In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Riepilogo

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

Abstract

Le metastasi rimangono la causa principale di morte correlata al cancro. La successione di eventi che caratterizzano la cascata metastatica presenta molteplici opportunità di intervento terapeutico e la capacità di modellarli accuratamente nei topi è fondamentale per valutarne gli effetti. Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per l'insediamento di tumori mammari primari ortotopici e il successivo monitoraggio dell'instaurazione e della crescita di lesioni metastatiche nel polmone utilizzando l'imaging a bioluminescenza in vivo . Questa metodologia consente di valutare il trattamento o i suoi effetti biologici lungo l'intera gamma di sviluppo metastatico, dalla fuga del tumore primario alla crescita nei polmoni. I tumori ortotopici della mammella sono generati nei topi tramite iniezione di una sospensione cellulare marcata con luciferasi nella 4a ghiandola mammaria. I tumori possono crescere e disseminarsi per un determinato periodo di tempo e vengono quindi resecati chirurgicamente. Dopo la resezione, viene rilevata una metastasi polmonare spontanea e la crescita nel tempo viene monitorata utilizzando l'imaging a bioluminescenza in vivo . All'endpoint sperimentale desiderato, il tessuto polmonare può essere raccolto per l'analisi a valle. Il trattamento delle metastasi clinicamente evidenti è fondamentale per migliorare gli esiti per i pazienti con cancro in stadio IV e può essere valutato attraverso modelli di metastasi polmonari sperimentali della vena caudale. Tuttavia, la disseminazione metastatica si verifica precocemente nel carcinoma mammario e molti pazienti hanno una malattia disseminata latente e subclinica dopo l'intervento chirurgico. L'utilizzo di modelli spontanei come questo offre l'opportunità di studiare l'intero spettro della malattia, in particolare gli effetti sistemici guidati dal trattamento del tumore primario come il priming di nicchia pre-metastatico, e di valutare i trattamenti sulla malattia dormiente e subclinica dopo l'intervento chirurgico.

Introduzione

Le metastasi - la diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario ad altre parti del corpo - rimangono la causa di morte in oltre il 90% dei pazienti oncologici. Questo processo è complesso e coinvolge la migrazione delle cellule tumorali dal tumore primario e l'intravaso nella circolazione, la sopravvivenza nel sangue, lo stravaso e la sopravvivenza nell'organo bersaglio, il re-instaurazione dello stato proliferativo e la crescita¹. Modelli di cancro murino spontaneo e trapiantabile sono stati utilizzati per studiare gli stadi precoci o tardivi delle metastasi, ognuno dei quali presenta i propri vantaggi e svantaggi, che sono stati ampiamente discussi ^2,3,4.

A differenza di quanto si pensasse in precedenza, le cellule tumorali abbandonano il tumore primario nelle prime fasi durante lo sviluppo del tumore, a volte rimanendo dormienti in tessuti distanti per quelli che possono essere lunghi periodi di tempo 5,6,7,8. Inoltre, vi è una crescente evidenza dei forti effetti sistemici che il tumore primario ha sugli esiti della malattia, spesso manifestati attraverso la secrezione di fattori solubili ed esosomi che condizionano il terreno metastatico o stimolano l'atrofia muscolare durante la cachessia 9,10,11,12. Per questi motivi, modellare la lunghezza del processo metastatico nella presenza iniziale del tumore primitivo è diventato essenziale per ottenere una comprensione più completa della biologia che guida questi processi e testare potenziali nuovi interventi volti a interrompere o ritardare il processo.

In questo lavoro, viene descritto un protocollo per quantificare le metastasi polmonari che derivano spontaneamente da linee cellulari tracciabili iniettate ortotopicamente nella ghiandola mammaria, un processo che modella tutti i passaggi precedenti nella cascata metastatica. È noto che i modelli trapiantabili di metastasi sono più rappresentativi delle metastasi umane rispetto ai modelli di cancro spontanei a guida genetica, migliorando così la traducibilità clinica². Inoltre, questo protocollo utilizza l'imaging a bioluminescenza per studiare la crescita e la progressione delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari primari in tempo reale all'interno di animali viventi, migliorando così l'efficienza rispetto alle valutazioni più tradizionali basate sull'istologia della disseminazione metastatica. Questo protocollo include anche la valutazione delle metastasi spontanee dopo la rimozione chirurgica del tumore primario, che è clinicamente rilevante e consente ai ricercatori di studiare l'effetto della malattia residua minima sul processo metastatico. Infine, l'uso di topi immunocompetenti conferisce il vantaggio di consentire a un sistema immunitario intatto di modellare il processo metastatico, come nel caso della biologia umana^10,11.

