생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

요약

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

초록

전이는 암 관련 사망의 주요 원인으로 남아 있습니다. 전이성 연쇄 반응을 특징짓는 일련의 사건은 치료 개입을 위한 여러 기회를 제공하며, 마우스에서 이를 정확하게 모델링하는 능력은 그 효과를 평가하는 데 중요합니다. 여기에서는 in vivo bioluminescence imaging을 사용하여 기립성 원발성 유방 종양의 확립과 폐의 전이성 병변의 확립 및 성장에 대한 후속 모니터링을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 통해 원발성 종양 탈출에서 폐의 증식에 이르기까지 전이성 발달의 전체 범위에 걸쳐 치료 또는 생물학적 효과를 평가할 수 있습니다. 유방 기교성 종양은 4번째 유선에 루시페라아제 표지된 세포 현탁액의 주입을 통해 마우스에서 생성됩니다. 종양은 일정 시간 동안 성장하고 퍼질 수 있도록 허용한 다음 외과적으로 절제합니다. 절제 시 자발적인 폐 전이가 감지되고 in vivo bioluminescence imaging을 사용하여 시간 경과에 따른 성장을 모니터링합니다. 원하는 실험 종점에서 다운스트림 분석을 위해 폐 조직을 수집할 수 있습니다. 확립되고 임상적으로 명백한 전이의 치료는 IV기 암 환자의 결과를 개선하는 데 중요하며, 실험적 폐 전이의 꼬리 정맥 모델을 통해 평가할 수 있습니다. 그러나 유방암에서 전이성 파종은 초기에 발생하며, 많은 환자들이 수술 후 잠복성, 무증상 파종성 질환을 가지고 있습니다. 이와 같은 자발적 모델의 활용은 질병의 전체 스펙트럼, 특히 전이성 틈새 프라이밍과 같은 원발성 종양의 치료에 의해 주도되는 전신 효과를 연구하고 수술 후 휴면 및 무증상 질병에 대한 치료를 평가할 수 있는 기회를 제공합니다.

서문

원발성 종양에서 신체의 다른 부분으로 암세포가 퍼지는 전이는 암 환자의 90% 이상에서 사망 원인으로 남아 있습니다. 이 과정은 원발성 종양에서 종양 세포를 배출하여 순환계로 내장하는 과정, 혈액 내 생존, 표적 장기에서의 외부혈관 및 생존, 증식 상태의 재침투 및 파출 증식을 포함하는 복잡한 과정이다¹. 전이의 초기 또는 말기를 조사하기 위해 자발적이고 이식 가능한 쥐암 모델이 사용되었으며, 각각의 장점과 단점이 있으며, 이에 대해서는 철저히 논의되었습니다 ^2,3,4.

이전에 생각했던 것과는 달리, 종양 세포는 종양 발달 중 초기 단계에서 원발성 종양을 포기하며, 때로는 오랜 기간 동안 먼 조직의 휴면 상태로 남아 있기도 한다 5,6,7,8. 또한, 원발성 종양이 질병 결과에 미치는 강력한 전신 효과에 대한 증거가 증가하고 있으며, 이는 종종 전이성 토양을 조절하거나 악액질 9,10,11,12 동안 근육 소모를 자극하는 용해성 인자와 엑소좀의 분비를 통해 나타납니다. 이러한 이유로, 원발성 종양의 초기 존재에서 전이 과정의 길이를 모델링하는 것은 이러한 과정을 주도하는 생물학에 대한 보다 완전한 이해를 달성하고 과정을 중단시키거나 지연시키는 것을 목표로 하는 잠재적인 새로운 개입을 테스트하는 데 필수적이 되었습니다.

