C. elegans'ta kirpikli duyusal nöronları görselleştirmek için basit ve ucuz bir araç olarak DiI boya doldurma

Özet

DiI boya doldurma, C. elegans'ta kirpikli duyusal nöronların bir alt kümesini görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan ve duyusal nöron yapısını veya işlevini değiştiren genetik mutasyonların tanımlanmasına izin veren bir yöntemdir.

Özet

C. elegans , nöronal yapıyı ve sinir sisteminin birçok işlevini incelemek için uzun zamandır basit ve erişilebilir bir model olarak kullanılmaktadır. Yetişkin hermafrodit sinir sistemindeki 302 nörondan 60'ı kirpikli duyusal nöronlar olarak sınıflandırılır. Bu nöronlar, kemo-, mekanik ve ozmosalgılama, erkek çiftleşmesi ve dauer oluşumu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere bir dizi C. elegans davranışının merkezinde yer alır. Birkaç on yıl boyunca, C. elegans topluluğunun üyeleri, doğrudan dış çevreye maruz kalan kirpikli duyusal nöronların bir alt kümesini görselleştirmek için kırmızı floresan lipofilik boya DiI'yi kullandılar. Bu boya, nöronların kirpikli uçlarına girer ve dendritler, hücre gövdeleri ve aksonlar boyunca nispeten düzgün bir düzende dağılır. Bu basit ve güçlü yöntem, kirpikli duyusal nöronlarda yapısal veya fonksiyonel kusurlar veren genetik mutantları tanımlamak için mükemmel bir ilk geçiş aracıdır. Burada, C. elegans'ta çevresel olarak maruz kalan sekiz çift amfid ve iki çift fazmid nöronu görselleştirmek için bu boyama yönteminin aerodinamik bir versiyonunu sunuyoruz. Anestezi uygulanmış hayvanlarda hücresel boya doldurma modellerini görüntülemek için bu ucuz yöntemi kullanmanın ipuçlarını tartışıyoruz.

Giriş

Caenorhabditis elegans (C. elegans) manipüle edilmesi kolaydır, hızlı üretim sürelerine sahiptir ve bakımı düşük maliyetlidir. Bu ve diğer birçok avantaj nedeniyle, C. elegans , özellikle sinir sisteminin gelişimi ve işlevi olmak üzere birçok biyolojik süreci incelemek için tercih edilen bir model organizma olarak hizmet etmiştir. Journal of Neurogenetics'teki bir sayının tamamı yakın zamanda bu özel konuyla ilgili araştırmaların tarihsel etkilerine ayrılmıştır¹. Kimyasal ve fiziksel çevre koşullarının algılanmasında rol oynayan birincil kirpiklerin işlevini incelemek için özellikle faydalıdırlar².

Yetişkin hermafrodit C. elegans, 60'ı dendritik süreçlerinin sonunda birincil kirpiklere sahip olan toplam 302 nörona sahiptir³. Bu 60 kirpikli nöron, duyusal nöronlar olarak sınıflandırılır ve kemo-, mekano- ve ozmosalgılama, erkek çiftleşmesi ve dauer oluşumu ^3,4 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok C. elegans davranışında yer alır. Başta on altı amfid nöron (8 çift) ve kuyrukta dört fazmid nöron (2 çift) olmak üzere dış ortama maruz kalan kirpikli duyusal nöronların iki alt kümesi vardır ^3,5.

Birkaç on yıl boyunca, C. elegans topluluğundaki araştırmacılar, canlı hayvanlarda bir dizi farklı dokuyu görselleştirmek için kırmızı floresan 1,1'-dioktadesil-3,3,3'3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) gibi lipofilik boyalar kullandılar ^6,7,8,9. Hayvanlar DiI'ye maruz kaldıklarında, boya, nispeten homojen bir dağılımla dışarıdan maruz kalan 20 amfid ve fazmid nöronun dendritlerinin, aksonlarının ve hücre gövdelerinin zarına kolayca ve hızlı bir şekilde girer. Yabani tip hayvanlar DiI'ye maruz kaldığında, boya bu nöronlarda nispeten geniş bir zaman penceresi boyunca floresan görüntüleme ile görselleştirilebilir. Primer kirpiklerde herhangi bir morfolojik veya fonksiyonel anormallik varsa, boya nöronları düzgün bir şekilde doldurmayabilir ve bu nedenle, bir sinyal hücrelerin bazılarında veya tümünde daha zayıf görünebilir veya tamamen yok olabilir 6,7,10,11. Bu sonuçlardan herhangi biri, genetik varyantların kirpikli duyusal nöronlarında bulunabilecek yapısal veya fonksiyonel eksiklikler hakkında bilgilendirici olabilir.