Protocollo

Tutte le procedure e i protocolli per gli animali qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Virginia Commonwealth University.

1. Preparazione delle cellule per l'iniezione

1. Scongelare le cellule EO771¹³ trasdotte con luciferasi dalla conservazione di azoto liquido e preparare 1 x 10⁶ cellule in una piastra di coltura tissutale di 10 cm in terreno di coltura cellulare completo (RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicillina/streptomicina + 1% amfotericina B).
2. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ fino all'80%-90% confluente, con cambi di terreno ogni 2-3 giorni se necessario.
3. Per raccogliere le cellule, aspirare il terreno di coltura cellulare e lavare con 1x PBS. Incubare con 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% per circa 2-3 minuti a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano, quindi lavare con 8 mL di terreno completo per estinguere la reazione.
   NOTA: L'esposizione prolungata delle cellule alla tripsina provocherà la rimozione delle proteine della superficie cellulare dalla membrana e, in ultima analisi, causerà la morte cellulare.
4. Trasferire il contenuto in una provetta da centrifuga da 10 ml e pellettare le cellule centrifugando a 350 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di 1x PBS.
5. Raccogliere un campione da 50 μl per il conteggio e quindi ripellettare le celle centrifugando a 350 x g per 5 minuti.
   1. Durante la centrifugazione delle cellule, aggiungere 50 μl di blu di tripano al campione da 50 μl e contare il numero di cellule vitali utilizzando un ematocitometro. Le cellule vitali con membrane cellulari intatte escluderanno il colorante e rimarranno chiare dopo l'aggiunta di blu di tripano, mentre le cellule morenti/morte consentiranno al colorante di entrare nel citoplasma e diventare blu.
   2. Determinare il volume necessario per la risospensione delle cellule a 6 x 10⁶ cellule vitali/mL (concentrazione di cellule vitali [cellule vitali/mL]) utilizzando la seguente formula:
      Numero medio di cellule vitali nelle 4 serie da 16 quadrati × fattore di diluizione × 1 x 10⁴ cellule/mL
6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in PBS sterile 1x nel volume calcolato necessario per diluire le cellule a 6 x 10⁶ cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e tenerla in ghiaccio fino al momento dell'iniezione.

2. Iniezioni di cuscinetti adiposi mammari

NOTA: L'attuale protocollo può essere utilizzato con qualsiasi ceppo di topo, ma dato il nostro interesse per il microambiente immunitario, utilizziamo topi C57BL6. I topi femmine vergini di 6-8 settimane sono tipicamente utilizzati per gli studi sul cancro al seno, poiché la parità migliora i processi di tumorigenesi.