이 연구에서는 유선에 orthotopically 주입된 추적 가능한 세포주에서 자발적으로 발생하는 폐 전이를 정량화하기 위한 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 전이성 캐스케이드에서 위의 모든 단계를 모델링하는 프로세스입니다. 이식 가능한 전이 모델은 자발적이고 유전적으로 주도되는 암 모델에 비해 인간 전이를 더 잘 대표하는 것으로 알려져 있어 임상적 번역 가능성이 향상된다². 또한 이 프로토콜은 생물 발광 이미징을 활용하여 살아있는 동물 내에서 원발성 유방 종양의 자발적 폐 전이의 성장 및 진행을 실시간으로 연구하므로 전이성 전파에 대한 보다 전통적인 조직학 기반 평가보다 효율성을 향상시킵니다. 이 프로토콜에는 원발성 종양을 외과적으로 제거한 후 자발적 전이에 대한 평가도 포함되며, 이는 임상적으로 관련성이 있을 뿐만 아니라 연구자가 전이 과정에 대한 최소 잔류 질환의 영향을 연구할 수 있도록 합니다. 마지막으로, 면역력이 있는 마우스의 사용은 인간 생물학^10,11의 경우와 같이 온전한 면역 체계가 전이 과정을 형성할 수 있도록 하는 이점을 제공합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 절차 및 프로토콜은 버지니아 커먼웰스 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 주입을 위한 세포의 준비

1. 액체 질소 저장고에서 루시페라아제 형질주입된 EO771 세포¹³ 을 해동하고 10cm 조직 배양 접시에 플레이트 1 x 10⁶ 세포를 완전한 세포 배양 배지(RPMI1640 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 B)에서 해동합니다.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 80 % -90 % 합류 할 때까지 배양하고 필요에 따라 2-3 일마다 매체를 교체합니다.
3. 세포를 채취하려면 세포 배양 배지를 흡인하고 1x PBS로 세척합니다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 약 2-3분 동안 0.25% Trypsin-EDTA 용액 2mL로 배양한 다음 8mL의 완전한 배지로 세척하여 반응을 담금질합니다.
   참고: 트립신에 세포가 장기간 노출되면 세포막에서 세포 표면 단백질이 벗겨져 궁극적으로 세포 사멸을 유발합니다.
4. 내용물을 10mL 원심분리 튜브로 옮기고 350 x g 에서 5분 동안 회전하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 흡입하고 1x PBS의 10mL에 세포를 재현탁시킵니다.
5. 계수를 위해 50μL 샘플을 채취한 다음 5분 동안 350 x g 에서 회전하여 세포를 다시 펠렛합니다.
   1. 세포가 원심분리하는 동안 50μL 샘플에 50μL의 트리판 블루를 추가하고 혈량계를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 온전한 세포막을 가진 생존 가능한 세포는 염료를 배제하고 트리판 블루를 첨가한 후에도 투명하게 유지되는 반면, 죽어가거나 죽은 세포는 염료가 세포질에 들어가 파란색으로 변할 수 있도록 합니다.
   2. 다음 공식을 사용하여 6 x 10⁶ viable cells/mL(viable cell concentration [viable cells/mL])에서 세포를 재현탁하는 데 필요한 부피를 결정합니다.
      16개의 사각형으로 구성된 4세트의 평균 생존 가능한 세포 수 × 희석 계수 × 1 x 10⁴ cells/mL
6. 상층액을 흡인하고 세포를 6 x 10⁶ cells/mL로 희석하는 데 필요한 계산된 부피에서 멸균 1x PBS로 세포를 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 주입할 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오.

2. 유방 지방 패드 주사

참고: 본 프로토콜은 모든 마우스 균주에 사용할 수 있지만 면역 미세환경에 대한 관심을 고려하여 C57BL6 마우스를 사용합니다. 6-8주령의 암컷, 처녀 마우스는 일반적으로 유방암 연구에 사용되며, 이는 동등성이 종양 형성 과정을 향상시키기 때문입니다.