Bu el yazması, C. elegans'ta kirpikli duyusal nöronların yapısını görselleştirmek için boya doldurmanın ne kadar kolay kullanılabileceğini göstermeyi amaçlamaktadır (Şekil 1). Bu tekniği, farklı genetik geçmişlerin, genellikle kirpikli duyusal nöronlarının yapısal veya fonksiyonel bütünlüğü ile ilgili olarak çeşitli boya doldurma sonuçlarını nasıl gösterebileceğini göstermek için vahşi tip ve mutant hayvanlarda uyguladık. Canlı görüntüleme için en uygun zaman seyrini belirlemeye yardımcı olmak için çeşitli hayvan yaşlarında boya dolgusundan 30 dakika, 24 saat ve 48 saat sonra boyamayı gösteriyoruz. Ayrıca boyama ve görüntüleme sırasında ortaya çıkabilecek zorluklara örnekler ve bu sorunlu noktalardan kaçınmak için ipuçları sunuyoruz. Bu yöntemin kullanılmasıyla, her büyüklükteki kurumdaki araştırmacılar, C. elegans'taki kirpikli duyusal nöron biyolojisinin temeli üzerine inşa etmeye başlayabilirler. Boya doldurma, lisans öğrencileriyle laboratuvar faaliyetlerine dahil edilebilecek kadar basit ve uygun maliyetlidir ve onlara C. elegans ve floresan mikroskobu ile minimum teknik uzmanlıkla çalışma şansı verir. Ek olarak, birincil kirpik biyolojisinde yer alan genlerin ve daha geniş anlamda, insanlar ve C. elegans¹² arasındaki duyusal nöron fonksiyonunun önemli bir korunması vardır. C. elegans'ta siliyer gen fonksiyonları ve genetik etkileşimler üzerine devam eden araştırmalar, sonuçta insan siliyopatilerinin karmaşıklığı hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir¹³.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Çözeltilerin hazırlanması

1. Çamaşır suyu çözeltisini hazırlayın. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 2 mL ağartıcı, 500 μL 10 M NaOH ve 7.5 mL dH_2O'yubirleştirin.
   NOT: Çamaşır suyu çözeltisi, oda sıcaklığında (RT) saklandığında 1 haftaya kadar stabil kalır.
2. M9 arabelleğini hazırlayın. Sterilize etmek için 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄ ve 5 g NaCl'yi 1 L steril su ve otoklavda birleştirin. Tamamen RT'ye soğuduktan sonra 1 mL steril 1 M_MgS04 ekleyin.
3. DiI stok çözeltisini hazırlayın. DMF'de 2 mg / mL DiI'lik bir nihai konsantrasyon için 10 mg DiI ila 5 mL dimetilformamid (DMF) ekleyin. DiI ışığa duyarlıdır, bu nedenle çözeltileri her zaman alüminyum folyo ile kaplayın. DMF'deki DiI, -20 °C'de uzun yıllar saklanabilir ve kullanımlar arasında çözülmesi gerekmez.
   DİKKAT: DMF, cilt ile temas ettiğinde veya solunduğunda hem yanıcı hem de zararlıdır. Bu çözeltiyle kimyasal bir başlık altında, açık alevlerden uzakta ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyerek çalışın.

2. Senkronize popülasyonların çamaşır suyu hazırlama ile izolasyonu

NOT: Başlamadan önce sürecin tüm adımları için gerekli tüm ekipman ve çözümleri toplayın. Çamaşır suyu preparatları zamana çok duyarlıdır, bu nedenle işleme başlamadan önce gerekli malzemelere sahip olmak protokolün başarısını sağlar.

1. Açlıktan ölmemiş, ağırbaşlı yetişkin hayvanları 1 mL M9 tamponu kullanarak plakalardan yıkayın. Plakayı hafifçe eğerek hayvanların plakanın bir kenarında toplanmasına izin verin.
   NOT: Tipik olarak, güvenilir bir yumurta verimi için ~ 50-100 aç kalmamış, gravid yetişkin hayvan toplamayı hedefleyin. Bununla birlikte, çamaşır suyu hazırlığı hemen hemen her sayıda gravid yetişkin hayvanda gerçekleştirilebilir. Toplanabilecek gravid yetişkin hayvanların sayısı, hayvanların genetik geçmişine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Toplanan daha fazla sayıda hayvan genellikle daha fazla sayıda yumurta verir.
2. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, M9 tamponundaki hayvanları toplayın ve etiketli 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. Hayvanları 350 g'da 30 saniye santrifüjleyin. Bu hız, herhangi bir zarar vermeden tüpün dibindeki canlı hayvanları toplayacak kadar yavaştır.
4. Fazla M9 tamponunun çoğunu boşaltın ve toplanan solucanları tüpün dibinde rahatsız edilmeden bırakın.
5. Hazırlanan ağartma solüsyonundan 1 mL ekleyin ve hayvanların parçalanmaya başlayana kadar solüsyon içinde yüzmelerine izin verin, doku parçalanmasını teşvik etmek için tüpü düzenli olarak ters çevirin. Tüpü diseksiyon mikroskobu altında periyodik olarak kontrol ederek doku parçalanmasını ve yumurtaların serbest bırakılmasını görüntüleyin. Bu işlem genellikle 5 dk ile 10 dk arasında sürer.
6. Tüp, yalnızca birkaç görünür hayvan dokusu kalmış halde çoğunlukla salınan yumurtaları içerdiğinde, alttaki yumurtaları toplamak için 30 saniye boyunca standart bir masa üstü mikrosantrifüj (tipik olarak 15.000-21.000 g arasında) için maksimum hızda santrifüjleyin.
7. Peletlenmiş yumurtaları rahatsız etmemeye dikkat ederken bir cam pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla çamaşır suyu solüsyonunu boşaltın. Kalan ağartıcı çözeltisi ile yumurtaların bozulmasını durdurmak için 1 mL M9 tamponu ekleyin.
   NOT: Adım 2.6 ve 2.7 hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Santrifüjlemedeki gecikmeler, çamaşır suyu çözeltisinin çıkarılması ve M9 tamponu ile yıkama, bozulma nedeniyle düşük yumurta verimine neden olabilir.
8. Tüpü tekrar 21.000 g'da 30 saniye santrifüjleyin. Peletlenmiş yumurtaları rahatsız etmeden süpernatanı boşaltın.
9. 1 mL M9 tamponu ile iki kez daha yıkayın, her yıkama arasında peletlenmiş yumurtaları rahatsız etmeden sıvıyı boşaltın.
10. Son yıkamadan sonra, M9 tamponunun çoğunu boşaltın, ardından tüpü hafifçe vurarak veya kuvvetlice sallayarak yumurtaları kalan sıvıda yeniden süspanse edin.
11. Steril bir cam pipet kullanarak, yumurtaları içeren çözeltinin bir damlasını E. coli ile taze bir NGM plakasının yüzeyine aktarın. Damlayı E. coli'nin yanına yerleştirmeyi hedefleyin ve tabak başına yaklaşık 100 yumurta ekleyin. Bu yumurtalar yaklaşık olarak yaş olarak senkronize edilir.
    NOT: Yumurta veriminin damla başına 100 yumurta elde etmenin zor olduğu kadar yüksek olduğu durumlarda, konsantrasyonlarını seyreltmek için yumurta içeren tüpe ek M9 tamponu eklenebilir.

3. Boya doldurma prosedürü

1. Boya ile doldurulan suş sayısı için gerektiği kadar 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin. Eklendikten sonra ışığa duyarlı DiI çözeltisini korumak için her tüp için folyo kapaklar oluşturun.
2. İstenilen gelişim aşamasındaki hayvanları, yaklaşık 1 mL M9 tamponu kullanarak yaşa senkronize NGM plakalarından yıkayın. Her bir tabağın, çamaşır suyu senkronizasyonu sırasında tabağa yerleştirilen 100 yumurtadan çıkan yaklaşık 100 hayvan içerdiğinden emin olun. Hayvanları uygun şekilde etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın.
   NOT: Boya dolgusu, çok çeşitli gelişim aşamalarında iyi sonuç verir. Bu çalışma, larva evresi 3'ten (L3) yetişkinlere (L3'ten 48 saat sonra) kadar değişen hayvanlarda boya dolgusunu göstermektedir.
3. Hayvanları tüpün dibinde toplamak için 30 saniye boyunca 350 g'da santrifüjleyin.
4. Tüpün dibinde toplanan hayvanları rahatsız etmeden M9 tamponunu boşaltın.
5. 1 mL M9 tamponu ile iki kez daha yıkayın, her yıkama arasında toplanan hayvanları rahatsız etmeden sıvıyı boşaltın. Son yıkama turunda, tüpte 200 μL M9 tamponu kalacak şekilde boşaltın.
6. Işığa maruz kalmaktan korumak için tüm tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve her tüpteki M9 tamponuna doğrudan DMF'de 1 μL DiI ekleyin.
   NOT: M9 arabelleği ve DiI miktarlarını değiştiriyorsanız, M9 arabelleğinde 1:200 oranında bir DiI sağladığınızdan emin olun.
7. Tüm tüpleri RT'de 2 saat boyunca sallayın veya sallayın.
8. Tüplerin dibindeki hayvanları toplamak için tüpleri 30 saniye boyunca 350 g'da santrifüjleyin.
9. DiI içeren sıvıyı mikrosantrifüj tüplerinden boşaltın. M9 tamponu ile üç kez yıkayın, her yıkama arasında sıvıyı boşaltın.
10. Son yıkamadan sonra boşalttıktan sonra, hayvanları küçük (~ 50 μL) hacimli bir M9 tamponu içinde E. coli ile taze NGM plakalarına aktarın.
11. Hayvanların taze NGM plakalarında en az 30 dakika lekelendikten sonra iyileşmesine izin verin. DiI lekesini korumak için gözlem yapana kadar plakaları alüminyum folyo ile örtün. Boya dolumundan 24 saat sonrasına kadar hayvanları floresan sinyalinde önemli bir kayıp olmadan gözlemleyin. 48 saatte veya sonrasında sinyal solmaya başlayabilir (bkz. Şekil 2).

4. Görüntüleme boya dolgusu

1. Steril bir su çözeltisinde% 2'lik bir agaroz hazırlayın. Bir mikrodalga kullanarak agarozu tamamen çözün.
   NOT: Su çözeltisindeki agaroz (% 2), tekrarlanan su kaybı, agaroz konsantrasyonunu çözeltinin çok viskoz hale geldiği bir noktaya yükseltene kadar birden çok kez yeniden kullanılabilir.
2. Agaroz pedleri hazırlamak için cam slaytlar ve 22 mm x 22 mm lameller edinin. Bir cam pipet kullanarak, bir cam slayta suya küçük bir damla erimiş %2 agaroz koyun ve agaroz damlasının üzerine hızlı bir şekilde bir kapak fişi yerleştirin. Agaroz pedi tamamen katılaştıktan sonra, lameli çıkarın ve agaroz pedi cam slayt üzerinde bırakın.
   NOT: Hayvanların görüntülenmesini engelleyebileceğinden, agaroz pedlerinde kabarcık oluşumundan kaçının.
3. Agaroz pedinin yüzeyine 5-10 μL anestezik (10 mM levamisol) ekleyin. 5-20 hayvanı anesteziye aktarın, ardından kapak fişini agaroz pedin üzerine geri yerleştirin.
4. Mevcut ekipmana ve tarama ve görüntüleme ihtiyaçlarına bağlı olarak stereo, bileşik ve/veya konfokal floresan mikroskobu kullanarak hayvanları gözlemleyin. DiI, 550 nm'de bir uyarma zirvesine ve 564 nm'de bir emisyon zirvesine sahiptir; bu nedenle, tetrametilamin/siyanin boya 3/sarı floresan proteini (TRITC/Cy3/YFP) uyumlu bir filtre küpü kullanarak görüntüleyin.
   NOT: Boya dolgusunun net görüntülerini elde etmek için gereken pozlama süresi, kazanç ve lazer gücü gibi uygun mikroskop ayarları, farklı mikroskop türleri arasında farklılık gösterebilir ve kullanıcılar tarafından kendi benzersiz ihtiyaçları için bağımsız olarak belirlenmelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Boya dolgusundan 24 saat sonra görüntülenen yetişkin N2 solucanları, amfid nöronları (Şekil 1A, A ') ve fazmid nöronları (Şekil 1D, D ') boyunca nispeten eşit bir şekilde yayılmış berrak floresan sinyali göstermektedir. Bu hayvanlarda, amphid nöronlarının dendritik çıkıntıları ve hücre gövdeleri kolayca ayırt edilebilir. Dendritik pro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Başarılı boya dolumu, hayvanların gelişim aşaması ve genetik geçmişinin yanı sıra görüntülemeye kadar geçen sürenin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesine dayanır. Bazı genetik mutasyonlar, dışarıdan maruz kalan siliyer duyusal nöronların yapısını ve/veya işlevini bozarak, hayvanların düzgün bir şekilde boya dolduramamasına neden olur. Bu nedenle, yeni C. elegans mutantlarının boya dolgusu, duyusal nöron yapısı veya işlevindeki kusurlar ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)