C.エレガンスの繊毛感覚ニューロンを視覚化するためのシンプルで安価なツールとしてのDiI染料充填

要約

DiI染料充填は、繊毛感覚ニューロンのサブセットを視覚化するために C.エレガンス で一般的に使用される方法であり、感覚ニューロンの構造または機能を変化させる遺伝子変異の同定を可能にします。

要約

C.エレガンスは 、ニューロンの構造と神経系の多くの機能を研究するためのシンプルでアクセス可能なモデルとして長い間使用されてきました。成体の雌雄同体の神経系内の302のニューロンのうち、60は繊毛感覚ニューロンとして分類されます。これらのニューロンは、ケモ、メカノ、オスモセンシング、オスの交配、ダウアー形成など、多くの C.エレガンスの 行動の中心です。数十年前から、 C.エレガンス コミュニティのメンバーは、赤色蛍光親油性色素DiIを使用して、外部環境に直接さらされる繊毛感覚ニューロンのサブセットを視覚化してきました。この色素はニューロンの繊毛端に入り、樹状突起、細胞体、および軸索全体に比較的均一なパターンで分布します。このシンプルで強力な方法は、繊毛感覚ニューロンに構造的または機能的な欠陥を付与する遺伝子変異体を特定するための優れた初回通過ツールとなります。ここでは、 C. elegansで環境にさらされる8対の両生類ニューロンと2対のファスミドニューロンを視覚化するための、この染色方法の合理化版を紹介します。麻酔をかけた動物の細胞色素充填パターンをイメージングするために、この安価な方法を使用するためのヒントについて説明します。

概要

Caenorhabditis elegans (C.elegans)は、操作が簡単で、生成時間が速く、維持費が安価です。これらの利点と他の多くの利点により、 C.エレガンスは 、多くの生物学的プロセス、特に神経系の発達と機能を研究するための好ましいモデル生物として機能してきました。Journal of Neurogenetics誌の号全体が、最近、この特定のトピックに関する研究の歴史的影響に捧げられました¹。これらは、化学的および物理的環境条件の感知に関与する一次繊毛の機能を研究するのに特に有益です²。

成体の雌雄同体C.エレガンスは合計302個のニューロンを持ち、そのうち60個は樹状突起の最後に一次繊毛を持っています³。これらの60の繊毛ニューロンは感覚ニューロンとして分類され、ケモ、メカノ、浸透圧、雄の交配、およびダウ^{アー形成3,4}を含むがこれらに限定されない多くのC.エレガンスの行動に関与しています。外部環境にさらされる繊毛感覚ニューロンには2つのサブセットがあり、これには頭部の16個の両性ニューロン(8対)と尾部の4つのファスミドニューロン(2対)が含まれる^3,5。

数十年にわたり、C.エレガンスコミュニティの研究者は、赤色蛍光1,1'-ジオクタデシル-3,3,3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)などの親油性染料を使用して、生きた動物のさまざまな組織を視覚化してきました6,7,8,9。動物がDiIに曝露されると、色素は、外部からばく露された20の両生類およびファスミドニューロンの樹状突起、軸索、および細胞体の膜に比較的均一な分布で容易かつ迅速に挿入されます。野生型の動物がDiIに曝露されると、比較的広い時間で蛍光イメージングによってこれらのニューロンで色素を視覚化できます。一次繊毛に形態学的または機能的な異常がある場合、色素はニューロンを適切に充填しない可能性があり、したがって、シグナルの一部またはすべての細胞で弱く見えるか、または完全に欠如する可能性があります^6,7,10,11。これらの結果はいずれも、遺伝的変異の繊毛感覚ニューロンに存在する可能性のある構造的または機能的欠損の情報を提供する可能性があります。

この論文は、C. elegansで繊毛感覚ニューロンの構造を視覚化するために、染料充填を容易にできることを実証することを目的としています(図1)。この手法を野生型動物と突然変異動物に適用して、さまざまな遺伝的背景がさまざまな色素充填結果を示す方法を示し、多くの場合、繊毛感覚ニューロンの構造的または機能的完全性に関連しています。さまざまな動物の年齢で、色素充填後30分、24時間、および48時間での染色を示し、ライブイメージングの最適な時間経過を決定するのに役立ちます。また、染色やイメージング中に発生する可能性のある問題の例と、これらの問題点を回避するためのヒントも提供します。この方法を使用することで、あらゆる規模の機関の研究者が、C.エレガンスにおける繊毛感覚ニューロン生物学の基礎を築き始めることができます。染料の充填は、学部生の研究室活動に組み込むのに十分なほどシンプルで費用対効果が高く、最小限の事前の技術的専門知識でC.エレガンスや蛍光顕微鏡を扱う機会を得ることができます。さらに、一次繊毛生物学、より広くはヒトとC.エレガンスとの間の感覚ニューロン機能に関与する遺伝子の有意な保存があります¹²。C.エレガンスにおける繊毛遺伝子機能と遺伝的相互作用に関する継続的な研究は、最終的にヒトの繊毛症の複雑さについてより深い洞察を提供する可能性があります¹³。