1. 성장 인자 감소 기저막 매트릭스를 얼음 위에서 해동하고 주입할 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오.
2. 4%-5% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기 반사가 없는지 평가하여 충분한 마취면을 확인하고 시술 중 유지를 위해 가스를 2% 이소플루란으로 낮춥니다.
   주의: 이소플루란은 무취 흡입 마취제로 눈과 피부에 자극을 주고 중추 신경계에 독성이 있는 것으로 알려져 있습니다. 환기가 잘 되는 환경에서 사용해야 합니다. 이소플루란에 장기간 또는 만성적으로 노출되면 건강에 악영향을 미칠 수 있습니다. 적절하게 보정되고 가스 청소 시스템을 사용하며 수의사 직원이 자주 유지 관리하는 수의학 마취 장비를 사용해야 합니다.
3. 전기 가위를 사용하여 쥐의 복부에 있는 털을 면도한 다음 유지 관리 이소플루란 비율 2%를 사용하여 마취 기계에 부착된 코콘에 앙와위 위치에 놓습니다. 각막 손상을 방지하기 위해 동물의 각 눈에 안과 연고를 바르십시오.
4. 70% 에탄올과 포비돈-요오드 용액을 번갈아 가며 원을 그리며 복부 부위를 세 번 외과적으로 문지릅니다. 발가락 꼬집기 반사가 없는지 평가하여 충분한 마취 평면을 확인합니다.
5. 가위를 사용하여 4번째 유방 조직 수준에서 복부 피부를 통해 작은 정중선 절개(보통 ~1cm)를 만들어 기저 복막을 노출시키지만 관통하지는 않습니다.
   참고: 유선에 종양 세포를 이식하기 위한 다른 절차, 예를 들어 피하 주사 또는 관내 접종이 활용될 수 있습니다. 다소 침습적이기는 하지만 이 수술 절차는 배우고 숙달하기 쉬우며, 지방 패드를 시각화하면 정확도가 크게 향상되고 유선외부로 주입될 위험이 거의 없어 종양을 효과적으로 제거하는 데 중요합니다.
6. 집게를 사용하여 피부를 복막에서 멀리 떨어뜨립니다. 멸균 식염수를 적신 면봉을 사용하여 복막에서 피부를 분리하고 측면으로 이동하여 오른쪽 유방 지방 패드를 노출시킵니다. 왼쪽을 반복하여 왼쪽 유방 지방 패드를 노출시킵니다.
7. 수동 피펫을 사용하여 EO771 세포 현탁액을 재현탁하고 100μL를 새로운 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 같은 양의 기저막 매트릭스 용액을 추가하고 잘 섞으면서 기포가 생기지 않도록 주의하고 얼음에 보관합니다. 최종 셀 현탁액에는 이제 50μL당 150,000개의 셀이 포함됩니다.
8. 100μL의 세포 현탁액을 28G 0.5mL U-100 인슐린 주사기에 넣고 얼음 위에 보관합니다.
9. 겸자를 사용하여 피부를 들어 올리고 오른쪽 유방 지방 패드를 부드럽게 잡아 노출시킵니다. 50μL의 세포 현탁액을 유방 지방 패드에 주입하고 유방 지방 패드에서 주사기를 제거하기 전에 3-5초 동안 기다렸다가 매트릭스가 응고되기 시작하고 세포 현탁액이 주입 부위를 통해 역류할 가능성을 줄입니다. 주입이 끝나면 작은 기포가 형성됩니다.
10. 집게에서 피부를 떼어내어 유방 지방 패드가 자연스럽게 정상 위치로 돌아갈 수 있도록 합니다. 왼쪽 유방 지방 패드로 절차를 반복하고 주사 사이에 세포 현탁액이 들어있는 주사기를 다시 얼음 위에 놓습니다.
11. 피부 절개 부위를 봉합하고 피부 스테이플을 붙입니다. 절개 길이에 따라 필요한 피부 스테이플의 수가 결정되며, 대부분의 시술은 절개 부위당 1-2개의 스테이플이 필요합니다. 스테이플 사이에 최소 0.5cm의 거리가 있는지 확인하십시오.
12. 수술이 봉합되면 마우스를 깨끗한 회수 케이지로 옮깁니다. 동물이 스스로 권리를 행사하고 정상적인 행동을 재개할 때까지 필요에 따라 모니터링하십시오. 통증 조절을 위해 40μL의 멜록시캠(2mg/mL)을 3일 동안 24시간마다 피하로 투여합니다. 또는 부프레노르핀과 같은 오피오이드의 서방형 제형 용량을 시술 시 투여할 수 있으며, 이는 72시간 동안 지속됩니다.
13. 수술 후 처음 5일 동안 매일 동물을 모니터링하여 동물의 체중과 관리되지 않은 털, 구부러진 등, 적갈색의 코 또는 안구 분비물과 같은 고통의 징후를 평가합니다.
14. 수술 부위의 홍반이나 괴사와 같은 상처 감염의 징후가 있는지 동물에게 확인하고, 초기 체중의 >20%가 감소하거나 기관별 IACUC 지침에 설명된 심각한 고통 기준을 충족하는 동물을 인도적으로 희생합니다.

