インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

要約

この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。

要約

転移は依然としてがん関連死の主な原因です。転移性カスケードを特徴付ける一連の事象は、治療的介入の複数の機会を提供し、マウスでそれらを正確にモデル化する能力は、それらの効果を評価するために重要です。ここでは、同所性原発性乳房腫瘍の確立と、 その後のin vivo 生物発光イメージングを使用した肺の転移性病変の確立と成長のモニタリングのための段階的なプロトコルが提示されます。この方法論により、原発腫瘍の脱出から肺の伸長まで、転移性発生の全範囲にわたる治療またはその生物学的影響の評価が可能になります。乳房同所性腫瘍は、ルシフェラーゼ標識細胞懸濁液を第4乳腺に注射することによりマウスで生成されます。腫瘍は、特定の時間成長して播種することが許され、その後外科的に切除されます。切除後、肺の自然転移が検出され、 in vivo 生物発光イメージングを使用して経時的な成長が監視されます。目的の実験エンドポイントで、下流の分析のために肺組織を収集できます。臨床的に明らかな転移の確立に対する治療は、IV期がん患者の転帰を改善するために重要であり、実験的肺転移の尾静脈モデルを通じて評価することができる。しかし、転移性播種は乳がんの初期に起こり、多くの患者が手術後に潜在性の無症候性播種性疾患を有する。このような自発的なモデルを利用することで、疾患の全範囲、特に転移前ニッチプライミングなどの原発腫瘍の治療によって引き起こされる全身への影響を研究し、手術後の休眠疾患や無症候性疾患の治療を評価する機会が得られます。

概要

転移(原発腫瘍から体の他の部分へのがん細胞の広がり)は、がん患者の90%以上で依然として死因となっています。このプロセスは複雑で、原発腫瘍からの腫瘍細胞の移動と循環への血管内への浸潤、血液中での生存、標的臓器での血管外漏出と生存、増殖状態の再定着、^{および伸長}1が含まれます。自発的および移植可能なマウスがんモデルは、転移の初期段階または後期段階を調査するために使用されており、それぞれが独自の長所と短所を示しており、これらは徹底的に議論されています^2,3,4。

以前に考えられていたこととは異なり、腫瘍細胞は腫瘍発生の初期段階で原発腫瘍を放棄し、時には長期間にわたって離れた組織で休眠状態のままになることがあります5,6,7,8。さらに、原発腫瘍が疾患の転帰に及ぼす強力な全身的影響の証拠が増えており、多くの場合、転移性土壌を調節するか、悪液質9,10,11,12中の筋肉の消耗を刺激する可溶性因子およびエキソソームの分泌を通じて現れます。これらの理由から、原発腫瘍が最初に存在した状態での転移過程の長さをモデル化することは、これらの過程を推進する生物学をより完全に理解し、過程を中断または遅延させることを目的とした潜在的な新しい介入をテストするために不可欠になっています。

この研究では、乳腺に同所的に注入されたトレーサブルな細胞株から自発的に生じる肺転移を定量化するためのプロトコルが記載されており、これは転移カスケードにおける上記のすべてのステップをモデル化するプロセスである。移植可能な転移モデルは、自然発生的な遺伝的に駆動されるがんモデルと比較して、ヒトの転移をより代表していることが知られており、したがって臨床翻訳性が向上します²。さらに、このプロトコルは生物発光イメージングを利用して、生体内で原発性乳房腫瘍からの自然肺転移の成長と進行をリアルタイムで研究し、従来の組織学に基づく転移性播種の評価よりも効率を向上させます。このプロトコルには、原発腫瘍の外科的切除後の自然転移の評価も含まれており、これは臨床的に関連性があり、研究者が転移プロセスに対する微小残存病変の影響を研究することを可能にします。最後に、免疫適格マウスの使用は、ヒト生物学^10,11の場合のように、無傷の免疫系が転移プロセスを形成できるようにするという利点を与える。

プロトコル

ここに記載されているすべての動物の手順とプロトコルは、バージニアコモンウェルス大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 注射用細胞の調製

