Le remplissage de colorant DiI comme outil simple et peu coûteux pour visualiser les neurones sensoriels ciliés chez C. elegans

Résumé

Le remplissage de colorant DiI est une méthode couramment utilisée chez C. elegans pour visualiser un sous-ensemble des neurones sensoriels ciliés, permettant d’identifier les mutations génétiques qui modifient la structure ou la fonction des neurones sensoriels.

Résumé

C. elegans a longtemps été utilisé comme un modèle simple et accessible pour étudier la structure neuronale et les nombreuses fonctions du système nerveux. Sur les 302 neurones du système nerveux hermaphrodite adulte, 60 sont classés comme neurones sensoriels ciliés. Ces neurones sont au cœur d’un certain nombre de comportements de C. elegans , y compris, mais sans s’y limiter, la chimiodétection, la mécanodétection et l’osmodétection, l’accouplement mâle et la formation de dauer. Depuis plusieurs décennies, les membres de la communauté de C. elegans utilisent le colorant lipophile fluorescent rouge DiI pour visualiser un sous-ensemble de neurones sensoriels ciliés qui sont directement exposés à l’environnement externe. Ce colorant pénètre dans les extrémités ciliées des neurones et se distribue selon un schéma relativement uniforme dans les dendrites, les corps cellulaires et les axones. Cette méthode simple et puissante constitue un excellent outil de premier passage pour identifier les mutants génétiques qui confèrent des défauts structurels ou fonctionnels dans les neurones sensoriels ciliés. Ici, nous présentons une version simplifiée de cette méthode de coloration pour visualiser les huit paires de neurones amphides et deux paires de neurones phasmides qui sont exposées à l’environnement chez C. elegans. Nous discutons des conseils d’utilisation de cette méthode peu coûteuse pour imager les modèles de remplissage de colorant cellulaire chez les animaux anesthésiés.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est facile à manipuler, a des temps de génération rapides et est peu coûteux à entretenir. En raison de ces avantages et de bien d’autres, C. elegans a servi d’organisme modèle privilégié pour l’étude de nombreux processus biologiques, en particulier le développement et la fonction du système nerveux. Un numéro entier du Journal of Neurogenetics a récemment été consacré aux impacts historiques de la recherche sur ce sujet particulier¹. Ils sont particulièrement bénéfiques pour l’étude de la fonction des cils primaires, qui sont impliqués dans la détection des conditions environnementales chimiques et physiques².

Les hermaphrodites adultes C. elegans ont un total de 302 neurones, dont 60 possèdent des cils primaires à la fin de leurs processus dendritiques³. Ces 60 neurones ciliés sont classés comme neurones sensoriels et sont impliqués dans de nombreux comportements de C. elegans, y compris, mais sans s’y limiter, la chimiodétection, la mécanodétection et l’osmodétection, l’accouplement mâle et la formation de dauer ^3,4. Il existe deux sous-ensembles de neurones sensoriels ciliés qui sont exposés à l’environnement externe, qui comprennent seize neurones amphides (8 paires) dans la tête et quatre neurones phasmides (2 paires) dans la queue ^3,5.

Depuis plusieurs décennies, les chercheurs de la communauté de C. elegans utilisent des colorants lipophiles, tels que le perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3'3'-tétraméthylindocarbocyanine (DiI) fluorescent rouge, pour visualiser un certain nombre de tissus différents chez les animaux vivants 6,7,8,9. Lorsque les animaux sont exposés à DiI, le colorant intercale facilement et rapidement dans la membrane des dendrites, des axones et des corps cellulaires des 20 neurones amphides et phasmides exposés à l’extérieur dans une distribution relativement uniforme. Lorsque des animaux de type sauvage sont exposés au DiI, le colorant peut être visualisé dans ces neurones par imagerie fluorescente pendant une fenêtre de temps relativement large. S’il y a des anomalies morphologiques ou fonctionnelles dans les cils primaires, le colorant peut ne pas remplir correctement les neurones et, par conséquent, un signal peut apparaître plus faible dans certaines cellules ou dans toutes les cellules ou peut être complètement absent 6,7,10,11. N’importe lequel de ces résultats peut être révélateur de déficits structurels ou fonctionnels qui peuvent être présents dans les neurones sensoriels ciliés des variantes génétiques.

