Заполнение красителя DiI как простой и недорогой инструмент для визуализации реснитчатых сенсорных нейронов у C. elegans

Резюме

Заполнение красителя DiI — это метод, обычно используемый у C. elegans для визуализации подмножества реснитчатых сенсорных нейронов, что позволяет идентифицировать генетические мутации, которые изменяют структуру или функцию сенсорных нейронов.

Аннотация

C. elegans долгое время использовался в качестве простой и доступной модели для изучения структуры нейронов и многих функций нервной системы. Из 302 нейронов в нервной системе взрослого гермафродита 60 классифицируются как реснитчатые сенсорные нейроны. Эти нейроны играют центральную роль в поведении C. elegans , включая, помимо прочего, химио-, механо- и осмосенсоринг, спаривание самцов и формирование Дауэра. В течение нескольких десятилетий члены сообщества C. elegans использовали красный флуоресцентный липофильный краситель DiI для визуализации подмножества реснитчатых сенсорных нейронов, которые подвергаются непосредственному воздействию внешней среды. Этот краситель проникает в реснитчатые концы нейронов и распределяется относительно равномерно по дендритам, телам клеток и аксонам. Этот простой и мощный метод является отличным инструментом первого прохода для идентификации генетических мутантов, которые придают структурные или функциональные дефекты реснитчатым сенсорным нейронам. Здесь мы представляем упрощенную версию этого метода окрашивания для визуализации восьми пар амфидных и двух пар фазмидных нейронов, которые подвергаются воздействию окружающей среды у C. elegans. Мы обсудим советы по использованию этого недорогого метода для визуализации клеточного наполнения красителями у животных, находящихся под наркозом.

Введение

Caenorhabditis elegans (C. elegans) прост в управлении, имеет быстрое время генерации и недорог в обслуживании. Благодаря этим и многим другим преимуществам, C. elegans послужил предпочтительным модельным организмом для изучения многих биологических процессов, особенно развития и функционирования нервной системы. Целый выпуск в Journal of Neurogenetics недавно был посвящен историческим последствиям исследований по этой^{конкретной теме}. Они особенно полезны для изучения функции первичных ресничек, которые участвуют в восприятии химических и физических условий окружающей среды².

Взрослые гермафродиты C. elegans имеют в общей сложности 302 нейрона, 60 из которых обладают первичными ресничками в конце дендритных отростков. Эти 60 реснитчатых нейронов классифицируются как сенсорные нейроны и участвуют во многих поведенческих процессах C. elegans, включая, помимо прочего, химио-, механо- и осмосенсоринг, спаривание самцов ^{и формирование} Дауэра^. Существует два подмножества реснитчатых сенсорных нейронов, которые подвергаются воздействию внешней среды, которые включают шестнадцать амфидных нейронов (8 пар) в голове и четыре фазмидных нейрона (2 пары) в хвосте ^3,5.

В течение нескольких десятилетий исследователи из сообщества C. elegans использовали липофильные красители, такие как красный флуоресцентный 1,1'-диоктадецил-3,3,3'3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат (DiI), для визуализации ряда различных тканей у живых животных ^6,7,8,9. Когда животные подвергаются воздействию DiI, краситель легко и быстро интеркалируется в мембрану дендритов, аксонов и клеточных тел 20 амфидных и фазмидных нейронов, подвергшихся внешнему воздействию, в относительно равномерном распределении. Когда дикие животные подвергаются воздействию DiI, краситель может быть визуализирован в этих нейронах с помощью флуоресцентной визуализации в течение относительно широкого промежутка времени. При наличии каких-либо морфологических или функциональных аномалий в первичных ресничках, краситель может не заполнять нейроны должным образом, и, следовательно, сигнал может казаться слабее в некоторых или во всех клетках или может полностью отсутствовать^. Любой из этих результатов может быть информативным для структурных или функциональных дефицитов, которые могут присутствовать в реснитчатых сенсорных нейронах генетических вариантов.

Цель данной рукописи – продемонстрировать легкость, с которой заполнение красителем может быть использовано у C. elegans для визуализации структуры реснитчатых сенсорных нейронов (рис. 1). Мы применили эту технику на диких животных и мутантных животных, чтобы продемонстрировать, как различные генетические предпосылки могут демонстрировать различные результаты наполнения красителями, часто связанные со структурной или функциональной целостностью их реснитчатых сенсорных нейронов. Мы показываем окрашивание через 30 минут, 24 часа и 48 часов после заполнения красителя у животных различных возрастов, чтобы помочь определить оптимальный временной ход для визуализации в реальном времени. Мы также приводим примеры трудностей, которые могут возникнуть во время окрашивания и визуализации, и советы, как избежать этих проблемных точек. Используя этот метод, исследователи в учреждениях любого размера могут начать строить фундамент биологии реснитчатых сенсорных нейронов у C. elegans. Наполнение красителями достаточно простое и экономичное, чтобы его можно было включить в лабораторные работы со студентами, чтобы дать им возможность работать с C. elegans и флуоресцентной микроскопией с минимальными техническими знаниями. Кроме того, в отношениях между человеком и C. elegans^{наблюдается} значительная сохранность генов, участвующих в биологии первичных ресничек и, в более широком смысле, в функции сенсорных нейронов. Продолжение исследований функций ресничных генов и генетических взаимодействий у C. elegans может в конечном итоге обеспечить более глубокое понимание сложности цилиопатий^{человека}.

