نموذج فأر للتليف الرئوي الناجم عن إرذاذ بليوميسين الأنف

Summary

تم إنشاء نماذج حيوانية مختلفة للتليف الرئوي باستخدام بليوميسين لتوضيح التسبب في التليف الرئوي وإيجاد أهداف دوائية جديدة. ومع ذلك، فإن معظم نماذج التليف الرئوي التي تستهدف أنسجة الرئة لديها إعطاء غير متساو للأدوية. هنا ، نقترح نموذجا للتليف الرئوي المنتظم الناجم عن إرذاذ بليوميسين الأنف.

Abstract

التليف الرئوي هو سمة من سمات العديد من أمراض الرئة البشرية التي تنشأ من أسباب مختلفة. بالنظر إلى أن خيارات العلاج محدودة إلى حد ما ، لا تزال نماذج الفئران أداة مهمة لتطوير استراتيجيات جديدة مضادة للتليف. في هذه الدراسة ، يتم إجراء إعطاء بليوميسين (BLM) داخل الرئة عن طريق الإرذاذ الأنفي لإنشاء نموذج فأر للتليف الرئوي يحاكي عن كثب خصائص المرض السريري. تلقت الفئران C57BL / 6 BLM (7 وحدة / مل ، 30 دقيقة / يوم) عن طريق الإرذاذ الأنفي لمدة 3 أيام متتالية وتم التضحية بها في اليوم 9 أو 16 أو 23 لمراقبة التغيرات الالتهابية والتليفية في أنسجة الرئة. استهدفت BLM الأنفية الهباء الجوي الرئتين مباشرة ، مما أدى إلى التهاب وتليف الرئة على نطاق واسع وموحد. وهكذا ، نجحنا في إنشاء نموذج فأر تجريبي للتليف الرئوي البشري النموذجي. يمكن بسهولة استخدام هذه الطريقة لدراسة آثار إعطاء الهباء الجوي الأنفي المختلفة على الفيزيولوجيا المرضية للرئة والتحقق من صحة العلاجات الجديدة المضادة للالتهابات والمضادة للتليف.

Introduction

التليف الرئوي هو عملية مرض تدريجية يؤدي فيها الترسب المفرط لمكونات المصفوفة خارج الخلية ، وخاصة الكولاجين من النوع الأول ، في الخلالي للرئتين إلى ضعف وظائف الرئة¹. الفيزيولوجيا المرضية للتليف الرئوي معقدة ، وخيارات العلاج محدودة للغاية حاليا. تظل نماذج الماوس أداة مهمة لدراسة الآليات المسببة للأمراض التي تساهم في ظهور المرض وتطوره ، وكذلك الاستراتيجيات الجديدة لتطوير الأدوية.

تعتمد مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية للتليف الرئوي على التقطير داخل القصبة الهوائية ل BLM^{2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12}. ومع ذلك ، فإن توزيع التغيرات الليفية التي يسببها BLM في الرئتين ليس موحدا ، معرضة لخطر الاختناق أثناء عملية التقطير. على الرغم من أن الحقن داخل الصفاق من BLM يؤدي إلى تغييرات ليفية موحدة نسبيا في الرئة ، إلا أنه يتطلب جرعات متعددة بسبب عدم كفاية استهداف الدواء. لا يتطلب إعطاء الهباء الجوي داخل القصبة الهوائية عبر منظار الحنجرة بضع القصبة الهوائية أو ثقب ، وتوزيع الدواء الناتج داخل الرئة هو الأمثل. ومع ذلك ، فإن جزيئات الهباء الجوي كبيرة (5-40 ميكرومتر) ، وبالتالي لا يمكن أن تصل إلى المنطقة تحت الجنبة من أنسجة الرئة.

في هذه الدراسة ، يتم إجراء إدارة BLM داخل الرئة عن طريق الإرذاذ الأنفي. أثناء الإرذاذ ، تنفست الفئران تلقائيا واستنشقت جزيئات الدواء. كان حجم الجسيمات الهباء الجوي 2.5-4 ميكرومتر ، مما مكنها ليس فقط من التوزيع بالتساوي في جميع أنحاء الرئة ولكن أيضا للوصول إلى المنطقة تحت الجنبة. في ظل التكبير المنخفض ، فإن أهم السمات النسيجية المرضية الرئوية للمرضى الذين يعانون من التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) هي الشدة المتفاوتة للآفات ، والتوزيع غير المتسق ، والتوزيع المتناوب لآفات الطور المختلفة ، ووجود التهاب خلالي ، وآفات ليفية ، وتغيرات الرئة على شكل قرص العسل ، بالتناوب مع أنسجة الرئة الطبيعية. تشمل هذه التغيرات المرضية في الغالب الحمة تحت الجنبية المحيطية أو الحاجز الفصيصي حول القصيبات. وبالتالي ، بالنظر إلى أن هذا النهج يمكن جزيئات BLM من الوصول إلى المنطقة تحت الجنبية من الرئتين ، فإن هذا النموذج يحاكي عن كثب الخصائص السريرية للمرض لدى البشر.

