DiI 염료 충전은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 섬모 감각 뉴런을 시각화하기 위한 간단하고 저렴한 도구입니다.

요약

DiI 염료 충전은 섬모된 감각 뉴런의 하위 집합을 시각화하기 위해 예쁜꼬마선충에서 일반적으로 사용되는 방법으로, 감각 뉴런 구조나 기능을 변경하는 유전적 돌연변이를 식별할 수 있습니다.

초록

예쁜꼬마선충(C. elegans )은 신경 세포의 구조와 신경계의 많은 기능을 연구하기 위한 간단하고 접근하기 쉬운 모델로 오랫동안 사용되어 왔습니다. 성인 자웅동체 신경계 내의 302개의 뉴런 중 60개는 섬모 감각 뉴런으로 분류됩니다. 이 뉴런은 화학(chemo), 기계(mechano) 및 삼투감지(osmosensing), 수컷 짝짓기(mating) 및 다우어(dauer) 형성을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 행동의 중심입니다. 지금까지 수십 년 동안 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 군집의 구성원들은 적색 형광 친유성 염료 DiI를 사용하여 외부 환경에 직접 노출되는 섬모 감각 뉴런의 하위 집합을 시각화해 왔습니다. 이 염료는 뉴런의 섬모 말단으로 들어가 수상돌기, 세포체 및 축삭돌기 전체에 비교적 균일한 패턴으로 분포합니다. 이 간단하고 강력한 방법은 섬모 감각 뉴런에 구조적 또는 기능적 결함을 부여하는 유전적 돌연변이를 식별하는 훌륭한 1차 통과 도구입니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충에서 환경적으로 노출된 8쌍의 양서류와 2쌍의 파스미드 뉴런을 시각화하기 위해 이 염색 방법의 간소화된 버전을 제시합니다. 마취된 동물에서 세포 염료 충전 패턴을 이미징하기 위해 이 저렴한 방법을 사용하는 방법에 대해 논의합니다.

서문

예쁜꼬마선충 (C. elegans)은 조작하기 쉽고 생성 시간이 빠르며 유지 관리 비용이 저렴합니다. 이러한 장점과 다른 많은 장점으로 인해 예쁜꼬마선충은 많은 생물학적 과정, 특히 신경계의 발달과 기능을 연구하는 데 선호되는 모델 유기체로 사용되었습니다. 신경유전학 저널(Journal of Neurogenetics)의 최근 한 호는 이 특정 주제에 대한 연구의 역사적 영향에 전념했습니다¹. 그들은 화학적, 물리적 환경 조건을 감지하는 데 관여하는 일차 섬모의 기능을 연구하는 데 특히 유용합니다².

성체 자웅동체 예쁜꼬마선충은 총 302개의 뉴런을 가지고 있으며, 그 중 60개는 수지상 과정이 끝날 때 원발성 섬모를 가지고 있습니다³. 이 60개의 섬모 뉴런은 감각 뉴런으로 분류되며 화학, 기계, 삼투압, 수컷 짝짓기, 다우어 형성을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 예쁜꼬마선충 행동에 관여합니다 ^3,4. 외부 환경에 노출되는 섬모 감각 뉴런에는 머리에 16개의 양서류 뉴런(8쌍)과 꼬리에 4개의 파스미드 뉴런(2쌍)이 있는 ^3,5개의 하위 집합이 있습니다.

수십 년 동안 예쁜꼬마선충 군집의 연구자들은 적색 형광 1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiI)와 같은 친유성 염료를 사용하여 살아있는 동물의 다양한 조직을 시각화했습니다 6,7,8,9. 동물이 DiI에 노출되면 염료는 비교적 균일한 분포로 외부에 노출된 20개의 양엽 및 파스미드 뉴런의 수상돌기, 축삭돌기 및 세포체의 막에 쉽고 빠르게 삽입됩니다. 야생형 동물이 DiI에 노출되면 비교적 넓은 시간 동안 형광 이미징을 통해 이러한 뉴런에서 염료를 시각화할 수 있습니다. 원발성 섬모에 형태학적 또는 기능적 이상이 있는 경우, 염료가 뉴런을 제대로 채우지 못할 수 있으며, 따라서 일부 또는 모든 세포에서 신호가 약하게 나타나거나 완전히 없을 수 있습니다 6,7,10,11. 이러한 결과는 유전적 변이의 섬모 감각 뉴런에 존재할 수 있는 구조적 또는 기능적 결함에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

