DiI Dye-Filling como uma ferramenta simples e barata para visualizar neurônios sensoriais ciliados em C. elegans

Resumo

O preenchimento de corante DiI é um método comumente usado em C. elegans para visualizar um subconjunto dos neurônios sensoriais ciliados, permitindo a identificação de mutações genéticas que alteram a estrutura ou função dos neurônios sensoriais.

Resumo

C. elegans tem sido usado há muito tempo como um modelo simples e acessível para estudar a estrutura neuronal e as muitas funções do sistema nervoso. Dos 302 neurônios do sistema nervoso hermafrodita adulto, 60 são classificados como neurônios sensoriais ciliados. Esses neurônios são centrais para vários comportamentos de C. elegans , incluindo, mas não se limitando a, quimio, mecano e osmossensing, acasalamento masculino e formação de dauer. Por várias décadas, os membros da comunidade C . elegans usaram o corante lipofílico fluorescente vermelho DiI para visualizar um subconjunto dos neurônios sensoriais ciliados que estão diretamente expostos ao ambiente externo. Esse corante entra nas extremidades ciliadas dos neurônios e se distribui em um padrão relativamente uniforme pelos dendritos, corpos celulares e axônios. Este método simples e poderoso é uma excelente ferramenta de primeira passagem para identificar mutantes genéticos que transmitem defeitos estruturais ou funcionais em neurônios sensoriais ciliados. Aqui, apresentamos uma versão simplificada desse método de coloração para visualizar os oito pares de neurônios anfídeos e dois pares de neurônios fasmídeos que estão ambientalmente expostos em C. elegans. Discutimos dicas para usar esse método barato para obter imagens de padrões de preenchimento de corante celular em animais anestesiados.

Introdução

Caenorhabditis elegans (C. elegans) são fáceis de manipular, têm tempos de geração rápidos e são de baixo custo para manter. Devido a essas e muitas outras vantagens, C. elegans tem servido como um organismo modelo preferido para estudar muitos processos biológicos, especialmente o desenvolvimento e a função do sistema nervoso. Uma edição inteira no Journal of Neurogenetics foi recentemente dedicada aos impactos históricos da pesquisa sobre este tópico específico¹. Eles são particularmente benéficos para estudar a função dos cílios primários, que estão envolvidos na detecção de condições ambientais químicas e físicas².

O hermafrodita adulto C. elegans tem um total de 302 neurônios, 60 dos quais possuem cílios primários no final de seus processos dendríticos³. Esses 60 neurônios ciliados são classificados como neurônios sensoriais e estão envolvidos em muitos comportamentos de C. elegans, incluindo, entre outros, quimio, mecano e osmossensing, acasalamento masculino e formação de dauer ^3,4. Existem dois subconjuntos de neurônios sensoriais ciliados que são expostos ao ambiente externo, que incluem dezesseis neurônios anfídeos (8 pares) na cabeça e quatro neurônios fasmídeos (2 pares) na cauda ^3,5.

Por várias décadas, pesquisadores da comunidade de C. elegans usaram corantes lipofílicos, como o perclorato fluorescente vermelho de 1,1'-dioctadecil-3,3,3'3'-tetrametilindocarbianina (DiI), para visualizar vários tecidos diferentes em animais vivos 6,7,8,9. Quando os animais são expostos ao DiI, o corante se intercala fácil e rapidamente na membrana dos dendritos, axônios e corpos celulares dos 20 neurônios anfídeos e fasmídeos expostos externamente em uma distribuição relativamente uniforme. Quando animais do tipo selvagem são expostos ao DiI, o corante pode ser visualizado nesses neurônios por imagens fluorescentes durante uma janela de tempo relativamente ampla. Se houver alguma anormalidade morfológica ou funcional nos cílios primários, o corante pode não preencher adequadamente os neurônios e, portanto, um sinal pode parecer mais fraco em algumas ou todas as células ou pode estar completamente ausente 6,7,10,11. Qualquer um desses resultados pode ser informativo sobre déficits estruturais ou funcionais que podem estar presentes nos neurônios sensoriais ciliados de variantes genéticas.

Este manuscrito tem como objetivo demonstrar a facilidade com que o preenchimento de corante pode ser usado em C. elegans para visualizar a estrutura de neurônios sensoriais ciliados (Figura 1). Aplicamos essa técnica em animais selvagens e mutantes para demonstrar como diferentes origens genéticas podem mostrar uma variedade de resultados de preenchimento de corante, muitas vezes relacionados à integridade estrutural ou funcional de seus neurônios sensoriais ciliados. Mostramos coloração em 30 min, 24 h e 48 h após o preenchimento do corante em uma variedade de idades diferentes de animais para ajudar a determinar o curso de tempo ideal para imagens ao vivo. Também fornecemos exemplos de dificuldades que podem surgir durante a coloração e a imagem e dicas para evitar esses pontos problemáticos. Através do uso desse método, pesquisadores de instituições de qualquer tamanho podem começar a construir sobre a base da biologia do neurônio sensorial ciliado em C. elegans. O preenchimento de corante é simples e econômico o suficiente para ser incorporado em atividades de laboratório com alunos de graduação para permitir que eles trabalhem com C. elegans e microscopia de fluorescência com o mínimo de conhecimento técnico prévio. Além disso, há uma conservação significativa de genes envolvidos na biologia dos cílios primários e, mais amplamente, na função dos neurônios sensoriais entre humanos e C. elegans¹². A pesquisa contínua sobre as funções dos genes ciliares e as interações genéticas em C. elegans poderia, em última análise, fornecer uma visão mais ampla sobre a complexidade das ciliopatias humanas¹³.

Protocolo

1. Preparação das soluções

1. Prepare a solução de alvejante. Combine 2 mL de alvejante, 500 μL de NaOH 10 M e 7,5 mL de dH₂O em um tubo de centrífuga de 15 mL.
   NOTA: A solução de alvejante permanece estável por até 1 semana quando armazenada em temperatura ambiente (RT).
2. Prepare o buffer M9. Combine 3 g de KH₂PO₄, 6 g de Na₂HPO₄ e 5 g de NaCl em 1 L de água estéril e autoclave para esterilizar. Depois de resfriado completamente a RT, adicione 1 mL de MgSO₄ 1 M estéril.
3. Prepare a solução de estoque DiI. Adicionar 10 mg de DiI a 5 ml de dimetilformamida (DMF) para uma concentração final de 2 mg/ml de DiI em DMF. DiI é sensível à luz, portanto, sempre cubra as soluções com papel alumínio. O DiI em DMF pode ser armazenado a -20 °C por muitos anos e não requer descongelamento entre os usos.
   CUIDADO: O DMDF é inflamável e prejudicial quando em contato com a pele ou inalado. Trabalhe com esta solução sob um capuz químico, longe de chamas e usando equipamento de proteção individual (EPI) adequado.

2. Isolamento de populações sincronizadas por preparação de alvejante

NOTA: Reúna todos os equipamentos e soluções necessários para todas as etapas do processo antes de começar. As preparações de alvejante são muito sensíveis ao tempo, portanto, ter os materiais necessários antes de iniciar o processo garante o sucesso do protocolo.

1. Lave os animais adultos grávidas e sem fome das placas usando 1 mL de tampão M9. Deixe os animais se acumularem em uma das bordas do prato, inclinando-o ligeiramente.
   NOTA: Normalmente, tente coletar ~ 50-100 animais adultos grávidas e sem fome para uma produção confiável de ovos. No entanto, a preparação de alvejante pode ser realizada em quase qualquer número de animais adultos grávidas. O número de animais adultos grávidas disponíveis para coleta pode variar muito, dependendo do histórico genético dos animais. Um maior número de animais coletados geralmente produz um maior número de ovos.
2. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, colete e transfira os animais no tampão M9 para um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,5 mL.
3. Centrifugar os animais a 350 g durante 30 s. Essa velocidade é lenta o suficiente para coletar os animais vivos no fundo do tubo sem causar nenhum dano.
4. Decantar a maior parte do excesso de tampão M9, deixando os vermes coletados no fundo do tubo intactos.
5. Adicione 1 mL da solução de alvejante preparada e deixe os animais flutuarem na solução até que comecem a se desintegrar, invertendo o tubo regularmente para estimular a quebra do tecido. Veja a quebra do tecido e a liberação de óvulos verificando periodicamente o tubo sob um microscópio de dissecação. Esse processo geralmente leva entre 5 minutos e 10 minutos.
6. Uma vez que o tubo contenha principalmente ovos liberados com apenas alguns tecidos animais visíveis restantes, centrifugue na velocidade máxima para uma microcentrífuga de mesa padrão (normalmente entre 15.000-21.000 g) por 30 s para coletar os ovos no fundo.
7. Transvase o máximo possível da solução de alvejante usando uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não perturbar os ovos peletizados. Adicione 1 mL de tampão M9 para interromper a degradação dos ovos pela solução de alvejante restante.
   NOTA: As etapas 2.6 e 2.7 devem ser executadas rapidamente. Atrasos na centrifugação, remoção da solução de alvejante e lavagem com tampão M9 podem resultar em baixos rendimentos de ovos devido à degradação.
8. Centrifugue novamente o tubo a 21.000 g por 30 s. Transvasar o sobrenadante sem perturbar os ovos peletizados.
9. Lavar mais duas vezes com 1 mL de tampão M9, decantando o líquido entre cada lavagem sem perturbar os ovos peletizados.
10. Após a lavagem final, transvase a maior parte do tampão M9 e, em seguida, ressuspenda os ovos no líquido restante, sacudindo o tubo ou agitando vigorosamente.
11. Usando uma pipeta de vidro estéril, transfira uma gota da solução contendo os ovos para a superfície de uma placa NGM fresca com E. coli. Procure colocar a gota ao lado da E. coli e adicione cerca de 100 ovos por prato. Esses ovos são aproximadamente sincronizados em idade.
    NOTA: Nos casos em que o rendimento de ovos é alto o suficiente para dificultar a obtenção de 100 ovos por gota, tampão M9 adicional pode ser adicionado ao tubo contendo ovos para diluir sua concentração.

3. Procedimento de enchimento de tinta

1. Rotule quantos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL forem necessários para o número de cepas que estão sendo preenchidas com corante. Crie tampas de alumínio para cada tubo para proteger a solução DiI sensível à luz, uma vez adicionada.
2. Lave os animais de um estágio de desenvolvimento desejado das placas NGM sincronizadas com a idade usando aproximadamente 1 mL de tampão M9. Certifique-se de que cada placa contenha aproximadamente 100 animais nascidos dos 100 ovos colocados na placa durante a sincronização do alvejante. Colete os animais nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL devidamente rotulados.
   NOTA: O preenchimento de corante funciona bem em uma ampla variedade de estágios de desenvolvimento. Este estudo demonstra o preenchimento de corante em animais que variam do estágio larval 3 (L3) a adultos (48 h pós-L3).
3. Centrifugar os animais a 350 g durante 30 s para os recolher no fundo do tubo.
4. Transvase o tampão M9 sem perturbar os animais recolhidos no fundo do tubo.
5. Lavar mais duas vezes com 1 mL de tampão M9, decantando o líquido entre cada lavagem sem perturbar os animais recolhidos. Na última rodada de lavagem, decantar para deixar 200 μL de tampão M9 restantes no tubo.
6. Cubra todos os tubos com papel alumínio para proteger da exposição à luz e adicione 1 μL de DiI em DMF diretamente ao tampão M9 em cada tubo.
   NOTA: Se alterar as quantidades de buffer M9 e DiI, certifique-se de manter uma proporção de 1:200 de DiI no buffer M9.
7. Agite ou agite todos os tubos em RT por 2 h.
8. Tubos de centrífuga a 350 g por 30 s para coletar animais no fundo dos tubos.
9. Transvasar o líquido que contém o DiI dos tubos da microcentrífuga. Lavar com tampão M9 três vezes, decantando o líquido entre cada lavagem.
10. Após a decantação da lavagem final, transfira os animais em um pequeno volume (~ 50 μL) de tampão M9 para placas NGM frescas com E. coli.
11. Permitir que os animais recuperem após a coloração em placas NGM frescas durante, pelo menos, 30 min. Cubra as placas com papel alumínio até a observação para preservar a mancha DiI. Observe os animais até 24 h após o enchimento do corante, sem perda significativa no sinal fluorescente. Em ou após 48 h, o sinal pode começar a desaparecer (veja a Figura 2).

4. Preenchimento de tinta de imagem

1. Prepare uma agarose a 2% em uma solução aquosa estéril. Dissolva totalmente a agarose usando um micro-ondas.
   NOTA: A agarose (2%) em solução aquosa pode ser reutilizada várias vezes até que a perda repetida de água aumente a concentração de agarose a um ponto em que a solução se torne muito viscosa.
2. Obtenha lâminas de vidro e lamínulas de 22 mm x 22 mm para preparar almofadas de agarose. Usando uma pipeta de vidro, coloque uma pequena gota de agarose a 2% derretida em água em uma lâmina de vidro e coloque rapidamente uma lamínula em cima da gota de agarose. Quando a almofada de agarose estiver totalmente solidificada, remova a lamínula, deixando a almofada de agarose na lâmina de vidro.
   NOTA: Evite a formação de bolhas nas almofadas de agarose, pois elas podem obstruir a imagem dos animais.
3. Adicione 5-10 μL de anestésico (10 mM de levamisol) à superfície da almofada de agarose. Transfira de 5 a 20 animais para o anestésico e, em seguida, coloque a lamínula de volta em cima da almofada de agarose.
4. Observe os animais usando um microscópio de fluorescência estéreo, composto e/ou confocal, dependendo do equipamento disponível e das necessidades de triagem e imagem. DiI tem um pico de excitação a 550 nm e um pico de emissão a 564 nm; assim, visualize-o usando um cubo de filtro compatível com tetrametilrodamina / cianina corante 3 / proteína fluorescente amarela (TRITC / Cy3 / YFP).
   NOTA: As configurações apropriadas do microscópio, como tempo de exposição, ganho e potência do laser, necessárias para obter imagens nítidas do preenchimento de corante podem variar entre os diferentes tipos de microscópios e devem ser determinadas independentemente pelos usuários para suas necessidades exclusivas.

Resultados

Vermes N2 adultos fotografados 24 h após o preenchimento do corante demonstram um sinal fluorescente claro espalhado de maneira relativamente uniforme pelos neurônios anfídeos (Figura 1A, A ') e neurônios fasmídeos ( Figura 1D , D '). Nesses animais, as projeções dendríticas e os corpos celulares dos neurônios anfídeos podem ser facilmente distinguidos...

Discussão

xO preenchimento bem-sucedido do corante depende da consideração cuidadosa do estágio de desenvolvimento e do histórico genético dos animais, bem como do tempo decorrido até a imagem. Algumas mutações genéticas interrompem a estrutura e/ou função dos neurônios sensoriais ciliados expostos externamente, resultando em animais que são incapazes de se encherem adequadamente. Portanto, o preenchimento de corante de novos mutantes de C. elegans pode ser usado como um simp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI	Biotium	60010	Not water soluble, make 2 mg/mL solution in DMF. Solution is light sensitive, cover with foil. Store at -20 °C. Solution good for many years.
Levamisole hydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM solution in M9 Buffer. Store at -20 °C. Solution good for many years.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Available for purchase, but also easy to make in house following recipe in protocol.
N2 (C. elegans strain)	CGC	N2	C. elegans wild isolate
YH2125 (C. elegans strain)	n/a	n/a	Strain generated in Yoder Laboratory (Bentley-Ford et al, 2021)