プロトコル

1. 溶液の調製

1. 漂白剤溶液を準備します。2 mLの漂白剤、500 μLの10 M NaOH、および7.5 mLのdH₂Oを15 mLの遠心分離チューブに混ぜ合わせます。
   注:漂白剤溶液は、室温(RT)で保存すると最大1週間安定します。
2. M9 バッファーを準備します。3 gのKH₂PO₄、6 gのNa₂HPO₄、および5 gのNaClを1 Lの滅菌水およびオートクレーブに混ぜ合わせて滅菌します。RTまで完全に冷却したら、滅菌済みの1 M MgSO₄ 1 mLを1 mL加えます。
3. DiIストック溶液を準備します。10 mgのDiIを5 mLのジメチルホルムアミド(DMF)に加えて、DMF中の最終濃度を2 mg/mLにします。DiIは感光性があるため、常に溶液をアルミホイルで覆ってください。DMF中のDiIは、-20°Cで長年保存でき、使用間の解凍は必要ありません。
   注意: DMFは、皮膚に接触したり吸入したりすると、可燃性で有害です。この溶液は、化学フードの下、直火から離し、適切な個人用保護具(PPE)を着用して作業してください。

2. 漂白剤調製による同期集団の単離

注意: 開始する前に、プロセスのすべてのステップに必要なすべての機器とソリューションを収集します。漂白剤の調製は非常に時間に敏感であるため、プロセスを開始する前に必要な材料を用意しておくと、プロトコールの成功が保証されます。

1. 飢餓状態の妊娠した成体動物を、1 mLのM9緩衝液を使用して皿から洗い流します。プレートを少し傾けて、動物がプレートの一方の端に集まるようにします。
   注:通常、飢餓状態で妊娠した成体動物を50~100匹集めることを目標に、信頼性の高い卵の収量を確保します。しかし、漂白剤の調製は、ほぼ任意の数の妊娠した成体動物に対して行うことができます。収集可能な妊娠した成体の動物の数は、動物の遺伝的背景によって大きく異なります。通常、収集された動物の数が多いほど、卵の数が多くなります。
2. ガラス製のパスツールピペットを使用して、M9バッファー中の動物を回収し、標識された1.5 mL微量遠心チューブに移します。
3. 動物を350gで30秒間遠心分離します。この速度は、チューブの底に生きた動物を害を及ぼすことなく集めるのに十分な速度です。
4. 余分なM9バッファーの大部分をデカントし、チューブの底に集めたワームを邪魔せずに残します。
5. 調製した漂白剤溶液1mLを加え、動物が崩壊し始めるまで溶液に浮かべ、チューブを定期的に反転させて組織の破壊を促進します。卵子の組織の分解と放出は、解剖顕微鏡でチューブを定期的にチェックして観察します。このプロセスには通常5分から10分かかります。
6. チューブにほとんど放出された卵が含まれ、目に見える動物組織がほとんど残っていない場合は、標準的な卓上微量遠心分離機(通常は15,000〜21,000 g)の最高速度で30秒間遠心分離し、底部に卵を収集します。
7. ガラスピペットを使用して、ペレット状の卵を邪魔しないように注意しながら、できるだけ多くの漂白剤溶液をデカントします。M9バッファー1mLを添加して、残りの漂白剤溶液による卵子の分解を止めます。
   注:手順2.6と2.7は迅速に実行する必要があります。遠心分離、漂白剤溶液の除去、M9バッファーによる洗浄の遅延は、劣化による卵の収量の低下につながる可能性があります。
8. チューブを再度21,000gで30秒間遠心分離します。ペレット状の卵を邪魔せずに上清をデカントします。
9. 1 mLのM9バッファーでさらに2回洗浄し、ペレット状の卵を乱さずに各洗浄の間に液体をデカンタします。
10. 最終洗浄後、M9バッファーの大部分をデカントし、チューブをフリックするか激しく振って卵を残りの液体に再懸濁します。
11. 滅菌ガラスピペットを使用して、卵を含む溶液を一滴、 大腸菌を入れた新鮮なNGMプレートの表面に移します。ドロップを 大腸菌 の隣に置き、プレートごとに約100個の卵を追加することを目指します。これらの卵は年齢がほぼ同期しています。
    注:卵の収量が十分に高く、1滴あたり100個の卵を得るのが難しい場合は、卵の入ったチューブに追加のM9バッファーを追加して、卵の濃度を希釈することができます。