Protocol

وافقت لجنة الدراسات الحيوانية في مستشفى الصداقة الصينية اليابانية (بكين ، الصين) على جميع الإجراءات التي شملت الفئران والتي تم إجراؤها كجزء من هذه الدراسة (رقم 190108). تم الاحتفاظ بالفئران في غرفة المعقمة في معهد الصداقة الصينية اليابانية للبحوث الطبية السريرية ، مع درجة حرارة الغرفة من 20-25 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية من 40 ٪ -70 ٪ ، وشدة ضوء من 15-20 LX ، والتناوب الضوء والظلام لمدة 12 ساعة / 12 ساعة. كان للحيوانات حرية الوصول إلى الطعام والماء.

1. الفئران

1. تأكد من تأقلم جميع مع مرفق السكن لمدة 7 أيام قبل الإرذاذ.
2. استخدم ذكور الفئران C57BL / 6 ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع ، للرذاذ.

2. إرذاذ بليوميسين الأنف

1. إعداد بليوميسين
   تنبيه: BLM هو سم كيميائي يقتل الأورام ولكنه قد يتلف أيضا الخلايا الطبيعية والأنسجة الطبيعية.
   1. تحضير حل BLM على مقعد نظيف.
      1. للحصول على تركيز العمل (7 وحدة / مل) ، أعد تعليق 15 وحدة من هيدروكلوريد BLM في 2.14 مل من المحلول الملحي العادي. امزج BLM المعاد تعليقه بعناية حتى يذوب تماما.
   2. تخزين حل العمل في 4 °C أو على الجليد واستخدامها في غضون 1 يوم. قبل الإرذاذ ، أحضر محلول BLM إلى درجة حرارة الغرفة.
2. تخدير
   1. الاستعداد للتخدير عن طريق إذابة 0.1 غرام من الصوديوم بنتوباربيتال في 10 مل من المياه المالحة العادية. قم بتخزين محلول التخدير العامل في مكان مظلم عند 4 درجات مئوية واستخدمه في غضون 3 أيام.
   2. تخدير الفئران عن طريق حقن الصوديوم بنتوباربيتال في البطن ، باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 26 غرام ، بجرعة نهائية من 75 ملغم / كغم من وزن الجسم.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، لم تستجب الفئران لهذه الجرعة لمدة 30 دقيقة على الأقل. إذا لزم الأمر ، اضبط الجرعة بالتشاور مع الطبيب البيطري وفقا لاستجابة الماوس.
   3. بعد بضع دقائق ، اضغط على أصابع الفأر المخدرة بالسبابة والإبهام للتأكد من اختفاء منعكس سحب الأطراف.
3. إعداد نظام الإرذاذ
   1. بعد معايرة الجهاز ، قم بتأمين الماوس المخدر بغطاء شبكي ناعم (الشكل 1 أ) ، وأضف محلول BLM العامل إلى رأس التفتيت العلوي لبرج التعرض باستخدام ماصة (الشكل 1 ب) ، وقم بتشغيل البخاخات لمدة 30 دقيقة لتحقيق الانحلال المستقر.
      ملاحظة: يظهر سير العمل في الشكل 1C ، D. للحصول على خطوات التشغيل التفصيلية للبرنامج ، راجع الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2 ، الذي يوضح الخطوات 2.3.1.1-2.3.1.9.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز flexiWare 8 (الشكل التكميلي S1A) ، وانقر فوق جلسة التجريب (الشكل التكميلي S1B) ، وانقر فوق الزر "دراسة جديدة " (الشكل التكميلي S1C).
      2. عدل اسم التجربة (الشكل التكميلي S1D) وعدل العنوان والمالك (الشكل التكميلي S1E).
      3. اختر قالب IX-4DIO (الشكل التكميلي S1F) ، وأدخل المشغل (الشكل التكميلي S1G) ، وانقر فوق الزر تأكيد (الشكل التكميلي S1H) | الزر التالي (الشكل التكميلي S1I).
      4. اختر المضخة وانقر على التالي (الشكل التكميلي S1J) | الزر التالي (الشكل التكميلي S2A) | الزر التالي (الشكل التكميلي S2B) | الزر "إنهاء " (الشكل التكميلي S2C).
      5. انقر فوق إعدادات Continuous-1Lmin (ثلاث نقاط ، الشكل التكميلي S2D) | DIO1، قم بتعيين دورة العمل (٪) إلى 25٪، ثم انقر فوق موافق (الشكل التكميلي S2E).
      6. انقر فوق DIO2، واضبط دورة العمل (٪) على 25٪، ثم انقر فوق موافق (الشكل التكميلي S2F).
      7. انقر فوق DIO3 ، واضبط دورة العمل (٪) على 25٪ ، ثم انقر فوق موافق (الشكل التكميلي S2G).
      8. انقر فوق DIO4، واضبط دورة العمل (٪) على 25٪، ثم انقر فوق موافق (الشكل التكميلي S2H).
      9. انقر فوق الزر الأخضر العلوي (يسار) لبدء التشغيل ، وانقر فوق الزر الأحمر (يمين) لإيقاف العمل. انقر فوق x في الزاوية العلوية اليمنى لإنهاء (الشكل التكميلي S2I).
   2. في مجموعة BLM ، قم بتفتيت 12 فأرا في وقت واحد ، لأربع مرات في المجموع ، حتى ما يصل إلى 48 فأرا. تفتيت ستة فئران في وقت واحد في مجموعة التحكم العادية مع محلول ملحي عادي.
4. استعادة
   1. بعد العلاج في البخاخات لمدة 30 دقيقة ، انقل الماوس إلى قفص استرداد مجهز بوسادة تدفئة.
   2. راقب الفئران حتى تصبح واعية تماما.
   3. بمجرد التأكد من أن الماوس في حالة جيدة ، مما يعني أنه يمكنه التحرك بحرية ، قم بإعادته إلى قفصه الأصلي. لا تضعه مع الأخرى حتى يتعافى تماما.
   4. تحقق من المؤشرات الفسيولوجية ، بما في ذلك معدل التنفس والبقاء على قيد الحياة وأي أعراض ، مرتين خلال 24 ساعة بعد العلاج باستخدام BLM.