1. Scongelare la matrice della membrana basale ridotta del fattore di crescita sul ghiaccio e mantenere sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione.
2. Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 4%-5%. Confermare un piano di anestesia sufficiente valutando la mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi e abbassare il gas al 2% di isoflurano per il mantenimento durante la procedura.
   ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico inodore per via inalatoria che è un noto irritante per gli occhi e la pelle e tossico per il sistema nervoso centrale. Deve essere utilizzato in un ambiente con adeguata ventilazione. L'esposizione a lungo termine o cronica all'isoflurano può avere effetti negativi sulla salute. Devono essere utilizzate apparecchiature per anestesia veterinaria correttamente calibrate, che utilizzino sistemi di evacuazione dei gas e che siano frequentemente mantenute da personale veterinario.
3. Radere i peli sull'addome del topo utilizzando un tagliacapelli elettrico e poi posizionarli in posizione supina in un cono nasale attaccato a una macchina per anestesia utilizzando un tasso di isoflurano di mantenimento del 2%. Applicare un unguento oftalmico su ciascun occhio dell'animale per prevenire lesioni corneali.
4. Strofinare chirurgicamente la regione addominale tre volte con un movimento circolare utilizzando cicli alternati di etanolo al 70% e soluzione di iodio povidone. Confermare un piano di anestesia sufficiente valutando la mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
5. Usando le forbici, praticare una piccola incisione sulla linea mediana (di solito ~ 1 cm) attraverso la pelle addominale a livello del 4° tessuto mammario, esponendo ma non penetrando attraverso il peritoneo sottostante.
   NOTA: Possono essere utilizzate altre procedure per l'impianto di cellule tumorali nella ghiandola mammaria, come l'iniezione sottocutanea o l'inoculazione intraduttale. Sebbene un po' invasiva, questa procedura chirurgica è semplice da imparare e padroneggiare e la visualizzazione del cuscinetto adiposo migliora significativamente l'accuratezza, con poco rischio di iniezione al di fuori della ghiandola mammaria, che è fondamentale per la successiva rimozione efficace del tumore.
6. Usando una pinza, tieni la pelle lontana dal peritoneo. Utilizzare tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina per separare la pelle dal peritoneo, muovendosi lateralmente per esporre il cuscinetto adiposo mammario destro. Ripeti sul lato sinistro per esporre il cuscinetto adiposo mammario sinistro.
7. Risospendere la sospensione cellulare EO771 utilizzando una pipetta manuale e trasferire 100 μl in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione di matrice della membrana basale e mescolare bene, facendo attenzione a non introdurre bolle, e tenere in ghiaccio. La sospensione cellulare finale conterrà ora 150.000 cellule per 50 μl.
8. Aspirare 100 μL di sospensione cellulare in una siringa da insulina U-100 da 28 G 0,5 mL e tenere in ghiaccio.
9. Usando una pinza, solleva la pelle e afferra ed espone delicatamente il cuscinetto adiposo mammario destro. Iniettare 50 μL di sospensione cellulare nel cuscinetto adiposo mammario e attendere 3-5 s prima di rimuovere la siringa dal cuscinetto adiposo mammario per consentire alla matrice di iniziare a solidificarsi e ridurre la possibilità che la sospensione cellulare rifluisca attraverso il sito di iniezione. Alla fine dell'iniezione si formerà una piccola bolla.
10. Rilascia la pelle dal forcipe, consentendo al cuscinetto adiposo mammario di tornare naturalmente alla sua posizione normale. Ripetere la procedura con il cuscinetto adiposo mammario sinistro, rimettendo la siringa contenente la sospensione cellulare sul ghiaccio tra un'iniezione e l'altra.
11. Chiudere l'incisione cutanea, applicando le graffette cutanee. La lunghezza dell'incisione determinerà il numero di graffette cutanee necessarie, con la maggior parte delle procedure che richiedono da una a due graffette per incisione. Assicurarsi che ci sia una distanza minima di 0,5 cm tra le graffette.
12. Dopo la chiusura chirurgica, trasferire il topo in una gabbia di recupero pulita. Monitorare se necessario fino a quando l'animale non si rimette in sesto e riprende il normale comportamento. Somministrare 40 μL di meloxicam (2 mg/mL) per via sottocutanea per il controllo del dolore ogni 24 ore per 3 giorni. In alternativa, al momento della procedura può essere somministrata una dose di formulazione a lento rilascio di un oppioide come la buprenorfina, che durerà per 72 ore.
13. Monitorare quotidianamente gli animali per i primi 5 giorni dopo l'operazione, valutando il peso degli animali e qualsiasi segno di sofferenza, come pelo non curato, schiena curva e secrezione nasale o oculare bruno-rossastra.
14. Controllare gli animali per segni di infezione della ferita, come eritema o necrosi del sito chirurgico e la sorveglianza del sito di incisione, e sacrificare umanamente gli animali che perdono >20% del loro peso corporeo iniziale o che soddisfano i criteri per il grave disagio, come descritto dalle linee guida IACUC specifiche dell'istituto.

