El relleno de colorantes DiI como una herramienta simple y económica para visualizar neuronas sensoriales ciliadas en C. elegans

Resumen

El relleno de tinte DiI es un método comúnmente utilizado en C. elegans para visualizar un subconjunto de las neuronas sensoriales ciliadas, lo que permite la identificación de mutaciones genéticas que alteran la estructura o función de las neuronas sensoriales.

Resumen

C. elegans se ha utilizado durante mucho tiempo como un modelo simple y accesible para estudiar la estructura neuronal y las muchas funciones del sistema nervioso. De las 302 neuronas dentro del sistema nervioso hermafrodita adulto, 60 se clasifican como neuronas sensoriales ciliadas. Estas neuronas son fundamentales para una serie de comportamientos de C. elegans , que incluyen, entre otros, la quimioterapia, la mecanoterapia y la osmosención, el apareamiento masculino y la formación de dauer. Desde hace varias décadas, los miembros de la comunidad de C. elegans han utilizado el colorante lipofílico fluorescente rojo DiI para visualizar un subconjunto de las neuronas sensoriales ciliadas que están directamente expuestas al entorno externo. Este tinte entra en los extremos ciliados de las neuronas y se distribuye en un patrón relativamente uniforme a través de las dendritas, los cuerpos celulares y los axones. Este método simple y poderoso es una excelente herramienta de primer paso para identificar mutantes genéticos que imparten defectos estructurales o funcionales en las neuronas sensoriales ciliadas. Aquí, presentamos una versión simplificada de este método de tinción para visualizar los ocho pares de neuronas de ánfidos y dos pares de neuronas fásmidos que están expuestos ambientalmente en C. elegans. Discutimos consejos para usar este método económico para obtener imágenes de los patrones de llenado de tintes celulares en animales anestesiados.

Introducción

Los Caenorhabditis elegans (C. elegans) son fáciles de manipular, tienen tiempos de generación rápidos y son de bajo costo de mantenimiento. Debido a estas y muchas otras ventajas, C. elegans ha servido como un organismo modelo preferido para estudiar muchos procesos biológicos, especialmente el desarrollo y la función del sistema nervioso. Recientemente se dedicó un número completo en el Journal of Neurogenetics a los impactos históricos de la investigación sobre^{este tema en} particular. Son particularmente beneficiosos para estudiar la función de los cilios primarios, que están involucrados en la detección de las condiciones ambientales químicas y físicas².

Los hermafroditas adultos C. elegans tienen un total de 302 neuronas, 60 de las cuales poseen cilios primarios al final de sus procesos dendríticos³. Estas 60 neuronas ciliadas se clasifican como neuronas sensoriales y están involucradas en muchos comportamientos de C. elegans, que incluyen, entre otros, quimioterapia, mecanoterapia y osmosensión, apareamiento masculino y formación de dauer ^3,4. Hay dos subconjuntos de neuronas sensoriales ciliadas que están expuestas al medio externo, que incluyen dieciséis neuronas anfiformes (8 pares) en la cabeza y cuatro neuronas fásmidas (2 pares) en la cola ^3,5.

Durante varias décadas, los investigadores de la comunidad de C. elegans han utilizado colorantes lipofílicos, como el perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3'3'-tetrametilindocarbocianina (DiI) fluorescente rojo, para visualizar una serie de tejidos diferentes en animales vivos 6,7,8,9. Cuando los animales se exponen a DiI, el colorante se intercala fácil y rápidamente en la membrana de las dendritas, axones y cuerpos celulares de las 20 neuronas anfiformes y fásmidos expuestas externamente en una distribución relativamente uniforme. Cuando los animales de tipo salvaje se exponen a DiI, el tinte se puede visualizar en estas neuronas mediante imágenes fluorescentes durante un período de tiempo relativamente amplio. Si hay alguna anormalidad morfológica o funcional en los cilios primarios, es posible que el tinte no llene adecuadamente las neuronas y, por lo tanto, una señal puede parecer más débil en algunas o todas las células o puede estar completamente ausente ^6,7,10,11. Cualquiera de estos resultados puede ser informativo de déficits estructurales o funcionales que pueden estar presentes en las neuronas sensoriales ciliadas de las variantes genéticas.

Este manuscrito tiene como objetivo demostrar la facilidad con la que se puede utilizar el relleno de tinte en C. elegans para visualizar la estructura de las neuronas sensoriales ciliadas (Figura 1). Aplicamos esta técnica en animales salvajes y mutantes para demostrar cómo diferentes antecedentes genéticos pueden mostrar una variedad de resultados de relleno de tinte, a menudo relacionados con la integridad estructural o funcional de sus neuronas sensoriales ciliadas. Mostramos la tinción a los 30 min, 24 h y 48 h después del llenado del tinte en una variedad de diferentes edades de animales para ayudar a determinar el curso de tiempo óptimo para las imágenes en vivo. También proporcionamos ejemplos de dificultades que pueden surgir durante la tinción y la obtención de imágenes, así como consejos para evitar estos puntos problemáticos. Mediante el uso de este método, los investigadores de instituciones de cualquier tamaño pueden comenzar a construir sobre la base de la biología de las neuronas sensoriales ciliadas en C. elegans. El relleno de tinte es lo suficientemente simple y rentable como para incorporarlo a las actividades de laboratorio con estudiantes universitarios para permitirles la oportunidad de trabajar con C. elegans y microscopía de fluorescencia con una experiencia técnica previa mínima. Además, existe una importante conservación de los genes implicados en la biología primaria de los cilios y, más ampliamente, en la función de las neuronas sensoriales entre los humanos y C . elegans¹². La investigación continua sobre las funciones de los genes ciliares y las interacciones genéticas en C. elegans podría, en última instancia, proporcionar una mayor comprensión de la complejidad de las ciliopatías humanas¹³.

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Prepara la solución de lejía. Combine 2 ml de lejía, 500 μl de NaOH 10 M y 7,5 ml de_dH2O en un tubo de centrífuga de 15 ml.
   NOTA: La solución de lejía permanece estable hasta por 1 semana cuando se almacena a temperatura ambiente (RT).
2. Prepare el búfer M9. Combine 3 g de KH₂PO₄, 6 g de Na₂HPO₄ y 5 g de NaCl en 1 L de agua estéril y autoclave para esterilizar. Una vez enfriado completamente a RT, agregue 1 mL de MgSO 1 M estéril₄.
3. Prepare la solución madre de DiI. Añadir 10 mg de DiI a 5 mL de dimetilformamida (DMF) para una concentración final de 2 mg/mL de DiI en DMF. DiI es sensible a la luz, así que cubra siempre las soluciones con papel de aluminio. El DiI en DMF puede almacenarse a -20 °C durante muchos años y no requiere descongelación entre usos.
   PRECAUCIÓN: El DMF es inflamable y dañino cuando entra en contacto con la piel o se inhala. Trabaje con esta solución bajo una cubierta química, lejos de llamas abiertas y usando el equipo de protección personal (EPP) adecuado.

2. Aislamiento de poblaciones sincronizadas mediante la preparación de lejía

NOTA: Reúna todo el equipo y las soluciones necesarias para todos los pasos del proceso antes de comenzar. Las preparaciones de lejía son muy sensibles al tiempo, por lo que contar con los materiales necesarios antes de iniciar el proceso garantiza el éxito del protocolo.

1. Lave los animales adultos grávidos y sin hambre de los platos con 1 mL de tampón M9. Permita que los animales se recojan en un borde del plato inclinando ligeramente el plato.
   NOTA: Por lo general, trate de recolectar ~ 50-100 animales adultos grávidos y sin hambre para obtener una producción confiable de huevos. Sin embargo, la preparación de lejía se puede realizar en casi cualquier número de animales adultos grávidos. El número de animales adultos grávidos disponibles para la recolección puede variar ampliamente dependiendo de los antecedentes genéticos de los animales. Un mayor número de animales recolectados suele producir un mayor número de huevos.
2. Con una pipeta Pasteur de vidrio, recoja y transfiera los animales en el tampón M9 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado.
3. Centrifugar los animales a 350 g durante 30 s. Esta velocidad es lo suficientemente lenta como para recoger los animales vivos en el fondo del tubo sin causar ningún daño.
4. Decantar la mayor parte del exceso de tampón M9, dejando los gusanos recolectados en el fondo del tubo sin alterar.
5. Agregue 1 mL de la solución de lejía preparada y deje que los animales floten en la solución hasta que comiencen a desintegrarse, invirtiendo el tubo regularmente para estimular la descomposición del tejido. Observe la descomposición del tejido y la liberación de óvulos revisando periódicamente el tubo bajo un microscopio de disección. Este proceso suele durar entre 5 min y 10 min.
6. Una vez que el tubo contiene la mayoría de los huevos liberados con solo unos pocos tejidos animales visibles, centrifuga a máxima velocidad para una microcentrífuga de mesa estándar (generalmente entre 15,000 y 21,000 g) durante 30 s para recolectar los huevos en el fondo.
7. Decantar la mayor cantidad posible de la solución de lejía con una pipeta de vidrio con cuidado de no alterar los huevos granulados. Agregue 1 ml de tampón M9 para detener la degradación de los huevos por la solución de lejía restante.
   NOTA: Los pasos 2.6 y 2.7 deben llevarse a cabo rápidamente. Los retrasos en la centrifugación, la eliminación de la solución de lejía y el lavado con tampón M9 pueden dar lugar a un bajo rendimiento de huevos debido a la degradación.
8. Vuelva a centrifugar el tubo a 21.000 g durante 30 s. Decantar el sobrenadante sin alterar los huevos peletizados.
9. Lavar dos veces más con 1 mL de tampón M9, líquido decantante entre cada lavado sin alterar los huevos peletizados.
10. Después del lavado final, decantar la mayor parte del tampón M9, luego vuelva a suspender los huevos en el líquido restante moviendo el tubo o agitando vigorosamente.
11. Con una pipeta de vidrio estéril, transfiera una gota de la solución que contiene los huevos a la superficie de una placa de NGM fresca con E. coli. Trate de colocar la gota junto a la E. coli y agregue alrededor de 100 huevos por plato. Estos óvulos están aproximadamente sincronizados en edad.
    NOTA: En los casos en que la producción de huevos sea lo suficientemente alta como para que sea difícil obtener 100 huevos por gota, se puede agregar tampón M9 adicional al tubo que contiene los huevos para diluir su concentración.

3. Procedimiento de llenado de tinte

1. Etiquete tantos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml como sea necesario para el número de cepas que se llenan de tinte. Cree cubiertas de aluminio para cada tubo para proteger la solución DiI sensible a la luz, una vez agregada.
2. Lave a los animales de una etapa de desarrollo deseada de las placas NGM sincronizadas con la edad utilizando aproximadamente 1 mL de tampón M9. Asegúrese de que cada placa contenga aproximadamente 100 animales nacidos de los 100 huevos colocados en la placa durante la sincronización de la lejía. Recoja los animales en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml debidamente etiquetados.
   NOTA: El relleno de tinte funciona bien en una amplia variedad de etapas de desarrollo. Este estudio demuestra el relleno de tinte en animales que van desde la etapa larvaria 3 (L3) hasta los adultos (48 h después de L3).
3. Centrifugar los animales a 350 g durante 30 s para recogerlos en el fondo del tubo.
4. Decanta el tampón M9 sin molestar a los animales recogidos en el fondo del tubo.
5. Lavar dos veces más con 1 mL de tampón M9, decantando líquido entre cada lavado sin molestar a los animales recogidos. En la última ronda de lavado, decantar para dejar 200 μL de tampón M9 en el tubo.
6. Cubra todos los tubos con papel de aluminio para protegerlos de la exposición a la luz y agregue 1 μL de DiI en DMF directamente al tampón M9 en cada tubo.
   NOTA: Si cambia las cantidades de tampón M9 y DiI, asegúrese de mantener una proporción de 1:200 de DiI en el tampón M9.
7. Meca o agite todos los tubos a RT durante 2 h.
8. Tubos de centrífuga a 350 g durante 30 s para recoger animales en el fondo de los tubos.
9. Decantar el líquido que contiene el DiI de los tubos de microcentrífuga. Lavar con tampón M9 tres veces, decantando líquido entre cada lavado.
10. Después de la decantación del lavado final, transfiera los animales en un volumen pequeño (~50 μL) de tampón M9 a placas frescas de NGM con E. coli.
11. Permita que los animales se recuperen después de teñir en placas NGM frescas durante al menos 30 minutos. Cubra las placas con papel de aluminio hasta la observación para preservar la mancha DiI. Observe a los animales hasta 24 horas después del llenado del tinte sin pérdida significativa de la señal fluorescente. A partir de las 48 horas, la señal puede comenzar a desvanecerse (consulte la Figura 2).

4. Llenado de tinte de imágenes

1. Prepare una agarosa al 2% en una solución de agua estéril. Disuelve completamente la agarosa en el microondas.
   NOTA: La agarosa (2%) en solución acuosa se puede reutilizar varias veces hasta que la pérdida repetida de agua aumente la concentración de agarosa hasta un punto en el que la solución se vuelva demasiado viscosa.
2. Obtenga portaobjetos de vidrio y cubreobjetos de 22 mm x 22 mm para preparar almohadillas de agarosa. Con una pipeta de vidrio, coloque una pequeña gota de agarosa fundida al 2% en agua en un portaobjetos de vidrio y coloque rápidamente un cubreobjetos encima de la gota de agarosa. Una vez que la almohadilla de agarosa esté completamente solidificada, retire el cubreobjetos, dejando la almohadilla de agarosa en el portaobjetos de vidrio.
   NOTA: Evite la formación de burbujas en las almohadillas de agarosa, ya que pueden obstruir la imagen de los animales.
3. Agregue 5-10 μL de anestésico (10 mM de levamisol) a la superficie de la almohadilla de agarosa. Transfiera de 5 a 20 animales al anestésico, luego vuelva a colocar el cubreobjetos encima de la almohadilla de agarosa.
4. Observar a los animales utilizando un microscopio de fluorescencia estereoscópico, compuesto y/o confocal, dependiendo del equipo disponible y de las necesidades de detección e imágenes. DiI tiene un pico de excitación a 550 nm y un pico de emisión a 564 nm; por lo tanto, véalo usando un cubo de filtro compatible con tetrametilrodamina / colorante de cianina 3 / proteína fluorescente amarilla (TRITC / Cy3 / YFP).
   NOTA: Los ajustes apropiados del microscopio, como el tiempo de exposición, la ganancia y la potencia del láser, necesarios para obtener imágenes claras del relleno de tinte pueden variar entre los diferentes tipos de microscopios y deben ser determinados de forma independiente por los usuarios para sus necesidades únicas.

Resultados

Los gusanos N2 adultos fotografiados 24 h después del llenado del tinte muestran una clara señal fluorescente distribuida de manera relativamente uniforme a través de las neuronas anfiformes (Figura 1A, A') y las neuronas fásmidas (Figura 1D, D'). En estos animales, se pueden distinguir fácilmente las proyecciones dendríticas y los cuerpos celulares de las...

Discusión

El éxito del relleno de tinte depende de una cuidadosa consideración de la etapa de desarrollo y los antecedentes genéticos de los animales, así como del tiempo transcurrido hasta la obtención de imágenes. Algunas mutaciones genéticas alteran la estructura y/o función de las neuronas sensoriales ciliadas expuestas externamente, lo que da lugar a animales que no pueden teñirse correctamente. Por lo tanto, el relleno de colorante de los nuevos mutantes de C. elegans se pu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)