이 원고는 섬모가 있는 감각 뉴런의 구조를 시각화하기 위해 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 염료 충전을 쉽게 사용할 수 있음을 입증하는 것을 목표로 합니다(그림 1). 우리는 이 기술을 야생형 동물과 돌연변이 동물에 적용하여 서로 다른 유전적 배경이 어떻게 섬모 감각 뉴런의 구조적 또는 기능적 무결성과 관련된 다양한 염료 충전 결과를 보여줄 수 있는지 보여주었습니다. 다양한 동물의 연령에서 염색 충전 후 30분, 24시간 및 48시간의 염색을 보여주어 라이브 이미징을 위한 최적의 시간 경로를 결정하는 데 도움을 줍니다. 또한 염색 및 이미징 중에 발생할 수 있는 어려움의 예와 이러한 문제 지점을 방지하기 위한 팁을 제공합니다. 이 방법을 사용함으로써 모든 규모의 기관의 연구자들은 예쁜꼬마선충의 섬모 감각 뉴런 생물학의 기초를 구축하기 시작할 수 있습니다. 염료 주입은 학부생과 함께 실험실 활동에 통합할 수 있을 만큼 간단하고 비용 효율적이며, 이를 통해 최소한의 사전 기술 전문 지식으로 C. elegans 및 형광 현미경으로 작업할 수 있는 기회를 얻을 수 있습니다. 또한, 원발성 섬모 생물학에 관여하는 유전자가 유의미하게 보존되어 있으며, 더 넓게는 인간과 예쁜꼬마선충(C. elegans) 사이에 감각 뉴런 기능이 활성화되어 있다 ¹². 예쁜꼬마선충의 섬모 유전자 기능과 유전적 상호작용에 대한 지속적인 연구는 궁극적으로 인간 섬모병증의 복잡성에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있을 것이다¹³.

프로토콜

1. 솔루션 준비

1. 표백제 용액을 준비합니다. 15mL 원심분리 튜브에 표백제 2mL, 10M NaOH 500μL 및 dH_2O7.5mL를 결합합니다.
   알림: 표백제 용액은 실온(RT)에서 보관할 때 최대 1주일 동안 안정적으로 유지됩니다.
2. M9 버퍼를 준비합니다. 멸균수 1L와 오토클레이브에 KH₂PO₄ 3g, Na₂HPO₄ 6g, NaCl 5g을 결합하여 멸균합니다. RT로 완전히 냉각되면 멸균 1M MgSO₄ 1mL를 추가합니다.
3. DiI 원액을 준비합니다. DMF에서 2mg/mL DiI의 최종 농도를 위해 5mL의 디메틸포름아미드(DMF)에 10mg의 DiI을 추가합니다. DiI는 빛에 민감하므로 항상 용액을 알루미늄 호일로 덮으십시오. DMF의 DiI는 -20°C에서 수년 동안 보관할 수 있으며 사용 사이에 해동할 필요가 없습니다.
   주의: DMF는 피부에 닿거나 흡입될 경우 가연성이며 유해합니다. 화학 물질 후드 아래에서 화염에서 멀리 떨어진 곳에서 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 이 용액으로 작업하십시오.

2. 표백제 제조에 의한 동기화된 개체군의 격리

참고: 시작하기 전에 프로세스의 모든 단계에 필요한 모든 장비와 솔루션을 수집하십시오. 표백제 제제는 시간에 매우 민감하므로 프로세스를 시작하기 전에 필요한 재료를 준비하면 프로토콜의 성공을 보장할 수 있습니다.