Ce manuscrit vise à démontrer la facilité avec laquelle le remplissage de colorant peut être utilisé chez C. elegans pour visualiser la structure des neurones sensoriels ciliés (Figure 1). Nous avons appliqué cette technique chez des animaux de type sauvage et mutants pour démontrer comment différents contextes génétiques peuvent montrer une variété de résultats de remplissage de colorants, souvent liés à l’intégrité structurelle ou fonctionnelle de leurs neurones sensoriels ciliés. Nous montrons la coloration à 30 min, 24 h et 48 h après le remplissage du colorant dans une variété d’âges d’animaux différents pour aider à déterminer le déroulement optimal de l’imagerie en direct. Nous fournissons également des exemples de difficultés qui peuvent survenir lors de la coloration et de l’imagerie et des conseils pour éviter ces points problématiques. Grâce à l’utilisation de cette méthode, les chercheurs d’institutions de toutes tailles peuvent commencer à s’appuyer sur les bases de la biologie des neurones sensoriels ciliés chez C. elegans. Le remplissage de colorant est suffisamment simple et rentable pour être intégré aux activités de laboratoire des étudiants de premier cycle afin de leur permettre de travailler avec C. elegans et la microscopie à fluorescence avec une expertise technique préalable minimale. De plus, il existe une conservation importante des gènes impliqués dans la biologie des cils primaires et, plus largement, dans la fonction des neurones sensoriels entre l’homme et C. elegans¹². La poursuite des recherches sur les fonctions des gènes ciliaires et les interactions génétiques chez C. elegans pourrait finalement fournir un meilleur aperçu de la complexité des ciliopathies humaines¹³.

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparez la solution d’eau de Javel. Mélanger 2 ml d’eau de Javel, 500 μL de NaOH 10 M et 7,5 ml de dH₂O dans un tube à centrifuger de 15 mL.
   REMARQUE : La solution d’eau de Javel reste stable jusqu’à 1 semaine lorsqu’elle est stockée à température ambiante (RT).
2. Préparez le tampon M9. Combinez 3 g de KH₂PO₄, 6 g de Na₂HPO₄ et 5 g de NaCl dans 1 L d’eau stérile et d’autoclave pour stériliser. Une fois complètement refroidi à RT, ajoutez 1 mL de 1 M MgSO₄ stérile.
3. Préparez la solution mère DiI. Ajouter 10 mg de DiI à 5 mL de diméthylformamide (DMF) pour une concentration finale de 2 mg/mL de DiI dans du DMF. DiI est sensible à la lumière, couvrez donc toujours les solutions avec du papier d’aluminium. Le DiI dans le DMF peut être stocké à -20 °C pendant de nombreuses années et ne nécessite pas de décongélation entre les utilisations.
   ATTENTION : Le DMF est à la fois inflammable et nocif lorsqu’il est en contact avec la peau ou inhalé. Travaillez avec cette solution sous une cagoule chimique, à l’abri des flammes nues et en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.

2. Isolement des populations synchronisées par préparation à l’eau de Javel

REMARQUE : Rassemblez tout l’équipement et les solutions nécessaires pour toutes les étapes du processus avant de commencer. Les préparations d’eau de Javel sont très sensibles au temps, donc avoir le matériel nécessaire avant de commencer le processus garantit le succès du protocole.