1. 液体窒素貯蔵からルシフェラーゼ形質導入したEO771細胞¹³ を解凍し、10cmの組織培養皿で1 x 10⁶ 細胞を完全な細胞培養培地(RPMI1640 + 10%FBS + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン+ 1%アムホテリシンB)でプレート化します。
2. 37°Cおよび5%_CO2 で80%〜90%のコンフルエントになるまでインキュベートし、必要に応じて2〜3日ごとに培地を交換します。
3. 細胞を回収するには、細胞培養培地を吸引し、1x PBSで洗浄します。2 mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液と2 mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液と37°Cで約2〜3分間インキュベートし、細胞が剥離するまでインキュベートし、8 mLの完全培地で洗浄して反応をクエンチします。
   注:トリプシンへの細胞の長時間の曝露は、膜から細胞表面タンパク質の剥離をもたらし、最終的には細胞死を引き起こします。
4. 内容物を10 mLの遠心チューブに移し、350 x g で5分間回転させて細胞をペレット化します。上清を吸引し、細胞を1x PBSの10 mLに再懸濁します。
5. 計数のために50 μLのサンプルを採取し、その後、350 x g で5分間回転させて細胞を再ペレット化します。
   1. 細胞を遠心分離している間に、50 μLのサンプルに50 μLのトリパンブルーを加え、血球計算盤を使用して生細胞の数をカウントします。細胞膜が無傷の生細胞は、トリパンブルーの添加後も色素を排除して透明なままであり、死にかけている/死んだ細胞は、色素が細胞質に入り、青色に変わることを可能にします。
   2. 以下の式を使用して、6 x 10⁶ 生細胞/mL で細胞を再懸濁するために必要な容量 (生細胞濃度 [生細胞/mL]) を決定します。
      16 平方 4 セットの平均生細胞数 × 希釈係数 ×1 x 10⁴ 細胞/mL
6. 上清を吸引し、細胞を6 x 10⁶ 細胞/mLに希釈するのに必要な計算量で、無菌の1x PBSに細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、注射の準備ができるまで氷上に保ちます。

2.乳房脂肪パッド注射

注:本プロトコルは、任意のマウス系統で使用することができるが、免疫微小環境への関心を考慮して、C57BL6マウスを利用する。生後6〜8週齢の雌の処女マウスは、パリティが腫瘍形成プロセスを強化するため、通常、乳がんの研究に使用されます。

1. 成長因子を減少させた基底膜マトリックスを氷上で解凍し、注射の準備が整うまで氷上に保ちます。
2. 4%-5%イソフルランを使用して誘導チャンバーでマウスを麻酔します。つま先つま先つまみ反射の欠如を評価して十分な麻酔面を確認し、処置中のメンテナンスのためにガスを2%イソフルランに下げます。
   注意:イソフルランは無臭の吸入麻酔薬であり、目や皮膚に刺激を与えることが知られており、中枢神経系に有毒です。.十分な換気のある環境で使用する必要があります。イソフルランへの長期または慢性的な曝露は、健康に悪影響を与える可能性があります。.適切に校正され、ガス掃気システムを利用し、獣医スタッフによって頻繁に保守される獣医用麻酔器具を使用する必要があります。
3. 電動バリカンを使用してマウスの腹部の毛を剃り、次に麻酔器に取り付けられたノーズコーンに仰臥位に置き、維持イソフルラン率2%を使用します。角膜損傷を防ぐために、動物の各眼に眼科用軟膏を塗布します。
4. 70%エタノールとポビドンヨード溶液を交互に使用して、腹部を円を描くように3回外科的にこすります。つま先をつまむ反射の欠如を評価することにより、十分な麻酔面を確認します。
5. はさみを使用して、4番目の乳房組織のレベルで腹部の皮膚に小さな正中線切開(通常は~1 cm)を行い、下にある腹膜を露出させますが、貫通しません。
   注:乳腺への腫瘍細胞移植のための他の手順、例えば皮下注射や管内接種など、利用することができます。やや侵襲的ですが、この外科的処置は習得して習得するのが簡単で、脂肪パッドを視覚化すると精度が大幅に向上し、その後の腫瘍の効果的な除去に重要な乳腺の外部に注射するリスクがほとんどありません。
6. 鉗子を使用して、皮膚を腹膜から離します。滅菌生理食塩水に浸した綿棒を使用して、皮膚を腹膜から分離し、横方向に動かして右の乳房脂肪パッドを露出させます。左側で繰り返して、左の乳房脂肪パッドを露出させます。
7. 手動ピペットを使用してEO771細胞懸濁液を再懸濁し、100 μLを新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。等量の基底膜マトリックス溶液を加え、気泡が入らないように注意しながらよく混ぜ、氷の上に保ちます。最終的な細胞懸濁液には、50 μLあたり150,000個の細胞が含まれます。
8. 100 μLの細胞懸濁液を28G 0.5 mL U-100インスリンシリンジに吸引し、氷上に保ちます。
9. 鉗子を使用して、皮膚を持ち上げ、右の乳房脂肪パッドをそっとつかんで露出させます。50μLの細胞懸濁液を乳腺脂肪パッドに注入し、乳房脂肪パッドからシリンジを取り外す前に3〜5秒待ってから、マトリックスが固化し始め、細胞懸濁液が注入部位を逆流する可能性を減らします。注入が終わると小さな気泡ができます。
10. 鉗子から皮膚を離し、乳房の脂肪パッドが自然に正常な位置に戻るようにします。左の乳房脂肪パッドでこの手順を繰り返し、注射の合間に細胞懸濁液を含む注射器を氷に戻します。
11. 皮膚の切開部を閉じ、皮膚のステープルを塗布します。切開の長さによって必要な皮膚ステープルの数が決まりますが、ほとんどの手順では、切開ごとに1〜2つのステープルが必要です。ステープル間の距離が0.5cm以上あることを確認してください。
12. 外科的閉鎖後、マウスを清潔なリカバリーケージに移します。動物の権利自体が通常の行動に戻るまで、必要に応じて監視します。40μLのメロキシカム(2 mg / mL)を皮下投与して、24時間ごとに3日間痛みをコントロールします。.あるいは、ブプレノルフィンのようなオピオイドの徐放性製剤用量を処置時に投与することができ、これは72時間持続します。
13. 手術後最初の5日間は毎日動物を監視し、動物の体重と、手入れの行き届いていない毛皮、猫背、赤褐色の鼻または眼の分泌物などの苦痛の兆候を評価します。
14. 手術部位の紅斑や壊死、切開部位の保護など、創傷感染の兆候がないか動物を確認し、初期体重の>20%を失った動物、または施設固有のIACUCガイドラインに記載されている重度の苦痛の基準を満たす動物を人道的に犠牲にしてください。