1. 굶주리지 않은 육즙이 많은 성견은 1mL의 M9 완충액을 사용하여 접시에서 씻어냅니다. 접시를 약간 기울여 동물들이 접시의 한쪽 가장자리에 모일 수 있도록 합니다.
   참고: 일반적으로 신뢰할 수 있는 알을 얻기 위해 굶주리지 않고 육식한 성인 동물을 ~50-100마리 수집하는 것을 목표로 합니다. 그러나 표백제 제제는 거의 모든 수의 임신 성인 동물에 대해 수행할 수 있습니다. 수집 가능한 임신 성체 동물의 수는 동물의 유전적 배경에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 수집된 동물의 수가 많을수록 일반적으로 더 많은 수의 알이 생성됩니다.
2. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 M9 완충액에 있는 동물을 수집하여 표지된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
3. 동물을 350g에서 30초 동안 원심분리합니다. 이 속도는 해를 끼치지 않고 튜브 바닥에 살아있는 동물을 모을 수 있을 만큼 느립니다.
4. 과도한 M9 완충액의 대부분을 디캔팅하고 수집된 벌레를 튜브 바닥에 그대로 둡니다.
5. 준비된 표백제 용액 1mL를 넣고 동물이 분해되기 시작할 때까지 용액에 떠 있게 하고 조직 분해를 촉진하기 위해 튜브를 정기적으로 뒤집습니다. 해부 현미경으로 튜브를 주기적으로 확인하여 조직 분해 및 난자 방출을 확인합니다. 이 프로세스는 일반적으로 5분에서 10분 정도 걸립니다.
6. 튜브에 눈에 보이는 동물 조직이 거의 남지 않은 대부분 방출된 난자가 들어 있으면 표준 탁상용 마이크로 원심분리기(일반적으로 15,000-21,000g)를 위해 최대 속도로 30초 동안 원심분리하여 바닥에 있는 난자를 수집합니다.
7. 유리 피펫을 사용하여 표백제 용액을 최대한 많이 디캔팅하면서 펠릿 계란을 방해하지 않도록 주의하십시오. M9 완충액 1mL를 첨가하여 남은 표백제 용액에 의한 난자의 분해를 막습니다.
   참고: 2.6단계와 2.7단계는 신속하게 수행해야 합니다. 원심분리가 지연되고, 표백제 용액이 제거되고, M9 완충액으로 세척하면 분해로 인해 난자 수확량이 낮아질 수 있습니다.
8. 튜브를 21,000g에서 30초 동안 다시 원심분리합니다. 펠릿 난자를 방해하지 않고 상층액을 디캔팅합니다.
9. 1mL의 M9 버퍼로 두 번 더 세척하고, 펠릿화된 계란을 방해하지 않고 각 세척 사이에 액체를 디캔팅합니다.
10. 최종 세척 후 M9 완충액 대부분을 디캔팅한 다음 튜브를 튕기거나 세게 흔들어 남은 액체에 난자를 다시 현탁시킵니다.
11. 멸균 유리 피펫을 사용하여 계란이 들어있는 용액 한 방울을 E. coli가 함유 된 새로운 NGM 플레이트의 표면으로 옮깁니다. 대장균 옆에 한 방울을 놓고 접시당 약 100개의 달걀을 추가하는 것을 목표로 합니다. 이 난자들은 나이가 거의 일치합니다.
    참고: 난자 수율이 충분히 높아 한 방울당 100개의 난자를 얻기 어려운 경우, 난자가 들어 있는 튜브에 M9 완충액을 추가하여 농도를 희석할 수 있습니다.

3. 염료 충전 절차

1. 염료 충진되는 균주의 수에 대해 필요한 만큼 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 붙입니다. 한 번 추가되면 빛에 민감한 DiI 용액을 보호하기 위해 각 튜브에 대한 호일 덮개를 만듭니다.
2. 약 1mL의 M9 완충액을 사용하여 연령 동기화된 NGM 플레이트에서 원하는 발달 단계의 동물을 세척합니다. 표백제를 동기화하는 동안 접시에 놓인 100개의 알에서 부화한 약 100마리의 동물이 각 플레이트에 포함되어 있는지 확인합니다. 적절하게 라벨링된 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 동물을 모읍니다.
   참고: 염료 충전은 다양한 발달 단계에서 잘 작동합니다. 이 연구는 유충 3기(L3)부터 성체(L3 후 48시간)에 이르는 동물의 염료 충전을 보여줍니다.
3. 동물을 350g에서 30초 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 모읍니다.
4. 튜브 바닥에 모인 동물을 방해하지 않고 M9 완충액을 디캔팅합니다.
5. 1mL의 M9 버퍼로 두 번 더 세척하고, 수집된 동물을 방해하지 않고 각 세척 사이에 액체를 디캔팅합니다. 마지막 세척 라운드에서 튜브에 200μL의 M9 완충액이 남도록 디캔트합니다.
6. 모든 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 빛 노출로부터 보호하고 DMF에서 1μL의 DiI을 각 튜브의 M9 버퍼에 직접 추가합니다.
   참고: M9 버퍼와 DiI의 양을 변경하는 경우 M9 버퍼에서 DiI의 1:200 비율을 유지해야 합니다.
7. RT에서 2시간 동안 모든 튜브를 흔들거나 흔듭니다.
8. 원심분리기 튜브를 350g에서 30초 동안 사용하여 튜브 바닥에 있는 동물을 수집합니다.
9. 마이크로 원심분리기 튜브에서 DiI이 포함된 액체를 디캔팅합니다. M9 버퍼로 세 번 세척하고 각 세척 사이에 액체를 디캔팅합니다.
10. 최종 세척에서 디캔팅한 후 작은(~50μL) 부피의 M9 완충액에 있는 동물을 E. coli가 있는 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다.
11. 동물이 새 NGM 플레이트에 염색한 후 최소 30분 동안 회복할 수 있도록 합니다. DiI 얼룩을 보존하기 위해 관찰할 때까지 알루미늄 호일로 플레이트를 덮으십시오. 염료 주입 후 최대 24시간까지 형광 신호의 큰 손실 없이 동물을 관찰합니다. 48시간 또는 그 이후에 신호가 페이드되기 시작할 수 있습니다( 그림 2 참조).