1. Laver les animaux adultes gravides et non affamés des assiettes à l’aide de 1 mL de tampon M9. Laissez les animaux se rassembler sur un bord de l’assiette en inclinant légèrement l’assiette.
   REMARQUE : En règle générale, essayez de collecter ~50-100 animaux adultes gravides non affamés pour un rendement fiable d’œufs. Cependant, la préparation de l’eau de Javel peut être effectuée sur presque n’importe quel nombre d’animaux adultes gravides. Le nombre d’animaux adultes gravides disponibles pour la collection peut varier considérablement en fonction du patrimoine génétique des animaux. Un plus grand nombre d’animaux collectés donne généralement un plus grand nombre d’œufs.
2. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélever et transférer les animaux dans le tampon M9 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL étiqueté.
3. Centrifuger les animaux à 350 g pendant 30 s. Cette vitesse est suffisamment lente pour collecter les animaux vivants au fond du tube sans causer de dommages.
4. Décantez la majeure partie de l’excès de tampon M9, en laissant intacts les vers collectés au fond du tube.
5. Ajouter 1 mL de la solution d’eau de Javel préparée et laisser les animaux flotter dans la solution jusqu’à ce qu’ils commencent à se désintégrer, en inversant régulièrement le tube pour favoriser la dégradation des tissus. Observez la dégradation des tissus et la libération des ovules en vérifiant périodiquement le tube sous un microscope à dissection. Ce processus prend généralement entre 5 min et 10 min.
6. Une fois que le tube contient la plupart des œufs libérés avec seulement quelques tissus animaux visibles, centrifugez à la vitesse maximale d’une microcentrifugeuse de table standard (généralement entre 15 000 et 21 000 g) pendant 30 s pour collecter les œufs au fond.
7. Carafer la plus grande quantité possible de solution d’eau de Javel à l’aide d’une pipette en verre, en prenant soin de ne pas déranger les œufs en granulés. Ajouter 1 mL de tampon M9 pour arrêter la dégradation des œufs par la solution d’eau de Javel restante.
   REMARQUE : Les étapes 2.6 et 2.7 doivent être effectuées rapidement. Les retards dans la centrifugation, l’élimination de la solution d’eau de Javel et le lavage avec le tampon M9 peuvent entraîner de faibles rendements d’œufs en raison de la dégradation.
8. Centrifugez à nouveau le tube à 21 000 g pendant 30 s. Décantez le surnageant sans déranger les œufs granulés.
9. Lavez deux fois de plus avec 1 mL de tampon M9, en décantant le liquide entre chaque lavage sans déranger les œufs granulés.
10. Après le lavage final, décantez la majeure partie du tampon M9, puis remettez les œufs en suspension dans le liquide restant en agitant le tube ou en secouant vigoureusement.
11. À l’aide d’une pipette en verre stérile, transférez une goutte de la solution contenant les œufs à la surface d’une plaque NGM fraîche contenant E. coli. Essayez de placer la goutte à côté de l’E. coli et d’ajouter environ 100 œufs par assiette. Ces œufs sont à peu près synchronisés en âge.
    REMARQUE : Dans les cas où le rendement en œufs est suffisamment élevé pour qu’il soit difficile d’obtenir 100 œufs par goutte, un tampon M9 supplémentaire peut être ajouté au tube contenant les œufs pour diluer leur concentration.

3. Procédure de remplissage de colorant

1. Étiquetez autant de tubes de microcentrifugation de 1,5 mL que nécessaire pour le nombre de souches remplies de colorant. Créez des couvercles en aluminium pour chaque tube afin de protéger la solution DiI sensible à la lumière, une fois ajoutée.
2. Laver les animaux d’un stade de développement désiré à partir des plaques NGM synchronisées selon l’âge à l’aide d’environ 1 mL de tampon M9. Assurez-vous que chaque plaque contient environ 100 animaux éclos des 100 œufs placés sur la plaque pendant la synchronisation de l’eau de Javel. Rassemblez les animaux dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL correctement étiquetés.
   REMARQUE : Le remplissage de colorant fonctionne bien sur une grande variété de stades de développement. Cette étude démontre le remplissage de colorant chez des animaux allant du stade larvaire 3 (L3) aux adultes (48 h après L3).
3. Centrifuger les animaux à 350 g pendant 30 s pour les collecter au fond du tube.
4. Décantez le tampon M9 sans déranger les animaux collectés au fond du tube.
5. Lavez deux fois de plus avec 1 mL de tampon M9, en décantant le liquide entre chaque lavage sans déranger les animaux recueillis. Lors du dernier lavage, décantez pour laisser 200 μL de tampon M9 restant dans le tube.
6. Couvrez tous les tubes avec une feuille d’aluminium pour les protéger de l’exposition à la lumière et ajoutez 1 μL de DiI dans du DMF directement au tampon M9 de chaque tube.
   REMARQUE : Si vous modifiez les quantités de tampon M9 et de DiI, assurez-vous de maintenir un rapport de 1:200 de DiI dans le tampon M9.
7. Balancez ou secouez tous les tubes à RT pendant 2 h.
8. Tubes à centrifuger à 350 g pendant 30 s pour recueillir les animaux au fond des tubes.
9. Décantez le liquide contenant le DiI des tubes de la microcentrifugation. Laver trois fois avec un tampon M9, en transvasant le liquide entre chaque lavage.
10. Après la décantation à partir du lavage final, transférez les animaux dans un petit volume (~50 μL) de tampon M9 dans des plaques NGM fraîches contenant E. coli.
11. Laisser les animaux se rétablir après avoir coloré sur des plaques NGM fraîches pendant au moins 30 min. Couvrir les plaques de papier d’aluminium jusqu’à observation pour préserver la tache DiI. Observez les animaux jusqu’à 24 h après le remplissage du colorant sans perte significative du signal fluorescent. À partir de 48 h, le signal peut commencer à s’estomper (voir Figure 2).