3. 染料の充填手順

1. 1.5 mLの微量遠心チューブには、色素を充填する菌株の数に応じて必要な数だけラベルを付けてください。各チューブにホイルカバーを作成して、追加した光感受性DiI溶液を保護します。
2. 年齢同期したNGMプレートから所望の発育段階の動物を、約1 mLのM9バッファーを用いて洗浄します。漂白剤の同期中にプレートに配置された100個の卵から孵化した約100匹の動物が各プレートに含まれていることを確認してください。動物を適切にラベル付けした1.5mLの微量遠心チューブに集めます。
   注:染料充填は、さまざまな発達段階でうまく機能します。この研究では、幼虫のステージ3(L3)から成虫(L3の48時間後)までの動物における染料充填が実証されています。
3. 動物を350 g で30秒間遠心分離し、チューブの底に集めます。
4. チューブの底に集められた動物を邪魔せずにM9バッファーをデカントします。
5. 1 mLのM9緩衝液でさらに2回洗浄し、採取した動物を邪魔することなく、各洗浄の間に液体をデカントします。最後の洗浄ラウンドで、デカントしてチューブ内に残っている200μLのM9バッファーを残します。
6. 光への曝露から保護するためにすべてのチューブをアルミホイルで覆い、DMF中のDiI1 μLを各チューブのM9バッファーに直接追加します。
   注意: M9 バッファーと DiI の量を変更する場合は、M9 バッファーの DiI の比率が 1:200 であることを確認してください。
7. RTですべてのチューブを2時間揺らしたり振ったりします。
8. チューブを350 g で30秒間遠心分離し、チューブの底に動物を収集します。
9. DiIを含む液体を微量遠心チューブからデカントします。M9バッファーで3回洗浄し、各洗浄の間に液体をデカントします。
10. 最終洗浄からデカンティングした後、少量(~50 μL)のM9バッファー中の動物を 大腸菌を含む新鮮なNGMプレートに移します。
11. 新鮮なNGMプレートで少なくとも30分間染色した後、動物が回復するのを待ちます。DiIの汚れを保つために、観察までプレートをアルミホイルで覆います。色素充填後24時間までの動物を観察し、蛍光シグナルを有意に失うことなく観察できます。48時間後、信号はフェードし始める可能性があります( 図2を参照)。

4. イメージング色素充填

1. 滅菌水溶液に2%アガロースを調製します。電子レンジを使用してアガロースを完全に溶解します。
   注:水溶液中のアガロース(2%)は、繰り返しの水損失によってアガロース濃度が増加し、溶液が粘り気過剰になるまで、複数回再利用できます。
2. スライドガラスと22 mm x 22 mmのカバースリップを入手して、アガロースパッドを準備します。ガラスピペットを使用して、溶融した2%アガロースを水に少量滴下し、片方のスライドガラスに置き、アガロース液滴の上にカバースリップをすばやく置きます。アガロースパッドが完全に固まったら、カバースリップを取り外し、アガロースパッドをスライドガラスの上に置きます。
   注:アガロースパッドに気泡が形成されると、動物のイメージングが妨げられる可能性があるため、避けてください。
3. アガロースパッドの表面に5〜10μLの麻酔薬(10 mMレバミゾール)を加えます。5〜20匹の動物を麻酔薬に移し、カバースリップをアガロースパッドの上に戻します。
4. ステレオ蛍光顕微鏡、化合物顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡を使用して動物を観察します。これは、利用可能な機器やスクリーニングおよびイメージングのニーズに応じて異なります。DiIの励起ピークは550 nm、蛍光ピークは564 nmです。したがって、テトラメチルローダミン/シアニン色素3/黄色蛍光タンパク質(TRITC/Cy3/YFP)適合フィルターキューブを使用して観察します。
   注:染料充填の鮮明な画像を得るために必要な露光時間、ゲイン、レーザー出力などの適切な顕微鏡設定は、顕微鏡の種類によって異なる場合があり、ユーザー固有のニーズに合わせて個別に決定する必要があります。

結果

色素充填の24時間後に画像化された成体N2線虫は、両性ニューロン(図1A、A')およびファスミドニューロン(図1D、D')全体に比較的均一に広がる明確な蛍光シグナルを示しています。これらの動物では、両生ニューロンの樹状突起と細胞体を容易に区別することができます。樹...

ディスカッション

xHybridの染色成功は、動物の発生段階と遺伝的背景、およびイメージングまでの経過時間を慎重に考慮することに依存しています。一部の遺伝子変異は、外部に露出した繊毛感覚ニューロンの構造および/または機能を混乱させ、その結果、動物は適切に充填物を染色できなくなります。したがって、新規 のC.エレガンス 変異体の色素充填は、感覚ニューロンの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)