.

3. Résections tumorales

1. Utilisez des étriers pour surveiller la croissance de la lésion tumorale orthotopique du sein 3 fois par semaine en prenant des mesures de la longueur (L) et de la largeur (W) de la tumeur primaire. Calculez le volume de la tumeur à l’aide de la formule :
   πLW²/6
   1. Déterminer la résection tumorale de manière empirique en fonction de la lignée cellulaire spécifique injectée. Retirez toujours les tumeurs de la plus petite taille possible pour réduire les risques de repousse. Pour les cellules EO771 décrites dans ce protocole, effectuez une résection tumorale lorsque les tumeurs atteignent 150 mm³ de volume.
      REMARQUE : Le moment optimal des résections doit être déterminé pour les lignées cellulaires individuelles, mais 150 mm³ est un bon point de départ, car la procédure peut exciser efficacement toute la tumeur une fois que l’utilisateur est expérimenté.
2. Anesthésier les souris dans une chambre d’induction à l’aide d’isoflurane à 4 %. Administrer 40 μL de méloxicam (2 mg/mL) par voie sous-cutanée pour contrôler la douleur, puis placer la souris en position couchée dans un cône nasal fixé à un appareil d’anesthésie en utilisant un taux d’isoflurane d’entretien de 2 %. Appliquez une pommade ophtalmique sur chaque œil de l’animal pour prévenir les lésions cornéennes.
   REMARQUE : L’analgésique doit être administré toutes les 24 heures pendant 3 jours. Alternativement, une dose de formulation à libération lente d’un opioïde comme la buprénorphine peut être administrée au moment de l’intervention, qui durera 72 heures.
3. Retirez les agrafes chirurgicales antérieures, si nécessaire, et frottez chirurgicalement la région abdominale trois fois dans un mouvement circulaire en utilisant des tours alternés d’éthanol à 70 % et de solution de povidone iodée. Confirmez un plan d’anesthésie suffisant en évaluant l’absence de réflexe de pincement des orteils. À l’aide de ciseaux, faites une petite incision médiane (généralement ~ 1 cm) à travers la peau abdominale au niveau du 4e tissu mammaire, exposant mais ne pénétrant pas à travers le péritoine sous-jacent.
4. Utilisez la dissection émoussée pour séparer la tumeur orthotopique du péritoine et de la peau sus-jacente. Retirez la tumeur orthotopique en coupant le tissu mammaire normal situé proximale et distalement à la tumeur à l’aide de ciseaux et jetez le tissu tumoral dans un sac à risque biologique. Répétez l’opération avec la tumeur controlatérale. En cas de saignement, cautériser rapidement le système vasculaire.
   REMARQUE : Si des tumeurs orthotopiques se sont infiltrées dans le péritoine, comme en témoigne une tumeur qui n’est pas bien circonscrite ou facilement séparable du péritoine par dissection contondante, les animaux doivent être sacrifiés, car l’ablation de la tumeur ne sera pas complète et elle repoussera, entraînant une confusion du signal de bioluminescence de fond et une morbidité.
5. Utilisez une à trois agrafes pour fermer le site chirurgical et transférez la souris dans une cage de récupération propre avec un coussin chauffant chaud en dessous pour améliorer la récupération de l’animal après la procédure de résection de la tumeur. Surveillez au besoin jusqu’à ce que l’animal se redresse et reprenne un comportement normal.
   1. Pour les animaux qui ont perdu du sang pendant l’intervention, administrer une injection de 300 μL de solution saline normale stérile à 0,9 % administrée par voie intrapéritonéale après la fermeture du site chirurgical.
   2. Si nécessaire, imagez les animaux à ce stade pour le signal de bioluminescence, comme décrit à l’étape 4, afin d’évaluer l’exhaustivité de la résection tumorale et la maladie résiduelle minimale de base. Si la résection a été incomplète et qu’il reste un signal de bioluminescence dans la région tumorale primaire, sacrifiez l’animal sans cruauté, car la croissance des cellules tumorales restantes peut entraîner une confusion du signal de bioluminescence de fond.
6. Surveillez les animaux quotidiennement pendant les 5 premiers jours suivant l’opération, en évaluant leur poids et tout signe de détresse, comme une fourrure non entretenue, le dos voûté et un écoulement nasal ou oculaire brun rougeâtre.
7. Vérifiez que les animaux ne présentent pas de signes d’infection de la plaie, tels qu’un érythème ou une nécrose du site opératoire et la protection du site d’incision. Sacrifier sans cruauté les animaux qui perdent >20 % de leur poids corporel initial ou qui répondent aux critères de détresse grave, tels que décrits par les directives de l’IACUC spécifiques à l’établissement.