3. معالجة أنسجة الرئة

1. في 9 و 16 و 23 يوما بعد إعطاء BLM ، التضحية بستة فئران عن طريق حقنها في البطن بصوديوم بنتوباربيتال (الجرعة النهائية 100 مجم / كجم من وزن الجسم).
2. قم بإزالة القصبة الهوائية والرئتين واشطفها على الفور بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات.
3. ثبت الرئة اليسرى في محلول فورمالين محايد بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة قبل تضمين البارافين.
4. تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين (تلطيخ H&E & E)
   1. تجفيف أنسجة الرئة الثابتة في مجفف.
   2. ضع كتلة أنسجة الرئة المجففة في صندوق إذابة الشمع عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   3. للتضمين ، صب البارافين المذاب في صندوق القالب ، ثم ضع بسرعة كتلة الأنسجة المشبعة بالبارافين في أسفل صندوق القالب ، بارد ، وتصلب.
   4. قم بتثبيت كتلة الشمع المضمنة على الميكروتوم ، واضبط طاولة التقطيع لأعلى ولأسفل إلى الموضع المناسب ، وادفع الشفرة ، واضبط المقياس ، وقطع شريحة بسمك 4 ميكرومتر. استخدم الملقط لوضع الشريحة في صندوق عرض مملوء بالماء لفك تجعيدها (الجانب الأمامي لأعلى).
   5. التصحيح وخبز الشرائح. بعد أن تتجعد شريحة الشمع تماما ، ضع الشريحة الزجاجية على شريحة الشمع بزاوية 135 درجة ، واستخدم الملقط لتحريك شريحة الشمع على الشريحة الزجاجية ، وارفع الشريحة الزجاجية ، واضبط موضع شريحة الشمع حسب الحاجة. ضع الشرائح مع شرائح الشمع المثبتة على طاولة درجة حرارة ثابتة عند 47 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة للسماح للشرائح مرة أخرى بالتفكك ؛ بمجرد أن تصبح الشرائح مسطحة تماما ، ضع الشرائح في حاضنة 62 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   6. لإزالة الشمع ، ضع الشرائح المخبوزة في الزيلين لمدة 20 دقيقة مرتين.
   7. للإماهة ، ضع الشرائح في سلسلة كحول متدرجة لإعادة ترطيب شرائح أنسجة الرئة: 100٪ كحول لمدة 2 دقيقة ، 95٪ كحول لمدة 1 دقيقة ، 90٪ كحول لمدة 1 دقيقة ، 85٪ كحول لمدة 1 دقيقة ، 75٪ كحول لمدة 1 دقيقة ، وماء مقطر لمدة 3 دقائق.
   8. تلطيخ المقاطع في الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق. يغسل لمدة 1 دقيقة مرتين ، ثم يوضع في محلول تمايز كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 0.5٪ لمدة 5 ثوان ، ويغسل بالماء لمدة 1 دقيقة مرتين ، ويوضع في محلول تلطيخ أزرق لمدة 8-10 ثوان ، ويشطف مرتين بماء الصنبور ، ويطهى بالإيوزين لمدة 30 ثانية.