4. 이미징 염료 충전

1. 멸균 물 용액에 2% 아가로스를 준비합니다. 전자레인지를 사용하여 아가로스를 완전히 녹입니다.
   참고: 수용액의 아가로스(2%)는 반복적인 수분 손실로 인해 용액이 너무 점성이 높아질 때까지 아가로스 농도가 증가할 때까지 여러 번 재사용할 수 있습니다.
2. 유리 슬라이드와 22mm x 22mm 커버 슬립을 가져와 아가로스 패드를 준비합니다. 유리 피펫을 사용하여 하나의 유리 슬라이드에 용융된 2% 아가로스의 작은 방울을 물에 떨어뜨리고 아가로스 방울 위에 커버 슬립을 빠르게 놓습니다. 아가로스 패드가 완전히 응고되면 커버슬립을 제거하고 아가로스 패드를 유리 슬라이드에 남겨둡니다.
   참고: 아가로스 패드에 기포가 형성되는 것은 동물의 이미징을 방해할 수 있으므로 피하십시오.
3. 아가로스 패드 표면에 5-10μL의 마취제(10mM 레바미솔)를 추가합니다. 5-20마리의 동물을 마취제로 옮긴 다음 커버 슬립을 아가로스 패드 위에 다시 놓습니다.
4. 사용 가능한 장비와 스크리닝 및 이미징 요구 사항에 따라 스테레오, 화합물 및/또는 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 동물을 관찰합니다. DiI는 550nm에서 여기 피크를 가지며 564nm에서 방출 피크를 갖습니다. 따라서 테트라메틸로다민/시아닌 염료 3/황색 형광 단백질(TRITC/Cy3/YFP) 호환 필터 큐브를 사용하여 볼 수 있습니다.
   참고: 염료 충전의 선명한 이미지를 얻는 데 필요한 노출 시간, 게인 및 레이저 출력과 같은 적절한 현미경 설정은 현미경 유형에 따라 다를 수 있으며 고유한 요구 사항에 따라 사용자가 독립적으로 결정해야 합니다.

결과

염료 주입 후 24시간 후에 이미징된 성체 N2 웜은 양엽 뉴런(그림 1A,A')과 파스미드 뉴런(그림 1D,D') 전체에 비교적 고르게 분포된 선명한 형광 신호를 보여줍니다. 이 동물에서 양서류 뉴런의 수지상 돌기와 세포체는 쉽게 구별 될 수 있습니다. 수지상 돌기에는 염료 덩어리가 ?...

토론

x성공적인 염료 충전은 동물의 발달 단계와 유전적 배경, 이미징까지의 경과 시간에 대한 신중한 고려에 달려 있습니다. 일부 유전적 돌연변이는 외부에 노출된 섬모 감각 뉴런의 구조 및/또는 기능을 방해하여 동물이 제대로 염료 충전물을 사용할 수 없게 만듭니다. 따라서 새로운 예쁜꼬마선충 돌연변이의 염료 충전은 감각 뉴런 구조 또는 기능의 결함에 대한 간...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)