4. Quantification in vivo des métastases pulmonaires spontanées

1. Effectuer une imagerie in vivo des animaux le jour de la résection tumorale pour établir un signal de base, puis 2 à 3 fois/semaine par la suite pour évaluer la croissance des lésions tumorales pulmonaires métastatiques spontanées.
2. Cliquez sur Initialiser pour démarrer l’instrument d’imagerie pour l’échauffement pendant que les animaux sont préparés pour la procédure.
3. Anesthésier les souris dans une chambre d’induction à l’aide d’isoflurane à 4 % et confirmer un plan d’anesthésie suffisant en évaluant l’absence de réflexe de pincement des orteils. Confirmez que l’oxygène et l’anesthésie à l’isoflurane s’écoulent vers l’instrument d’imagerie.
4. Injecter aux animaux 100 μL de solution de D-luciférine (15 mg/mL dans du PBS stérile) par injection rétro-orbitale en insérant l’aiguille dans le canthus médial de l’œil à un angle de 45° par rapport au nez. Insérez l’aiguille jusqu’à ce qu’une résistance osseuse se fasse sentir, puis retirez l’aiguille de ~1 mm avant d’injecter la solution de D-luciférine pour vous assurer que l’aiguille est placée dans le sinus veineux rétroorbitaire.
   REMARQUE : La solution de D-luciférine peut être délivrée par d’autres voies, telles que l’injection intrapéritonéale ou sous-cutanée, cependant, la cinétique de métabolisation du substrat sera plus longue et la distribution aux différents organes hétérogène.
5. Confirmez la réussite de l’injection par l’absence de rinçage de tout liquide lors de l’administration et attendez 2 min avant l’imagerie. Pendant l’attente, transférez les animaux dans les cônes nasaux situés à l’intérieur de l’imageur de bioluminescence en position couchée et diminuez l’isoflurane à un taux de maintien de 2%.
6. Avant d’acquérir une image de bioluminescence de l’animal, assurez-vous que la case à côté de Photographie est cochée pour acquérir simultanément une photo de l’animal à l’aide du binning moyen et de f/stop 8. Assurez-vous que la case en regard de Superposition est cochée pour superposer la photo avec l’image de bioluminescence. Réglez le temps d’exposition sur 1 min, avec un binning moyen, f/stop = 1, et capturez une image en cliquant sur Acquérir.
7. Mesurez le flux de photons comme suit. Créez un retour d’intérêt carré à l’aide du menu déroulant des outils de retour d’intérêt pour chaque animal représenté dans l’image, en cliquant sur le bouton Centre d’intérêt carré . Repositionnez le ROI généré automatiquement sur le thorax de chaque animal en cliquant et en faisant glisser avec la souris.
8. Cliquez sur le bouton Mesurer les retours d’expérience et assurez-vous que les données sont affichées sous forme de luminance (photons/s) et non de comptes, afin que les images acquises avec des temps d’exposition différents puissent être comparées.

5. Prélèvement de tissus pulmonaires pour analyse histologique

REMARQUE : Les animaux peuvent être sacrifiés comme décrit ci-dessous à n’importe quel moment expérimental ou lorsque les animaux répondent aux critères de sacrifice sans cruauté, conformément aux directives de l’IACUC spécifiques à l’établissement. D’après notre expérience, les souris atteignent le point final humain environ 21 à 28 jours après la résection des tumeurs primaires.

1. Anesthésier les souris dans une chambre d’induction à l’aide d’isoflurane à 4 % et confirmer un plan d’anesthésie suffisant en évaluant l’absence de réflexe de pincement des orteils. Ensuite, euthanasiez les souris par luxation cervicale.
2. À l’aide de ciseaux, faites une incision médiane sous l’apophyse xyphoïde, en coupant la peau, la musculature et le péritoine pour exposer la partie inférieure de la cavité thoracique, jusqu’à ce que le diaphragme soit visible. Perforez le diaphragme pour affaisser les poumons, puis coupez à travers le diaphragme.
3. Coupez la cage thoracique sur les côtés droit et gauche, puis utilisez un hémostat pour saisir l’apophyse xyphoïde et écarter la cage thoracique, exposant le cœur et les poumons. Coupez l’oreillette droite à l’aide de ciseaux.
4. Perfuser l’animal avec 10 ml de PBS glacé par le ventricule gauche et évaluer la complétude de la perfusion en confirmant que le liquide s’écoulant de l’oreillette droite devient clair et que le foie prend une couleur jaune pâle.
5. Identifiez la trachée et insérez une seringue à aiguille de 22 G contenant 3 ml de paraformaldéhyde à 4 %, en la tenant parallèlement à la trachée. Administrez la solution à un rythme lent jusqu’à ce que les poumons soient complètement gonflés. Tenez la trachée avec une pince sur l’aiguille et retirez lentement l’aiguille pour éviter le reflux.
   REMARQUE : L’enfilage d’une suture sous la trachée avant l’injection du fixateur, suivi de l’attache de la suture autour de la trachée après l’injection, peut être une autre option pour prévenir le reflux du fixateur.
6. Continuez à tenir doucement la trachée, coupez-la avec des ciseaux au-dessus de la pince et commencez à soulever délicatement le tissu tout en retirant tout le tissu conjonctif. Disséquez le cœur loin des poumons.
7. Placez le tissu pulmonaire dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant la nuit et conservez-le à 4 °C pour la fixation. Transférez le tissu dans un PBS contenant 0,05 % d’azoture de sodium pour un stockage à long terme ou procédez à une analyse histologique, au besoin.

Résultats

L’injection orthotopique de lignées cellulaires cancéreuses de souris dans le 4e coussinet adipeux mammaire de souris est une procédure reproductible et fiable pour induire des tumeurs primaires de souris. En utilisant la lignée cellulaire EO771 transduite avec la luciférase dans les conditions décrites dans ce protocole, les tumeurs primaires deviennent palpables et peuvent être mesurées à l’aide d’un pied à coulisse environ 7 jours après l’injection et atteignent un ...

Discussion

À mesure que la nature précoce de la dissémination métastatique et les effets systémiques du cancer sont de plus en plus reconnus, le besoin de modèles dans lesquels ces deux facteurs critiques sont pris en compte devient une nécessité. Ce protocole permet aux chercheurs de surveiller une maladie résiduelle minimale et une croissance spontanée de métastases pulmonaires à partir de tumeurs mammaires primaires, en tenant compte des effets systémiques du cancer qui influencent ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061