3. Resezioni tumorali

1. Utilizzare i calibri per monitorare la crescita della lesione ortotopica del tumore al seno 3 volte a settimana, misurando la lunghezza (L) e la larghezza (W) del tumore primario. Calcola il volume del tumore utilizzando la formula:
   πLW²/6
   1. Determinare empiricamente la resezione del tumore a seconda della specifica linea cellulare iniettata. Rimuovere sempre i tumori con le dimensioni più piccole possibili per ridurre le possibilità di ricrescita. Per le cellule EO771 descritte in questo protocollo, eseguire la resezione tumorale quando i tumori raggiungono i 150 mm³ di volume.
      NOTA: Il tempo ottimale delle resezioni deve essere determinato per le singole linee cellulari, ma 150 mm³ è un buon punto di partenza, poiché la procedura può asportare in modo efficiente tutto il tumore una volta che l'utente è esperto.
2. Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 4%. Somministrare 40 μL di meloxicam (2 mg/mL) per via sottocutanea per il controllo del dolore, quindi posizionare il topo in posizione supina in un cono nasale collegato a una macchina per anestesia utilizzando un tasso di isoflurano di mantenimento del 2%. Applicare un unguento oftalmico su ciascun occhio dell'animale per prevenire lesioni corneali.
   NOTA: L'analgesico deve essere somministrato ogni 24 ore per 3 giorni. In alternativa, al momento della procedura può essere somministrata una dose di formulazione a lento rilascio di un oppioide come la buprenorfina, che durerà per 72 ore.
3. Rimuovere le graffette chirurgiche precedenti, se necessario, e strofinare chirurgicamente la regione addominale tre volte con un movimento circolare utilizzando cicli alternati di etanolo al 70% e soluzione di iodio povidone. Confermare un piano di anestesia sufficiente valutando la mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. Usando le forbici, praticare una piccola incisione sulla linea mediana (di solito ~ 1 cm) attraverso la pelle addominale a livello del 4° tessuto mammario, esponendo ma non penetrando attraverso il peritoneo sottostante.
4. Utilizzare la dissezione smussata per separare il tumore ortotopico dal peritoneo e dalla pelle sovrastante. Rimuovere il tumore ortotopico tagliando il normale tessuto mammario situato prossimalmente e distalmente al tumore usando le forbici e gettare il tessuto tumorale in una sacca a rischio biologico. Ripetere con il tumore controlaterale. In caso di sanguinamento, cauterizzare rapidamente il sistema vascolare.
   NOTA: Se i tumori ortotopici si sono infiltrati nel peritoneo, evidenziato da un tumore che non è ben circoscritto o facilmente separabile dal peritoneo mediante dissezione smussata, gli animali devono essere sacrificati, poiché la rimozione del tumore non sarà completa e ricrescerà, portando a confondere il segnale di bioluminescenza di fondo e morbilità.
5. Utilizzare da una a tre graffette per chiudere il sito chirurgico e trasferire il mouse in una gabbia di recupero pulita con un termoforo caldo sottostante per migliorare il recupero dell'animale dopo la procedura di resezione del tumore. Monitorare se necessario fino a quando l'animale non si rimette in sesto e riprende il normale comportamento.
   1. Per gli animali che hanno perso un po' di sangue durante la procedura, somministrare un'iniezione di 300 μl di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% somministrata per via intraperitoneale dopo la chiusura del sito chirurgico.
   2. Se necessario, visualizzare gli animali a questo punto per il segnale di bioluminescenza, come descritto nel passaggio 4., per valutare la completezza della resezione del tumore e la malattia minima residua al basale. Se la resezione è stata incompleta e c'è un segnale di bioluminescenza rimanente nella regione tumorale primaria, sacrificare umanamente l'animale, poiché la crescita delle cellule tumorali rimanenti può causare confusione del segnale di bioluminescenza di fondo.
6. Monitorare quotidianamente gli animali per i primi 5 giorni dopo l'operazione, valutando il peso degli animali e qualsiasi segno di sofferenza, come pelo non curato, schiena curva e secrezione nasale o oculare bruno-rossastra.
7. Controllare gli animali per segni di infezione della ferita, come eritema o necrosi del sito chirurgico e sorvegliare il sito di incisione. Sacrificare umanamente gli animali che perdono >20% del loro peso corporeo iniziale o che soddisfano i criteri per il disagio grave, come descritto dalle linee guida IACUC specifiche dell'istituto.

4. Quantificazione in vivo di metastasi polmonari spontanee

1. Eseguire l'imaging in vivo degli animali il giorno della resezione del tumore per stabilire un segnale di base, e poi 2-3 volte a settimana per valutare la crescita di lesioni spontanee metastatiche del tumore polmonare.
2. Fare clic su Inizializza per avviare lo strumento di imaging per il riscaldamento mentre gli animali sono preparati per la procedura.
3. Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 4% e confermare un piano di anestesia sufficiente valutando la mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita. Verificare che l'ossigeno e l'anestesia con isoflurano fluiscano verso lo strumento di imaging.
4. Iniettare negli animali 100 μL di soluzione di D-luciferina (15 mg/mL in PBS sterile) utilizzando un'iniezione retroorbitale inserendo l'ago nel canto mediale dell'occhio con un angolo di 45° dal naso. Inserire l'ago fino a quando non si avverte una resistenza ossea, a quel punto ritirare l'ago di ~1 mm prima di iniettare la soluzione di D-luciferina per assicurarsi che l'ago sia posizionato all'interno del seno venoso retroorbitale.
   NOTA: La soluzione di D-luciferina può essere somministrata per altre vie, come l'iniezione intraperitoneale o sottocutanea, tuttavia, la cinetica di metabolizzazione del substrato sarà più lunga e la distribuzione ai diversi organi eterogenea.
5. Confermare l'avvenuta iniezione in base alla mancanza di risciacquo di qualsiasi liquido al momento dell'erogazione e attendere 2 minuti prima dell'imaging. Durante l'attesa, trasferire gli animali sui coni nasali situati all'interno dell'imager a bioluminescenza in posizione supina e ridurre l'isoflurano a un tasso di mantenimento del 2%.
6. Prima di acquisire un'immagine in bioluminescenza dell'animale, assicurarsi che la casella di controllo accanto a Fotografia sia selezionata per acquisire contemporaneamente una fotografia dell'animale utilizzando il binning medio e f/stop 8. Assicurati che la casella di controllo accanto a Sovrapposizione sia selezionata per sovrapporre la fotografia con l'immagine in bioluminescenza. Imposta il tempo di esposizione a 1 min, con binning medio, f/stop = 1, e cattura un'immagine cliccando su Acquisisci.
7. Misurare il flusso di fotoni come segue. Crea un ROI quadrato utilizzando il menu a discesa degli strumenti ROI per ogni animale raffigurato nell'immagine, facendo clic sul pulsante ROI quadrato . Riposiziona la ROI generata automaticamente sul torace di ogni animale facendo clic e trascinando con il mouse.
8. Fare clic sul pulsante Misura ROI e assicurarsi che i dati vengano visualizzati come radianza (fotoni/s) e non conteggi, in modo da poter confrontare le immagini acquisite con tempi di esposizione diversi.