3. 腫瘍切除術

1. ノギスを使用して、原発腫瘍の長さ(L)と幅(W)を測定することにより、同所性乳房腫瘍病変の成長を週に3回監視します。次の式を使用して腫瘍体積を計算します。
   πLW²/6
   1. 注入された特定の細胞株に応じて、腫瘍の切除を経験的に決定します。再成長の可能性を減らすために、常に可能な限り小さいサイズで腫瘍を切除してください。このプロトコルに記載されているEO771細胞については、腫瘍が体積で150 mm³ に達したときに腫瘍切除を行います。
      注:最適な切除時間は個々の細胞株ごとに決定する必要がありますが、150 mm³ は、ユーザーが経験するとすべての腫瘍を効率的に切除できるため、開始点として適しています。
2. 4%イソフルランを使用して誘導チャンバーでマウスを麻酔します。疼痛管理のために40μLのメロキシカム(2 mg / mL)を皮下投与し、麻酔器に取り付けられたノーズコーンにマウスを仰臥位に置き、維持イソフルラン率2%を使用します。角膜損傷を防ぐために、動物の各眼に眼科用軟膏を塗布します。
   注:鎮痛剤は24時間ごとに3日間投与する必要があります。.あるいは、ブプレノルフィンのようなオピオイドの徐放性製剤用量を処置時に投与することができ、これは72時間持続します。
3. 必要に応じて、以前の外科的ステープルを取り外し、70%エタノールとポビドンヨード溶液を交互に使用して、腹部を円を描くように3回外科的にこすります。.つま先をつまむ反射の欠如を評価することにより、十分な麻酔面を確認します。はさみを使用して、4番目の乳房組織のレベルで腹部の皮膚に小さな正中線切開(通常は~1 cm)を行い、下にある腹膜を露出させますが、貫通しません。
4. 鈍的解剖を使用して、同所性腫瘍を腹膜とその上にある皮膚から分離します。腫瘍の近位および遠位に位置する正常な乳腺組織をハサミを使用して切断することにより、同所性腫瘍を切除し、腫瘍組織をバイオハザードバッグに廃棄します。対側腫瘍についても繰り返します。出血が発生した場合は、すぐに血管系を焼灼してください。
   注:同所性腫瘍が腹膜に浸潤している場合、腫瘍が十分に限られていないか、鈍的解剖によって腹膜から容易に分離できない腫瘍によって証明されている場合、腫瘍の除去は完全ではなく、再成長し、背景の生物発光シグナルと罹患率の交絡につながるため、動物を犠牲にする必要があります。
5. 1〜3本のステープルを使用して手術部位を閉じ、マウスを清潔な回復ケージに移し、その下に温かい加熱パッドを付けます。動物の権利自体が通常の行動に戻るまで、必要に応じて監視します。
   1. 手術中に血液がいくらか失われた動物には、手術部位の閉鎖後に腹腔内に投与された滅菌0.9%生理食塩水を300μL注射します。.
   2. 必要に応じて、ステップ4.で説明したように、この時点で動物を生物発光シグナルの画像化し、腫瘍切除の完全性とベースラインの最小残存病変を評価します。切除が不完全で、原発腫瘍領域に生物発光シグナルが残っている場合は、残りの腫瘍細胞の成長がバックグラウンドの生物発光シグナルの交絡を引き起こす可能性があるため、動物を人道的に犠牲にします。
6. 手術後最初の5日間は動物を毎日監視し、動物の体重と、手入れの行き届いていない毛皮、猫背、赤褐色の鼻または眼の分泌物などの苦痛の兆候を評価します。
7. 手術部位の紅斑や壊死、切開部位の保護など、創傷感染の兆候がないか動物を確認してください。初期体重の>20%を失った動物、または施設固有のIACUCガイドラインに記載されている重度の苦痛の基準を満たす動物を人道的に犠牲にすること。