3. 종양 절제

1. 캘리퍼스를 사용하여 원발성 종양 길이(L)와 너비(W)를 측정하여 주당 3회 기립성 유방 종양 병변의 성장을 모니터링합니다. 다음 공식을 사용하여 종양 부피를 계산합니다.
   π LW²/6
   1. 주입된 특정 세포주에 따라 종양 절제를 경험적으로 결정합니다. 재성장 가능성을 줄이기 위해 항상 가능한 가장 작은 크기로 종양을 제거하십시오. 이 프로토콜에 설명된 EO771 세포의 경우 종양의 부피가 150mm3에 도달하면 종양 절제를 수행합니다.
      참고: 최적의 절제 시기는 개별 세포주에 대해 결정해야 하지만, 사용자가 경험을 쌓으면 모든 종양을 효율적으로 절제할 수 있기 때문에 150mm3가 좋은 시작점입니다.
2. 4% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다. 통증 조절을 위해 40μL의 멜록시캠(2mg/mL)을 피하로 투여한 다음 유지 이소플루란 비율 2%를 사용하여 마취 기계에 부착된 노즈콘에 마우스를 앙와위 위치에 놓습니다. 각막 손상을 방지하기 위해 동물의 각 눈에 안과 연고를 바르십시오.
   참고: 진통제는 3일 동안 24시간마다 투여해야 합니다. 또는 부프레노르핀과 같은 오피오이드의 서방형 제형 용량을 시술 시 투여할 수 있으며, 이는 72시간 동안 지속됩니다.
3. 필요한 경우 이전의 수술용 스테이플을 제거하고 70% 에탄올과 포비돈-요오드 용액을 번갈아 가며 사용하여 복부 부위를 원을 그리며 세 번 외과적으로 문지릅니다. 발가락 꼬집기 반사가 없는지 평가하여 충분한 마취 평면을 확인합니다. 가위를 사용하여 4번째 유방 조직 수준에서 복부 피부를 통해 작은 정중선 절개(보통 ~1cm)를 만들어 기저 복막을 노출시키지만 관통하지는 않습니다.
4. 둔기 절개를 사용하여 복막과 피부 위에 있는 기형외과 종양을 분리합니다. 가위를 사용하여 종양에 근접하고 원위부에 위치한 정상 유방 조직을 절단하여 기형외과 종양을 제거하고 종양 조직을 생물학적 위험 백에 버립니다. 반대쪽 종양으로 반복합니다. 출혈이 발생하면 혈관 조직을 빠르게 소작하십시오.
   참고: 정형외과 종양이 복막에 침윤한 경우, 잘 둘러싸여 있지 않거나 둔한 박리로 복막에서 쉽게 분리할 수 없는 종양이 입증된 경우, 종양 제거가 완료되지 않고 다시 자라서 배경 생물 발광 신호와 이환율을 혼동하게 되므로 동물을 희생해야 합니다.
5. 종양 절제 절차 후 동물의 회복을 개선하기 위해 1-3개의 스테이플을 사용하여 수술 부위를 닫고 마우스를 아래에 따뜻한 가열 패드가 있는 깨끗한 회복 케이지로 옮깁니다. 동물이 스스로 권리를 행사하고 정상적인 행동을 재개할 때까지 필요에 따라 모니터링하십시오.
   1. 시술 중 약간의 혈액이 손실된 동물의 경우, 수술 부위를 폐쇄한 후 복강내로 투여하는 멸균 0.9% 생리식염수 300μL 주사를 투여합니다.
   2. 필요한 경우, 4단계에서 설명한 대로 생물 발광 신호에 대해 이 시점에서 동물을 이미지화하여 종양 절제의 완전성 및 기준선 최소 잔류 질환을 평가합니다. 절제가 완료되지 않았고 원발성 종양 부위에 생물 발광 신호가 남아 있는 경우, 남은 종양 세포의 성장으로 인해 배경 생물 발광 신호가 혼동될 수 있으므로 동물을 인도적으로 희생시킵니다.
6. 수술 후 처음 5일 동안 매일 동물을 모니터링하여 동물의 체중과 관리되지 않은 털, 구부러진 등, 적갈색 코 또는 안구 분비물과 같은 고통의 징후를 평가합니다.
7. 수술 부위 홍반 또는 괴사와 같은 상처 감염의 징후와 절개 부위 보호와 같은 동물을 확인하십시오. 초기 체중의 >20%가 감소하거나 기관별 IACUC 지침에 설명된 심각한 고통 기준을 충족하는 동물을 인도적으로 희생합니다.