протокол

1. Приготовление растворов

1. Приготовьте раствор отбеливателя. Смешайте 2 мл отбеливателя, 500 мкл 10 М NaOH и 7,5 мл dH₂O в центрифужной пробирке объемом 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор отбеливателя остается стабильным до 1 недели при хранении при комнатной температуре (RT).
2. Подготовьте буфер M9. Смешайте 3 г KH₂PO₄, 6 г Na₂HPO₄ и 5 г NaCl в 1 л стерильной воды и проведите автоклав для стерилизации. После полного охлаждения до температуры добавьте 1 мл стерильного 1 М MgSO₄.
3. Приготовьте стоковый раствор DiI. Добавьте 10 мг DiI к 5 мл диметилформамида (ДМФА) для получения конечной концентрации 2 мг/мл DiI в ДМФА. DiI светочувствительна, поэтому всегда накрывайте растворы алюминиевой фольгой. DiI в ДМФА может храниться при температуре -20 °C в течение многих лет и не требует размораживания между использованиями.
   ВНИМАНИЕ: ДМФ легко воспламеняется и вреден при контакте с кожей или вдыхании. Работайте с этим раствором под химическим колпаком, вдали от открытого огня и в надлежащих средствах индивидуальной защиты (СИЗ).

2. Выделение синхронизированных популяций с помощью отбеливающего препарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите все оборудование и решения, необходимые для всех этапов процесса, прежде чем начать. Препараты отбеливателя очень чувствительны ко времени, поэтому наличие необходимых материалов перед началом процесса гарантирует успех протокола.

1. Смойте неголодных, беременных взрослых животных с тарелок, используя 1 мл буфера M9. Позвольте животным собраться у одного края тарелки, слегка наклонив тарелку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, стремитесь собрать ~50-100 неголодных, взрослых животных для надежного выхода яиц. Тем не менее, приготовление отбеливателя можно проводить практически на любом количестве взрослых животных. Количество взрослых животных, доступных для сбора, может варьироваться в широких пределах в зависимости от генетического фона животных. Большее количество собранных животных обычно дает большее количество яиц.
2. С помощью стеклянной пипетки Пастера соберите и перенесите животных из буфера M9 в промаркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
3. Центрифугируйте животных при 350 г в течение 30 с. Эта скорость достаточно низкая, чтобы собрать живых животных на дне трубы, не причинив никакого вреда.
4. Сцедите большую часть излишков буфера M9, оставив собранных червей на дне пробирки нетронутыми.
5. Добавьте 1 мл приготовленного раствора отбеливателя и дайте животным поплавать в растворе, пока они не начнут распадаться, регулярно переворачивая трубку, чтобы стимулировать разрушение тканей. Наблюдайте за разрушением тканей и выходом яйцеклеток, периодически проверяя пробирку под препарирующим микроскопом. Этот процесс обычно занимает от 5 до 10 минут.
6. После того, как пробирка содержит в основном высвободившиеся яйца и остается лишь несколько видимых тканей животного происхождения, центрифугируйте на максимальной скорости для стандартной настольной микроцентрифуги (обычно от 15 000 до 21 000 г) в течение 30 секунд, чтобы собрать яйца на дне.
7. Сцедите как можно больше раствора отбеливателя с помощью стеклянной пипетки, стараясь при этом не потревожить гранулированные яйца. Добавьте 1 мл буфера M9, чтобы остановить разложение яиц оставшимся раствором отбеливателя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.6 и 2.7 должны быть выполнены быстро. Задержки в центрифугировании, удалении раствора отбеливателя и промывке буфером M9 могут привести к снижению выхода яиц из-за деградации.
8. Снова центрифугируйте пробирку при 21 000 g в течение 30 с. Сцедите надосадочную жидкость, не потревожив гранулированные яйца.
9. Промойте еще два раза 1 мл буфера M9, сцеживая жидкость между каждым мытьем, не повреждая гранулированные яйца.
10. После окончательной промывки сцедите большую часть буфера M9, затем повторно суспендируйте яйца в оставшейся жидкости, щелкнув трубкой или энергично встряхнув.
11. С помощью стерильной стеклянной пипетки перенесите каплю раствора, содержащего яйца, на поверхность свежей чашки NGM с кишечной палочкой. Постарайтесь поместить каплю рядом с кишечной палочкой и добавьте около 100 яиц на тарелку. Эти яйцеклетки примерно синхронизированы по возрасту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях, когда выход яиц достаточно высок, что получение 100 яиц в капле затруднено, в пробирку, содержащую яйца, можно добавить дополнительный буфер M9 для разбавления их концентрации.

3. Процедура заливки красителя

1. Маркируйте столько пробирок для микроцентрифуги объемом 1,5 мл, сколько необходимо в соответствии с количеством штаммов, которые заполняются красителем. Создайте крышки из фольги для каждой пробирки для защиты светочувствительного раствора DiI после добавления.
2. Вымойте животных желаемой стадии развития из синхронизированных по возрасту планшетов NGM, используя примерно 1 мл буфера M9. Убедитесь, что на каждой тарелке содержится около 100 животных, вылупившихся из 100 яиц, помещенных на тарелку во время синхронизации отбеливателя. Соберите животных в правильно маркированные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заполнение красителями хорошо работает на самых разных стадиях развития. Это исследование демонстрирует заполнение красителя у животных на стадии 3 (L3) до взрослых особей (через 48 ч после L3).
3. Центрифугируйте животных при 350 г в течение 30 с, чтобы собрать их на дно пробирки.
4. Сцедите буфер M9, не беспокоя животных, собранных на дне пробирки.
5. Еще два раза вымойте с 1 мл буфера M9, сцеживая жидкость между каждым мытьем, не беспокоя собранных животных. На последнем раунде промывки сцедите, чтобы в пробирке осталось 200 μл буфера M9.
6. Накройте все пробирки алюминиевой фольгой для защиты от воздействия света и добавьте 1 мкл DiI в DMF непосредственно в буфер M9 в каждой пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При изменении количества буфера M9 и DiI убедитесь, что соотношение DiI в буфере M9 составляет 1:200.
7. Раскачивайте или встряхивайте все трубки в режиме RT в течение 2 часов.
8. Центрифужные пробирки при 350 г в течение 30 с собирают животных на дно пробирок.
9. Сцедите жидкость, содержащую DiI, из микроцентрифужных пробирок. Промойте с буфером M9 три раза, сцеживая жидкость между каждой стиркой.
10. После сцеживания из окончательной промывки переложите животных в небольшом (~50 μл) объеме буфера M9 в свежие тарелки NGM с кишечной палочкой.
11. Дайте животным восстановиться после окрашивания на свежих пластинах NGM в течение не менее 30 минут. Накройте пластины алюминиевой фольгой до появления эффекта, чтобы сохранить пятно DiI. Наблюдайте за животными до 24 ч после заливки красителя без существенной потери флуоресцентного сигнала. Через 48 ч или позже сигнал может начать затухать (см. рис. 2).

4. Визуализация наполнения красителями

1. Приготовьте 2% агарозу в стерильном водном растворе. Полностью растворите агарозу с помощью микроволновой печи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Агарозу (2%) в водном растворе можно использовать многократно до тех пор, пока повторная потеря воды не увеличит концентрацию агарозы до такой степени, что раствор станет слишком вязким.
2. Приобретите предметные стекла и покровные стекла 22 мм x 22 мм для подготовки агарозных прокладок. С помощью стеклянной пипетки поместите небольшую каплю расплавленного 2% агарозы в воду на одно стеклостекло и быстро поместите сверху агарозной капли защитный листок. Как только агарозная прокладка полностью застынет, снимите покровную крышку, оставив агарозную прокладку на предметном стекле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков в агарозных подушечках, так как они могут затруднить визуализацию животных.
3. Добавьте 5-10 мкл анестетика (10 мМ левамизола) на поверхность агарозной прокладки. Переведите 5-20 животных под обезболивающее, затем положите крышку обратно на агарозную подушечку.
4. Наблюдайте за животными с помощью стерео, составного и/или конфокального флуоресцентного микроскопа, в зависимости от имеющегося оборудования и потребностей в скрининге и визуализации. DiI имеет пик возбуждения на длине волны 550 нм и пик излучения на длине волны 564 нм; таким образом, просмотрите его с помощью фильтрующего куба, совместимого с тетраметилродамином/цианиновым красителем 3/желтым флуоресцентным белком (TRITC/Cy3/YFP).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие настройки микроскопа, такие как время экспозиции, усиление и мощность лазера, необходимые для получения четких изображений заполнения красителя, могут варьироваться в зависимости от типа микроскопа и должны определяться пользователями независимо в соответствии с их уникальными потребностями.

Результаты

Взрослые черви N2, полученные через 24 ч после наполнения красителем, демонстрируют четкое флуоресцентное распределение, относительно равномерно распределенное по амфидным нейронам (рис. 1A,A') и фазмидным нейронам (рис. 1D,D

Обсуждение

Успешное заполнение красителя зависит от тщательного изучения стадии развития и генетического фона животных, а также времени, прошедшего до получения изображения. Некоторые генетические мутации нарушают структуру и/или функцию реснитчатых сенсорных нейронов, подв?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)