4. 肺自然発生転移の in vivo 定量

5. 組織学的解析のための肺組織の採取

注:動物は、施設固有のIACUCガイドラインに従って、任意の実験時点で、または動物が人道的な犠牲の基準を満たした場合に、以下に説明するように犠牲にすることができます。私たちの経験では、マウスは原発腫瘍の切除後約21〜28日で人道的なエンドポイントに到達します。

1. 4% イソフルランを使用して導入チャンバーでマウスに麻酔をかけ、つま先つま先つまみ反射の欠如を評価することにより、十分な麻酔面を確認します。次に、マウスを頸部脱臼によって安楽死させます。
2. はさみを使用して、キシポイド突起の下に正中線を切開し、皮膚、筋肉組織、腹膜を切開して胸腔の下部を露出させ、横隔膜が見えるまで行います。横隔膜に穴を開けて肺をつぶし、横隔膜を切断します。
3. 右側と左側の胸郭を切断し、次に止血器を使用してキシフス突起をつかみ、胸郭を邪魔にならないように移動して、心臓と肺を露出させます。はさみで右の心房を切り取ります。
4. 左心室に氷冷したPBS10 mLを動物に灌流し、右心房から流れる液体が透明になり、肝臓が淡黄色に変わることを確認して、灌流の完全性を評価します。
5. 気管を特定し、3 mL の 4% パラホルムアルデヒドを入れた 22G ニードルシリンジを挿入し、気管と平行に保ちます。肺が完全に膨らむまで、ゆっくりとしたペースで溶液を送達します。鉗子で気管を針にかざし、逆流を防ぐために針をゆっくりと取り外します。
   注:固定剤を注入する前に気管の下に縫合糸を通し、続いて注射後に気管の周りに縫合糸を結ぶことは、固定剤の逆流を防ぐための別の選択肢であり得る。
6. 気管を優しく保持し続け、鉗子の上でハサミで切り取り、結合組織をすべて取り除きながら組織を慎重に持ち上げ始めます。心臓を肺から離剖します。
7. 肺組織をPBS中の4%パラホルムアルデヒドに一晩置き、4°Cで保存して固定します。組織を0.05%アジ化ナトリウムを含むPBSに移して長期保存するか、必要に応じて組織学的分析のためにさらに処理します。

結果

マウスの第4乳房脂肪パッドへのマウスがん細胞株の同所性注射は、マウス原発腫瘍を誘導するための再現性と信頼性のある手順です。このプロトコルに記載されている条件でルシフェラーゼで形質導入したEO771細胞株を利用すると、原発腫瘍が触知可能になり、注射の約7日後にノギスを使用して測定でき、最初の注射の約14日後に体積で約150mm3に達します(

ディスカッション

転移性播種の初期の性質とがんの全身性影響がより広く認識されるようになるにつれて、これら両方の重要な要因を考慮に入れたモデルの必要性が求められるようになります。このプロトコルにより、研究者は、原発性乳房腫瘍から自然に発生する肺転移の最小限の残存病変と成長を監視することができ、転移プロセスに影響を与える癌の全身影響を説明することが...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061