5. Raccolta di tessuti polmonari per analisi istologiche

NOTA: Gli animali possono essere sacrificati come descritto di seguito in qualsiasi momento sperimentale o quando gli animali soddisfano i criteri per il sacrificio umano, secondo le linee guida IACUC specifiche dell'istituto. Nella nostra esperienza, i topi raggiungono l'endpoint umanitario circa 21-28 giorni dopo la resezione dei tumori primari.

1. Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 4% e confermare un piano di anestesia sufficiente valutando la mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita. Quindi, sopprimere i topi mediante lussazione cervicale.
2. Usa le forbici per praticare un'incisione sulla linea mediana sotto il processo xifoideo, tagliando la pelle, la muscolatura e il peritoneo per esporre la parte inferiore della cavità toracica, fino a quando il diaframma è visibile. Forare il diaframma per far collassare i polmoni e poi tagliare il diaframma.
3. Taglia la gabbia toracica sul lato destro e sinistro e poi usa un emostatico per afferrare il processo xifoideo e spostare la gabbia toracica in modo che non sia d'intralcio, esponendo il cuore e i polmoni. Taglia l'atrio destro usando le forbici.
4. Perfondere l'animale con 10 ml di PBS ghiacciato attraverso il ventricolo sinistro e valutare la completezza della perfusione confermando che il liquido che scorre dall'atrio destro diventa limpido e che il fegato assume un colore giallo pallido.
5. Identificare la trachea e inserire una siringa con ago da 22G con 3 mL di paraformaldeide al 4%, tenendola parallela alla trachea. Somministrare la soluzione a un ritmo lento fino a quando i polmoni non si sono completamente gonfiati. Tenere la trachea con una pinza sopra l'ago e rimuovere lentamente l'ago per evitare il riflusso.
   NOTA: Infilare una sutura sotto la trachea prima dell'iniezione del fissativo, seguito dal legare la sutura attorno alla trachea dopo l'iniezione, può essere un'altra opzione per prevenire il riflusso del fissativo.
6. Continua a tenere delicatamente la trachea, tagliala con le forbici sopra la pinza e inizia a sollevare con cura il tessuto rimuovendo tutto il tessuto connettivo. Sezionare il cuore lontano dai polmoni.
7. Mettere il tessuto polmonare in paraformaldeide al 4% in PBS per una notte e conservare a 4 °C per il fissaggio. Trasferire il tessuto in PBS contenente azoturo di sodio allo 0,05% per la conservazione a lungo termine o processarlo ulteriormente per l'analisi istologica, se necessario.

Risultati

L'iniezione ortotopica di linee cellulari di cancro di topo nel 4° cuscinetto adiposo mammario di topi è una procedura riproducibile e affidabile per indurre tumori primari di topo. Utilizzando la linea cellulare EO771 trasdotta con luciferasi nelle condizioni descritte in questo protocollo, i tumori primari diventano palpabili e possono essere misurati utilizzando calibri circa 7 giorni dopo l'iniezione e raggiungere circa 150 mm³ di volume a circa 14 giorni dall'iniezione ...

Discussione

Man mano che la natura precoce della disseminazione metastatica e gli effetti sistemici del cancro diventano più ampiamente riconosciuti, la necessità di modelli in cui entrambi questi fattori critici siano presi in considerazione diventa una necessità. Questo protocollo consente ai ricercatori di monitorare la malattia residua minima e la crescita delle metastasi polmonari che si verificano spontaneamente da tumori mammari primari, tenendo conto degli effetti sistemici del cancro che...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061