   9. للجفاف وإزالة البقع ، ضع الأجزاء الملطخة في 75٪ كحول لمدة 1 دقيقة ، 85٪ كحول لمدة 1 دقيقة ، 90٪ كحول لمدة دقيقة واحدة ، 95٪ كحول لمدة دقيقة واحدة ، كحول 100٪ لمدة دقيقة واحدة ، ثم زيلين لمدة دقيقة واحدة مرتين ، وقم بإزالة كل السائل المتبقي بورق ماص.
   10. للتركيب ، قم بتسريع قطرة من محلول ختم اللثة المحايد في منتصف الشريحة وقم بتركيب غطاء.
5. معيار التصنيف المورفولوجي لأنسجة رئة الفأر
   1. باستخدام الطريقة التي وصفها Ashcroft et al. ، اطلب من محقق أعمى عن المجموعة التجريبية اختيار ثلاثة حقول مجهرية عشوائيا من كل عينة ، ومراقبة درجة التليف الرئوي عند تكبير 100x: الدرجة 0 ، الرئة الطبيعية. الصف 1 ، الحويصلات الهوائية منتفخة قليلا ، تليف خفيف موضعي ؛ الصف 2 ، تليف ملحوظ (سمك الجدار السنخي أكبر من ثلاث مرات طبيعية) ، مع بؤر ليفية ؛ الصف 3 ، مناطق مستمرة من التليف (سمك الجدار السنخي ثلاث مرات أكبر من المعتاد) ؛ الصف 4 ، اندماج البؤر الليفية ، مع المنطقة الليفية التي تمثل أقل من 10 ٪ من أنسجة الرئة ؛ الصف 5 ، يتم دمج البؤر الليفية ، ومنطقة التليف هي 10 ٪ إلى 50 ٪ ، وتلف الهيكل السنخي بشكل كبير ؛ الصف 6 ، بؤر ليفية كبيرة مستمرة (أكبر من 50 ٪ من أنسجة الرئة) ؛ الصف 7 ، تمتلئ المساحة السنخية بالأنسجة الليفية ، توجد فقاعات رئوية ؛ الصف 8 ، التليف الكامل.
   2. قم بتعيين درجة مقابلة للتقدير لكل مجال عرض (على سبيل المثال ، الصف 4 يساوي أربع نقاط) ، وقم بتسجيل كل مجموعة من ست عينات بشكل منفصل.

النتائج

تم إحداث إصابة الرئة بواسطة BLM البخاخات ، وتم إرذاذ الضابطة بنفس الحجم من المحلول الملحي الطبيعي. تم إرذاذ الفئران مرة واحدة في اليوم لمدة 3 أيام ، 30 دقيقة في اليوم ، باستخدام تركيز BLM من 7 وحدة / مل. تم التضحية بالفئران في الأيام 9 و 16 و 23 بعد إعطاء BLM لتلطيخ H& E (الشكل 2 ب

Discussion

يؤدي الحقن داخل القصبة الهوائية للبليوميسين إلى استجابة التهابية وتليفية حادة في كلتا الرئتين ويمكن اعتباره نهجا فعالا لإنشاء نموذج تجريبي للفأر لمرض الرئة الخلالي البشري. الإدارة داخل القصبة الهوائية هي الطريق الأكثر استخداما للإدارة^2،3

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice