Il riempimento del colorante DiI come strumento semplice ed economico per visualizzare i neuroni sensoriali ciliati in C. elegans

Riepilogo

Il riempimento del colorante DiI è un metodo comunemente usato in C. elegans per visualizzare un sottoinsieme dei neuroni sensoriali ciliati, consentendo l'identificazione di mutazioni genetiche che alterano la struttura o la funzione dei neuroni sensoriali.

Abstract

C. elegans è stato a lungo utilizzato come modello semplice e accessibile per studiare la struttura neuronale e le molte funzioni del sistema nervoso. Dei 302 neuroni all'interno del sistema nervoso ermafrodito adulto, 60 sono classificati come neuroni sensoriali ciliati. Questi neuroni sono fondamentali per un certo numero di comportamenti di C. elegans , tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la chemio, la meccanorilevazione e l'osmorilevamento, l'accoppiamento maschile e la formazione di dauer. Per diversi decenni, i membri della comunità di C. elegans hanno utilizzato il colorante lipofilo fluorescente rosso DiI per visualizzare un sottoinsieme di neuroni sensoriali ciliati che sono direttamente esposti all'ambiente esterno. Questo colorante entra nelle estremità ciliate dei neuroni e si distribuisce in uno schema relativamente uniforme in tutti i dendriti, i corpi cellulari e gli assoni. Questo metodo semplice e potente è un eccellente strumento di primo passaggio per identificare i mutanti genetici che impartiscono difetti strutturali o funzionali nei neuroni sensoriali ciliati. Qui, presentiamo una versione semplificata di questo metodo di colorazione per visualizzare le otto coppie di anfidi e due coppie di neuroni fasmidi che sono esposti all'ambiente in C. elegans. Discutiamo i suggerimenti per l'utilizzo di questo metodo economico per l'imaging dei modelli di riempimento del colorante cellulare negli animali anestetizzati.

Introduzione

I Caenorhabditis elegans (C. elegans) sono facili da manipolare, hanno tempi di generazione rapidi e sono a basso costo da mantenere. Grazie a questi e molti altri vantaggi, C. elegans è servito come organismo modello preferito per lo studio di molti processi biologici, in particolare lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso. Un intero numero del Journal of Neurogenetics è stato recentemente dedicato agli impatti storici della ricerca su questo particolare argomento¹. Sono particolarmente utili per studiare la funzione delle ciglia primarie, che sono coinvolte nel rilevamento delle condizioni ambientali chimiche e fisiche².

L'ermafrodita adulta C. elegans ha un totale di 302 neuroni, 60 dei quali possiedono ciglia primarie alla fine dei loro processi dendritici³. Questi 60 neuroni ciliati sono classificati come neuroni sensoriali e sono coinvolti in molti comportamenti di C. elegans, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, chemio, meccano e osmosensing, accoppiamento maschile e formazione di dauer ^3,4. Ci sono due sottogruppi di neuroni sensoriali ciliati che sono esposti all'ambiente esterno, che includono sedici neuroni anfidi (8 paia) nella testa e quattro neuroni fasmidi (2 coppie) nella coda ^3,5.

Per diversi decenni, i ricercatori della comunità di C. elegans hanno utilizzato coloranti lipofili, come il perclorato perclorato rosso fluorescente 1,1'-diottadil-3,3,3'3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), per visualizzare una serie di tessuti diversi in animali vivi 6,7,8,9. Quando gli animali sono esposti a DiI, il colorante si intercala facilmente e rapidamente nella membrana dei dendriti, degli assoni e dei corpi cellulari dei 20 neuroni anfidi e fasmidi esposti esternamente in una distribuzione relativamente uniforme. Quando gli animali selvatici sono esposti a DiI, il colorante può essere visualizzato in questi neuroni mediante imaging fluorescente durante una finestra di tempo relativamente ampia. Se ci sono anomalie morfologiche o funzionali nelle ciglia primarie, il colorante potrebbe non riempire correttamente i neuroni e, quindi, un segnale potrebbe apparire più debole in alcune o in tutte le cellule o potrebbe essere completamente assente 6,7,10,11. Ognuno di questi risultati può essere informativo di deficit strutturali o funzionali che possono essere presenti nei neuroni sensoriali ciliati di varianti genetiche.

Questo manoscritto si propone di dimostrare la facilità con cui il riempimento del colorante può essere utilizzato in C. elegans per visualizzare la struttura dei neuroni sensoriali ciliati (Figura 1). Abbiamo applicato questa tecnica in animali selvatici e mutanti per dimostrare come diversi background genetici possano mostrare una varietà di risultati di riempimento del colorante, spesso correlati all'integrità strutturale o funzionale dei loro neuroni sensoriali ciliati. Mostriamo la colorazione a 30 minuti, 24 ore e 48 ore dopo il riempimento del colorante in una varietà di diverse età degli animali per aiutare a determinare il decorso temporale ottimale per l'imaging dal vivo. Forniamo anche esempi di difficoltà che possono sorgere durante la colorazione e l'imaging e suggerimenti per evitare questi punti problematici. Attraverso l'uso di questo metodo, i ricercatori di istituzioni di qualsiasi dimensione possono iniziare a costruire sulle basi della biologia dei neuroni sensoriali ciliati in C. elegans. Il riempimento del colorante è abbastanza semplice ed economico da essere incorporato nelle attività di laboratorio con gli studenti universitari per consentire loro la possibilità di lavorare con C. elegans e la microscopia a fluorescenza con competenze tecniche preliminari minime. Inoltre, vi è una significativa conservazione dei geni coinvolti nella biologia delle ciglia primarie e, più in generale, nella funzione dei neuroni sensoriali tra gli esseri umani e C. elegans¹². La continua ricerca sulle funzioni geniche ciliari e sulle interazioni genetiche in C. elegans potrebbe in definitiva fornire una maggiore comprensione della complessità delle ciliopatie umane¹³.

Protocollo

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare la soluzione di candeggina. Combinare 2 mL di candeggina, 500 μL di NaOH 10 M e 7,5 mL di dH₂O in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   NOTA: La soluzione di candeggina rimane stabile fino a 1 settimana se conservata a temperatura ambiente (RT).
2. Preparare il buffer M9. Unire 3 g di KH₂PO₄, 6 g di Na₂HPO₄ e 5 g di NaCl in 1 L di acqua sterile e sterilizzare in autoclave. Una volta raffreddato completamente a RT, aggiungere 1 mL di 1 M MgSO₄ sterile.
3. Preparare la soluzione madre DiI. Aggiungere 10 mg di DiI a 5 mL di dimetilformammide (DMF) per una concentrazione finale di 2 mg/mL di DiI in DMF. DiI è sensibile alla luce, quindi copri sempre le soluzioni con un foglio di alluminio. DiI in DMF può essere conservato a -20 °C per molti anni e non richiede lo scongelamento tra un utilizzo e l'altro.
   ATTENZIONE: Il DMF è sia infiammabile che dannoso se a contatto con la pelle o inalato. Lavorare con questa soluzione sotto una cappa chimica, lontano da fiamme libere e indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).

2. Isolamento di popolazioni sincronizzate mediante preparazione di candeggina

NOTA: Raccogli tutte le attrezzature e le soluzioni necessarie per tutte le fasi del processo prima di iniziare. I preparati a base di candeggina sono molto sensibili al fattore tempo, quindi avere i materiali necessari prima di iniziare il processo garantisce il successo del protocollo.

1. Lavare gli animali adulti non affamati e gravidi dalle piastre utilizzando 1 mL di tampone M9. Lascia che gli animali si raccolgano su un bordo del piatto inclinando leggermente il piatto.
   NOTA: In genere, cerca di raccogliere ~50-100 animali adulti gravidi e non affamati per una resa affidabile di uova. Tuttavia, la preparazione con candeggina può essere eseguita su quasi tutti gli animali adulti gravidi. Il numero di animali adulti gravidi disponibili per la raccolta può variare notevolmente a seconda del background genetico degli animali. Un numero maggiore di animali raccolti di solito produce un numero maggiore di uova.
2. Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, raccogliere e trasferire gli animali nel tampone M9 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml etichettata.
3. Centrifugare gli animali a 350 g per 30 s. Questa velocità è abbastanza lenta da raccogliere gli animali vivi sul fondo del tubo senza causare alcun danno.
4. Decantare la maggior parte del tampone M9 in eccesso, lasciando indisturbati i vermi raccolti sul fondo del tubo.
5. Aggiungere 1 ml della soluzione di candeggina preparata e lasciare che gli animali galleggino nella soluzione fino a quando non iniziano a disintegrarsi, capovolgendo regolarmente la provetta per favorire la rottura dei tessuti. Osserva la degradazione dei tessuti e il rilascio degli ovuli controllando periodicamente la provetta al microscopio da dissezione. Questo processo richiede solitamente tra i 5 e i 10 minuti.
6. Una volta che la provetta contiene per lo più uova rilasciate con solo pochi tessuti animali visibili, centrifugare alla massima velocità per una microcentrifuga da tavolo standard (in genere tra 15.000 e 21.000 g) per 30 secondi per raccogliere le uova sul fondo.
7. Decantare il più possibile la soluzione di candeggina utilizzando una pipetta di vetro, facendo attenzione a non disturbare le uova pellettate. Aggiungere 1 mL di tampone M9 per arrestare la degradazione delle uova da parte della soluzione di candeggina rimanente.
   NOTA: I passaggi 2.6 e 2.7 devono essere eseguiti rapidamente. I ritardi nella centrifugazione, nella rimozione della soluzione di candeggina e nel lavaggio con il tampone M9 possono causare una bassa produzione di uova a causa della degradazione.
8. Centrifugare nuovamente la provetta a 21.000 g per 30 s. Decantare il surnatante senza disturbare le uova pellettate.
9. Lavare altre due volte con 1 mL di tampone M9, decantando il liquido tra un lavaggio e l'altro senza disturbare le uova pellettate.
10. Dopo il lavaggio finale, decantare la maggior parte del tampone M9, quindi risospendere le uova nel liquido rimanente agitando il tubo o agitando energicamente.
11. Utilizzando una pipetta di vetro sterile, trasferire una goccia della soluzione contenente gli ovuli sulla superficie di una piastra NGM fresca con E. coli. Cerca di posizionare la goccia accanto all'E. coli e aggiungi circa 100 uova per piatto. Queste uova sono approssimativamente sincronizzate nell'età.
    NOTA: Nei casi in cui la produzione di uova è sufficientemente elevata da rendere difficile ottenere 100 uova per goccia, è possibile aggiungere un ulteriore tampone M9 alla provetta contenente le uova per diluirne la concentrazione.

3. Procedura di riempimento del colorante

1. Etichettare tutte le provette per microcentrifuga da 1,5 ml necessarie per il numero di ceppi da riempire. Crea coperture di alluminio per ogni tubo per proteggere la soluzione DiI sensibile alla luce, una volta aggiunta.
2. Lavare gli animali di uno stadio di sviluppo desiderato dalle piastre NGM sincronizzate per età utilizzando circa 1 mL di tampone M9. Assicurati che ogni piatto contenga circa 100 animali nati dalle 100 uova poste sul piatto durante la sincronizzazione della candeggina. Raccogliere gli animali nelle provette per microcentrifuga da 1,5 ml correttamente etichettate.
   NOTA: Il riempimento del colorante funziona bene in un'ampia varietà di fasi di sviluppo. Questo studio dimostra il riempimento del colorante in animali che vanno dallo stadio larvale 3 (L3) agli adulti (48 ore dopo L3).
3. Centrifugare gli animali a 350 g per 30 s per raccoglierli sul fondo del tubo.
4. Decantare il tampone M9 senza disturbare gli animali raccolti sul fondo del tubo.
5. Lavare altre due volte con 1 mL di tampone M9, decantando il liquido tra ogni lavaggio senza disturbare gli animali raccolti. Durante l'ultimo ciclo di lavaggio, decantare per lasciare 200 μl di tampone M9 rimanenti nella provetta.
6. Coprire tutte le provette con un foglio di alluminio per proteggerle dall'esposizione alla luce e aggiungere 1 μL di DiI in DMF direttamente al tampone M9 in ciascuna provetta.
   NOTA: Se si modificano le quantità di buffer M9 e DiI, assicurarsi di mantenere un rapporto 1:200 di DiI nel buffer M9.
7. Scuotere o agitare tutti i tubi a RT per 2 ore.
8. Provette da centrifuga a 350 g per 30 s per raccogliere gli animali sul fondo delle provette.
9. Decantare il liquido contenente il DiI dalle provette della microcentrifuga. Lavare con tampone M9 tre volte, decantando il liquido tra un lavaggio e l'altro.
10. Dopo la decantazione dal lavaggio finale, trasferire gli animali in un piccolo volume (~50 μL) di tampone M9 su piastre NGM fresche con E. coli.
11. Lasciare che gli animali si riprendano dopo la colorazione su piastre NGM fresche per almeno 30 minuti. Coprire le piastre con un foglio di alluminio fino all'osservazione per preservare la macchia DiI. Osservare gli animali fino a 24 ore dopo il riempimento del colorante senza perdite significative di segnale fluorescente. A partire da 48 ore, il segnale può iniziare a svanire (vedere la Figura 2).

4. Riempimento del colorante per immagini

1. Preparare un agarosio al 2% in una soluzione acquosa sterile. Sciogliere completamente l'agarosio utilizzando un forno a microonde.
   NOTA: L'agarosio (2%) in soluzione acquosa può essere riutilizzato più volte fino a quando la perdita ripetuta di acqua aumenta la concentrazione di agarosio fino al punto in cui la soluzione diventa troppo viscosa.
2. Procurarsi vetrini e vetrini coprioggetti da 22 mm x 22 mm per preparare i tamponi di agarosio. Utilizzando una pipetta di vetro, posizionare una piccola goccia di agarosio fuso al 2% in acqua su un vetrino e posizionare rapidamente un vetrino coprioggetti sopra la goccia di agarosio. Una volta che il tampone di agarosio è completamente solidificato, rimuovere il vetrino, lasciando il tampone di agarosio sul vetrino.
   NOTA: Evitare la formazione di bolle nei cuscinetti di agarosio, in quanto possono ostruire l'imaging degli animali.
3. Aggiungere 5-10 μL di anestetico (10 mM di levamisolo) sulla superficie del tampone di agarosio. Trasferire 5-20 animali nell'anestetico, quindi riposizionare il vetrino coprioggetti sopra il tampone di agarosio.
4. Osservare gli animali utilizzando un microscopio a fluorescenza stereo, composto e/o confocale, a seconda delle attrezzature disponibili e delle esigenze di screening e imaging. DiI ha un picco di eccitazione a 550 nm e un picco di emissione a 564 nm; quindi, visualizzalo utilizzando un cubo filtrante compatibile con tetrametilrodamina/colorante cianina 3/proteina fluorescente gialla (TRITC/Cy3/YFP).
   NOTA: Le impostazioni appropriate del microscopio, come il tempo di esposizione, il guadagno e la potenza del laser, necessarie per ottenere immagini nitide del riempimento del colorante possono variare tra i diversi tipi di microscopi e devono essere determinate in modo indipendente dagli utenti in base alle loro esigenze specifiche.

Risultati

I vermi N2 adulti ripresi 24 ore dopo il riempimento del colorante dimostrano una chiara diffusione del segnale fluorescente in modo relativamente uniforme tra i neuroni anfidi (Figura 1A, A') e i neuroni fasmidi (Figura 1D, D'). In questi animali, le proiezioni dendritiche e i corpi cellulari dei neuroni anfidi possono essere facilmente distinti. Non ci sono gr...

Discussione

Il successo del riempimento del colorante si basa su un'attenta considerazione dello stadio di sviluppo e del background genetico degli animali, nonché del tempo trascorso prima dell'imaging. Alcune mutazioni genetiche interrompono la struttura e/o la funzione dei neuroni sensoriali ciliati esposti esternamente, con il risultato che gli animali non sono in grado di riempirsi correttamente la tintura. Pertanto, il riempimento di coloranti di nuovi mutanti di C. elegans può esse...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)