4. 자발적 폐 전이의 생체 내 정량화

1. 종양 절제 당일 동물의 생체 내 이미징을 수행하여 기준선 신호를 설정한 다음 그 후 주당 2-3회 자발적 전이성 폐 종양 병변의 성장을 평가합니다.
2. Initialize(초기화)를 클릭하여 동물이 절차를 준비하는 동안 워밍업을 위해 이미징 기기를 시작합니다.
3. 4% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기 반사가 없는지 평가하여 충분한 마취 평면을 확인합니다. 산소와 이소플루란 마취가 이미징 기기로 흐르고 있는지 확인합니다.
4. 코에서 45° 각도로 눈의 내측 안각에 바늘을 삽입하여 역궤도 주사를 사용하여 100μL의 D-루시페린 용액(멸균 PBS에서 15mg/mL)을 동물에 주입합니다. 뼈의 저항이 느껴질 때까지 바늘을 삽입하고, 이때 D-루시페린 용액을 주입하기 전에 바늘을 ~1mm 당겨 바늘이 후안와 정맥동 내에 놓이도록 합니다.
   참고: D-루시페린 용액은 복강 내 또는 피하 주사와 같은 다른 경로로 전달될 수 있지만, 기질 대사의 역학이 더 길고 다른 장기로의 분포가 이질적입니다.
5. 배송 시 액체가 다시 세척되지 않아 성공적인 주입을 확인하고 이미징 전에 2분 동안 기다립니다. 기다리는 동안 동물을 누운 자세로 생물 발광 이미저 내부에 위치한 코뿔로 옮기고 이소플루란을 유지율 2%로 줄입니다.
6. 동물의 생물 발광 이미지를 획득하기 전에 사진 옆의 확인란을 선택하여 중간 비닝 및 f/스톱 8을 사용하여 동물의 사진을 동시에 획득해야 합니다. 오버레이(Overlay ) 옆의 확인란이 선택되어 있는지 확인하여 생물 발광 이미지로 사진을 오버레이합니다. 노출 시간을 1분으로 설정하고, 중간 비닝, f/stop = 1로 설정하고, Acquire를 클릭하여 이미지를 캡처합니다.
7. 다음과 같이 광자 플럭스를 측정합니다. 정사각형 ROI 버튼을 클릭하여 이미지에 묘사된 각 동물에 대한 ROI 도구 드롭다운 메뉴를 사용하여 정사각형 ROI를 생성합니다. 자동으로 생성된 ROI를 마우스로 클릭하고 드래그하여 각 동물의 흉부 위로 재배치합니다.
8. Measure ROIs 버튼을 클릭하고 데이터가 카운트가 아닌 광도(광자/초)로 표시되도록 하여 다른 노출 시간으로 획득한 이미지를 비교할 수 있도록 합니다.

