DiI Dye-Filling كأداة بسيطة وغير مكلفة لتصور الخلايا العصبية الحسية الهدبية في C. ايليجانس

Summary

DiI Dye-fill-Fill هي طريقة شائعة الاستخدام في C. ايليجانس لتصور مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية المهدبة ، مما يسمح بتحديد الطفرات الجينية التي تغير بنية الخلايا العصبية الحسية أو وظيفتها.

Abstract

C. ايليجانس لطالما استخدم كنموذج بسيط ويمكن الوصول إليه لدراسة البنية العصبية والوظائف العديدة للجهاز العصبي. من بين 302 خلية عصبية داخل الجهاز العصبي الخنثى البالغ ، تصنف 60 على أنها خلايا عصبية حسية مهدبة. هذه الخلايا العصبية أساسية لعدد من C. ايليجانس السلوكيات ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر العلاج الكيميائي ، والميكانيكي ، والتناضح ، والتزاوج الذكوري ، وتكوين داور. لعدة عقود حتى الآن ، استخدم أعضاء C. ايليجانس المجتمع الصبغة الحمراء المحبة للدهون DiI لتصور مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية المهدبة التي تتعرض مباشرة للبيئة الخارجية. تدخل هذه الصبغة إلى النهايات المهدبة للخلايا العصبية وتوزع بنمط موحد نسبيا في جميع أنحاء التشعبات وأجسام الخلايا والمحاور. هذه الطريقة البسيطة والقوية تجعل أداة تمريرة أولى ممتازة لتحديد الطفرات الجينية التي تنقل عيوبا هيكلية أو وظيفية في الخلايا العصبية الحسية المهدبة. هنا ، نقدم نسخة مبسطة من طريقة التلوين هذه لتصور ثمانية أزواج من الأمفيد وزوجين من الخلايا العصبية الفاميدية المكشوفة بيئيا في C. ايليجانس. نناقش نصائح لاستخدام هذه الطريقة غير المكلفة لتصوير أنماط ملء الصبغة الخلوية في المخدرة.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) من السهل التلاعب بها ، ولها أوقات توليد سريعة ، ومنخفضة التكلفة للصيانة. بسبب هذه المزايا والعديد من المزايا الأخرى ، C. ايليجانس عملت ككائن حي نموذجي مفضل لدراسة العديد من العمليات البيولوجية ، وخاصة تطور الجهاز العصبي ووظيفته. تم تخصيص عدد كامل في مجلة علم الوراثة العصبية مؤخرا للتأثيرات التاريخية للبحث حول هذا الموضوع^{بالذات 1}. إنها مفيدة بشكل خاص لدراسة وظيفة الأهداب الأولية ، والتي تشارك في استشعار الظروف البيئية الكيميائية^{والفيزيائية 2}.

الخنثى البالغة C. ايليجانس لديها ما مجموعه 302 خلية عصبية ، 60 منها تمتلك أهداب أولية في نهاية عملياتها التغصنية³. تصنف هذه الخلايا العصبية ال 60 المهدبة على أنها خلايا عصبية حسية وتشارك في العديد من سلوكيات C. ايليجانس ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر العلاج الكيميائي ، والميكانيكي ، والتناضح ، والتزاوج الذكوري ، وتكوين dauer^3،4. هناك مجموعتان فرعيتان من الخلايا العصبية الحسية المهدبة التي تتعرض للبيئة الخارجية ، والتي تشمل ستة عشر خلية عصبية مبرمية (8 أزواج) في الرأس وأربعة خلايا عصبية فاسميدية (زوجان) في الذيل^3،5.

لعدة عقود ، استخدم الباحثون في C. ايليجانس المجتمع الأصباغ المحبة للدهون ، مثل الفلورسنت الأحمر 1،1'-ديوكتاديسيل-3،3،3'3'-رباعي ميثيل إندوكاربوسيانين بيركلورات (DiI) ، لتصور عدد من الأنسجة المختلفة في الحية^6،7،8،9. عندما تتعرض ل DiI ، فإن الصبغة تداخل بسهولة وسرعة في غشاء التشعبات والمحاور والأجسام الخلوية ل 20 خلية عصبية أمفيد وفاسميد المكشوفة خارجيا في توزيع موحد نسبيا. عندما تتعرض البرية ل DiI ، يمكن تصور الصبغة في هذه الخلايا العصبية عن طريق التصوير الفلوري خلال فترة زمنية واسعة نسبيا. إذا كان هناك أي تشوهات مورفولوجية أو وظيفية في الأهداب الأولية ، فقد لا تملأ الصبغة الخلايا العصبية بشكل صحيح ، وبالتالي ، قد تظهر الإشارة أضعف في بعض الخلايا أو جميعها أو قد تكون غائبة تماما^6،7،10،11. يمكن أن تكون أي من هذه النتائج مفيدة للأوجه الهيكلية أو الوظيفية التي قد تكون موجودة في الخلايا العصبية الحسية المهدبة للمتغيرات الجينية.

تهدف هذه المخطوطة إلى إظهار السهولة التي يمكن بها استخدام حشو الصبغة في C. ايليجانس لتصور بنية الخلايا العصبية الحسية المهدبة (الشكل 1). قمنا بتطبيق هذه التقنية على البرية الطافرة لتوضيح كيف يمكن للخلفيات الجينية المختلفة أن تظهر مجموعة متنوعة من نتائج ملء الصبغة ، والتي غالبا ما ترتبط بالسلامة الهيكلية أو الوظيفية للخلايا العصبية الحسية المهدبة. نعرض التلوين في 30 دقيقة و 24 ساعة و 48 ساعة بعد ملء الصبغة في مجموعة متنوعة من أعمار المختلفة للمساعدة في تحديد المسار الزمني الأمثل للتصوير الحي. نقدم أيضا أمثلة على الصعوبات التي يمكن أن تنشأ أثناء التلوين والتصوير ونصائح لتجنب نقاط المشكلة هذه. من خلال استخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين في المؤسسات من أي حجم البدء في البناء على أساس بيولوجيا الخلايا العصبية الحسية المهدبة في C. ايليجانس. حشو الصبغة بسيط وفعال من حيث التكلفة بما يكفي ليتم دمجها في الأنشطة المعملية مع الطلاب الجامعيين للسماح لهم بفرصة العمل مع C. ايليجانس والفحص المجهري الفلوري بأقل قدر من الخبرة الفنية السابقة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حفظ كبير للجينات المشاركة في بيولوجيا الأهداب الأولية ، وعلى نطاق أوسع ، وظيفة الخلايا العصبية الحسية بين البشر و C. ايليجانس¹². البحث المستمر حول وظائف الجينات الهدبية والتفاعلات الجينية في C. ايليجانس يمكن أن يوفر في النهاية نظرة ثاقبة لتعقيد الاعتلال الهدبي البشري¹³.

Protocol

1. إعداد الحلول

1. تحضير محلول التبييض. امزج 2 مل من المبيض ، و 500 ميكرولتر من 10 M هيدروكسيد الصوديوم ، و 7.5 مل من dH₂O في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
   ملاحظة: يظل محلول التبييض مستقرا لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند تخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. قم بإعداد المخزن المؤقت M9. امزج 3 جم من KH₂PO₄ و 6 جم من Na₂HPO₄ و 5 جم من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء المعقم والأوتوكلاف للتعقيم. بمجرد أن يبرد تماما إلى RT ، أضف 1 مل من 1 M MgSO₄ المعقم.
3. تحضير محلول مخزون DiI. أضف 10 مجم من DiI إلى 5 مل من ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) للحصول على تركيز نهائي قدره 2 مجم / مل DiI في DMF. DiI حساس للضوء ، لذا قم دائما بتغطية المحاليل بورق الألمنيوم. يمكن تخزين DiI في DMF عند -20 درجة مئوية لسنوات عديدة ولا يتطلب الذوبان بين الاستخدامات.
   تنبيه: DMF قابل للاشتعال وضار عند ملامسته للجلد أو استنشاقه. اعمل مع هذا المحلول تحت غطاء كيميائي ، بعيدا عن اللهب المكشوف ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).

2. عزل السكان المتزامنين عن طريق تحضير التبييض

ملاحظة: اجمع كل المعدات والحلول اللازمة لجميع خطوات العملية قبل البدء. تعتبر مستحضرات التبييض حساسة للغاية للوقت ، لذا فإن الحصول على المواد اللازمة قبل بدء العملية يضمن نجاح البروتوكول.

1. اغسل البالغة غير الجائعة من الأطباق باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت M9. اسمح للحيوانات بالتجمع عند إحدى حواف اللوحة عن طريق إمالة اللوحة قليلا.
   ملاحظة: عادة ، تهدف إلى جمع ~ 50-100 بالغ غير جائع وحاملة للحصول على عائد موثوق به من البيض. ومع ذلك ، يمكن إجراء تحضير التبييض على أي عدد من البالغة تقريبا. يمكن أن يختلف عدد البالغة الحاملة المتاحة للجمع بشكل كبير اعتمادا على الخلفية الجينية للحيوانات. عادة ما ينتج عن عدد أكبر من التي تم جمعها عددا أكبر من البيض.
2. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، اجمع في المخزن المؤقت M9 وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مسمى.
3. الطرد المركزي للحيوانات عند 350 جم لمدة 30 ثانية. هذه السرعة بطيئة بما يكفي لجمع الحية في قاع الأنبوب دون التسبب في أي ضرر.
4. صب معظم المخزن المؤقت M9 الزائد ، تاركا الديدان المجمعة في الجزء السفلي من الأنبوب دون إزعاج.
5. أضف 1 مل من محلول التبييض المحضر واترك تطفو في المحلول حتى تبدأ في التفكك ، مع عكس الأنبوب بانتظام لتشجيع انهيار الأنسجة. شاهد انهيار الأنسجة وإطلاق البويضات عن طريق فحص الأنبوب بشكل دوري تحت مجهر تشريح. تستغرق هذه العملية عادة ما بين 5 دقائق و 10 دقائق.
6. بمجرد أن يحتوي الأنبوب على بويضات تم إطلاقها في الغالب مع بقاء عدد قليل من الأنسجة الحيوانية المرئية ، فإن جهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لجهاز طرد مركزي دقيق قياسي على الطاولة (عادة بين 15,000-21,000 جم) لمدة 30 ثانية لجمع البيض في الأسفل.
7. صب أكبر قدر ممكن من محلول التبييض باستخدام ماصة زجاجية مع الحرص على عدم إزعاج البيض المحبب. أضف 1 مل من المخزن المؤقت M9 لوقف تحلل البيض بواسطة محلول التبييض المتبقي.
   ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 2.6 و 2.7 بسرعة. يمكن أن يؤدي التأخير في الطرد المركزي وإزالة محلول التبييض والغسيل باستخدام المخزن المؤقت M9 إلى انخفاض إنتاجية البيض بسبب التدهور.
8. جهاز الطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 21,000 جم لمدة 30 ثانية. صب المادة الطافية دون إزعاج البيض المحبب.
9. اغسل مرتين أخريين باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت M9 ، مع صب السائل بين كل غسلة دون إزعاج البيض المحبب.
10. بعد الغسيل النهائي ، قم بصب معظم المخزن المؤقت M9 ، ثم أعد تعليق البيض في السائل المتبقي عن طريق تحريك الأنبوب أو رجه بقوة.
11. باستخدام ماصة زجاجية معقمة، انقل قطرة من المحلول الذي يحتوي على البيض إلى سطح صفيحة NGM جديدة مع الإشريكية القولونية. اهدف إلى وضع القطرة بجانب الإشريكية القولونية وإضافة حوالي 100 بيضة لكل طبق. هذه البويضات متزامنة تقريبا في العمر.
    ملاحظة: في الحالات التي يكون فيها محصول البيض مرتفعا بدرجة كافية بحيث يكون الحصول على 100 بيضة لكل قطرة أمرا صعبا ، يمكن إضافة مخزن مؤقت إضافي M9 إلى الأنبوب الذي يحتوي على البيض لتخفيف تركيزها.

3. إجراء تعبئة الصبغة

1. قم بتسمية أكبر عدد ممكن من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل حسب الحاجة لعدد السلالات التي يتم ملؤها بالصبغة. قم بإنشاء أغطية رقائق معدنية لكل أنبوب لحماية محلول DiI الحساس للضوء ، بمجرد إضافته.
2. اغسل في مرحلة النمو المرغوبة من ألواح NGM المتزامنة مع العمر باستخدام ما يقرب من 1 مل من المخزن المؤقت M9. تأكد من أن كل طبق يحتوي على ما يقرب من 100 يفقس من 100 بيضة موضوعة على الطبق أثناء مزامنة التبييض. اجمع في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل المسماة بشكل صحيح.
   ملاحظة: تعمل حشوة الصبغة بشكل جيد في مجموعة متنوعة من مراحل النمو. توضح هذه الدراسة حشو الصبغة في التي تتراوح من مرحلة اليرقات 3 (L3) إلى البالغين (48 ساعة بعد L3).
3. الطرد المركزي عند 350 جم لمدة 30 ثانية لجمعها في قاع الأنبوب.
4. صب المخزن المؤقت M9 دون إزعاج التي تم جمعها في الجزء السفلي من الأنبوب.
5. اغسل مرتين أخريين باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت M9 ، مع صب السائل بين كل غسلة دون إزعاج المجمعة. في الجولة الأخيرة من الغسيل ، قم بصب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 المتبقي في الأنبوب.
6. قم بتغطية جميع الأنابيب بورق الألمنيوم للحماية من التعرض للضوء وأضف 1 ميكرولتر من DiI في DMF مباشرة إلى المخزن المؤقت M9 في كل أنبوب.
   ملاحظة: في حالة تغيير كميات المخزن المؤقت M9 و DiI ، تأكد من الحفاظ على نسبة 1: 200 من DiI في المخزن المؤقت M9.
7. هز أو هز جميع الأنابيب في RT لمدة 2 ساعة.
8. أنابيب الطرد المركزي عند 350 جم لمدة 30 ثانية لجمع في قاع الأنابيب.
9. صب السائل الذي يحتوي على DiI من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. يغسل باستخدام المخزن المؤقت M9 ثلاث مرات ، مع صب السائل بين كل غسلة.
10. بعد الصب من الغسيل النهائي ، انقل بحجم صغير (~ 50 ميكرولتر) من المخزن المؤقت M9 إلى ألواح NGM الطازجة مع الإشريكية القولونية.
11. اسمح للحيوانات بالتعافي بعد تلطيخها على ألواح NGM الطازجة لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم حتى الملاحظة للحفاظ على صبغة DiI. راقب لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد ملء الصبغة دون خسارة كبيرة في إشارة الفلورسنت. عند أو بعد 48 ساعة ، يمكن أن تبدأ الإشارة في التلاشي (انظر الشكل 2).

4. تصوير ملء الصبغة

1. تحضير 2٪ agarose في محلول ماء معقم. قم بإذابة الاغاروز بالكامل باستخدام الميكروويف.
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الاغاروز (2٪) في محلول الماء عدة مرات حتى يزيد فقدان الماء المتكرر من تركيز الاغاروز إلى درجة يصبح فيها المحلول لزجا جدا.
2. احصل على شرائح زجاجية وأغطية مقاس 22 مم × 22 مم لتحضير وسادات الاغاروز. باستخدام ماصة زجاجية ، ضع قطرة صغيرة من الاغاروز المنصهر بنسبة 2٪ في الماء على شريحة زجاجية واحدة وضع زلة غطاء بسرعة فوق قطرة الاغاروز. بمجرد أن تصلب وسادة الاغاروز بالكامل ، قم بإزالة الغطاء ، واترك وسادة الاغاروز على الشريحة الزجاجية.
   ملاحظة: تجنب تكوين الفقاعات في وسادات الاغاروز ، لأنها يمكن أن تعيق تصوير.
3. أضف 5-10 ميكرولتر من المخدر (10 ملي ليفاميزول) إلى سطح وسادة الاغاروز. انقل 5-20 إلى التخدير ، ثم ضع زلة الغطاء مرة أخرى فوق وسادة الاغاروز.
4. راقب باستخدام مجهر فلوري ستيريو و / أو مركب و / أو متحد البؤر ، اعتمادا على المعدات المتاحة واحتياجات الفحص والتصوير. DiI لديه ذروة إثارة عند 550 نانومتر وذروة انبعاث عند 564 نانومتر. وبالتالي ، قم بعرضه باستخدام صبغة رباعي ميثيل رودامين / السيانين 3 / بروتين الفلورسنت الأصفر (TRITC / Cy3 / YFP) متوافق مع مكعب الترشيح.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف إعدادات المجهر المناسبة ، مثل وقت التعرض والكسب وقوة الليزر ، اللازمة للحصول على صور واضحة لتعبئة الصبغة بين أنواع مختلفة من المجاهر ويجب أن يحددها المستخدمون بشكل مستقل لتلبية احتياجاتهم الفريدة.

النتائج

تظهر ديدان N2 البالغة التي تم تصويرها بعد 24 ساعة من ملء الصبغة إشارة فلورية واضحة منتشرة بالتساوي نسبيا في جميع أنحاء الخلايا العصبية البرمائية (الشكل 1 أ ، أ) والخلايا العصبية الفاميدية (الشكل 1 د ، د). ف?...

Discussion

يعتمد حشو الصبغة الناجح على دراسة متأنية لمرحلة النمو والخلفية الوراثية للحيوانات ، بالإضافة إلى الوقت المنقضي حتى التصوير. تعطل بعض الطفرات الجينية بنية و / أو وظيفة الخلايا العصبية الحسية المهدبة المكشوفة خارجيا ، مما يؤدي إلى غير القادرة على صبغ الملء بشكل صحيح. لذلك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)