4. Remplissage de colorant d’imagerie

1. Préparez une agarose à 2 % dans une solution d’eau stérile. Dissoudre complètement l’agarose à l’aide d’un micro-ondes.
   REMARQUE : L’agarose (2 %) dans la solution aqueuse peut être réutilisé plusieurs fois jusqu’à ce que des pertes d’eau répétées augmentent la concentration d’agarose à un point où la solution devient trop visqueuse.
2. Procurez-vous des lames de verre et des lamelles de 22 mm x 22 mm pour préparer des tampons d’agarose. À l’aide d’une pipette en verre, placez une petite goutte d’agarose fondu à 2 % dans de l’eau sur une lame de verre et placez rapidement une lamelle sur la goutte d’agarose. Une fois que le tampon d’agarose est complètement solidifié, retirez la lamelle, en laissant le tampon d’agarose sur la lame de verre.
   REMARQUE : Évitez la formation de bulles dans les coussinets d’agarose, car ils peuvent obstruer l’imagerie des animaux.
3. Ajouter 5 à 10 μL d’anesthésique (10 mM de lévamisole) à la surface du tampon d’agarose. Transférez 5 à 20 animaux dans l’anesthésique, puis replacez le couvercle sur le tampon d’agarose.
4. Observer les animaux à l’aide d’un microscope stéréoscopique, composé et/ou confocal à fluorescence, selon l’équipement disponible et les besoins en matière de dépistage et d’imagerie. DiI a un pic d’excitation à 550 nm et un pic d’émission à 564 nm ; ainsi, visualisez-le à l’aide d’un cube filtrant compatible avec la tétraméthylrhodamine/cyanine colorant 3/protéine fluorescente jaune (TRITC/Cy3/YFP).
   REMARQUE : Les paramètres appropriés du microscope, tels que le temps d’exposition, le gain et la puissance laser, nécessaires pour obtenir des images claires du remplissage de colorant peuvent varier entre différents types de microscopes et doivent être déterminés indépendamment par les utilisateurs en fonction de leurs besoins uniques.

Résultats

Les vers N2 adultes imagés 24 h après le remplissage du colorant montrent un signal fluorescent clair réparti relativement uniformément dans les neurones amphides (figures 1A,A') et les neurones phasmides (figures 1D,D'). Chez ces animaux, les projections dendritiques et les corps cellulaires des neurones amphides peuvent être facilement distingués. Il n?...

Discussion

Le succès du remplissage des colorants repose sur un examen minutieux du stade de développement et du patrimoine génétique des animaux, ainsi que du temps écoulé jusqu’à l’imagerie. Certaines mutations génétiques perturbent la structure et/ou la fonction des neurones sensoriels ciliés exposés à l’extérieur, ce qui empêche les animaux de teindre correctement le remplissage. Par conséquent, le remplissage de colorants de nouveaux mutants de C. elegans peut êt...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)