5. 조직학적 분석을 위한 폐 조직 수집

참고: 동물은 기관별 IACUC 지침에 따라 실험 시점 또는 동물이 인도적 희생 기준을 충족하는 경우 아래 설명된 대로 희생될 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면, 마우스는 원발성 종양의 절제 후 약 21-28일 후에 인도적인 종점에 도달합니다.

1. 4% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기 반사가 없는지 평가하여 충분한 마취 평면을 확인합니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다.
2. 가위를 사용하여 xyphoid process 아래의 정중선을 절개하고 피부, 근육 조직 및 복막을 절단하여 횡격막이 보일 때까지 흉강의 아래쪽 부분을 노출시킵니다. 횡격막에 구멍을 뚫어 폐를 무너뜨린 다음 횡격막을 절단합니다.
3. 오른쪽과 왼쪽의 흉곽을 절개한 다음 지혈제를 사용하여 자이푸스 돌기를 잡고 흉곽을 밖으로 이동시켜 심장과 폐를 노출시킵니다. 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움을 자릅니다.
4. 좌심실을 통해 얼음처럼 차가운 PBS 10mL를 동물에게 관류하고 우심방에서 흐르는 액체가 투명해지고 간이 옅은 노란색으로 변하는지 확인하여 관류의 완전성을 평가합니다.
5. 기관을 식별하고 22% 파라포름알데히드 3mL가 든 4G 바늘 주사기를 삽입하여 기관과 평행하게 유지합니다. 폐가 완전히 부풀어 오를 때까지 느린 속도로 용액을 전달하십시오. 바늘 위에 집게로 기관을 잡고 역류를 방지하기 위해 바늘을 천천히 제거합니다.
   참고: 정착액을 주입하기 전에 기관 아래에 봉합사를 끼우고 주입 후 기관 주위에 봉합사를 묶는 것은 정착제의 역류를 방지하기 위한 또 다른 옵션일 수 있습니다.
6. 기관을 계속 부드럽게 잡고 집게 위의 가위로 잘라낸 다음 결합 조직을 모두 제거하면서 조직을 조심스럽게 들어 올리기 시작합니다. 폐에서 심장을 절개합니다.
7. 폐 조직을 PBS의 4% 파라포름알데히드에 밤새 넣고 4°C에서 보관하여 고정합니다. 장기 보관을 위해 0.05% 아지드화나트륨이 함유된 PBS로 조직을 옮기거나 필요에 따라 조직학적 분석을 위해 추가로 처리합니다.

결과

마우스의 4번째 유방 지방 패드에 마우스 암 세포주를 정형(orthotopic)으로 주입하는 것은 마우스의 원발성 종양을 유도하기 위한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 절차입니다. 이 프로토콜에 설명된 조건에서 루시페라아제로 transduction된 EO771 세포주를 활용하면 원발성 종양이 촉지되고 주입 후 약 7일 후에 캘리퍼스를 사용하여 측정할 수 있으며 초기 주입 후 약 14일 후에

토론

전이성 전파의 초기 특성과 암의 전신 영향이 더 널리 인식됨에 따라 이러한 두 가지 중요한 요소를 모두 고려하는 모델의 필요성이 대두되고 있습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 원발성 유방 종양에서 자발적으로 발생하는 폐 전이의 최소 잔류 질환 및 발육 결과를 모니터링하여 전이 과정에 영향을 미치는 암의 전신 효과를 설명할 수 있습니다. 원발성 종양 제거...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061