Um modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por nebulização de bleomicina nasal

Resumo

Vários modelos animais de fibrose pulmonar foram estabelecidos usando bleomicina para esclarecer a patogênese da fibrose pulmonar e encontrar novos alvos de drogas. No entanto, a maioria dos modelos de fibrose pulmonar direcionados ao tecido pulmonar tem administração desigual de medicamentos. Aqui, propomos um modelo de fibrose pulmonar uniforme induzida por nebulização de bleomicina nasal.

Resumo

A fibrose pulmonar é característica de várias doenças pulmonares humanas que surgem de várias causas. Dado que as opções de tratamento são bastante limitadas, os modelos de camundongos continuam a ser uma ferramenta importante para o desenvolvimento de novas estratégias antifibróticas. Neste estudo, a administração intrapulmonar de bleomicina (BLM) é realizada por nebulização nasal para criar um modelo de camundongo de fibrose pulmonar que imita de perto as características clínicas da doença. Camundongos C57BL/6 receberam BLM (7 U/mL, 30 min/dia) por nebulização nasal por 3 dias consecutivos e foram sacrificados no dia 9, 16 ou 23 para observar alterações inflamatórias e fibróticas no tecido pulmonar. O BLM aerossolizado nasal atingiu diretamente os pulmões, resultando em inflamação e fibrose pulmonar generalizada e uniforme. Assim, geramos com sucesso um modelo experimental de camundongo de fibrose pulmonar humana típica. Este método poderia ser facilmente usado para estudar os efeitos da administração de vários aerossóis nasais na fisiopatologia pulmonar e validar novos tratamentos anti-inflamatórios e antifibróticos.

Introdução

A fibrose pulmonar é um processo de doença progressiva no qual a deposição excessiva de componentes da matriz extracelular, principalmente colágeno tipo I, no interstício dos pulmões leva ao comprometimento da função pulmonar¹. A fisiopatologia da fibrose pulmonar é complexa e as opções de tratamento são atualmente bastante limitadas. Os modelos de camundongos continuam sendo uma ferramenta importante para estudar os mecanismos patogênicos que contribuem para o surgimento e progressão da doença, bem como novas estratégias para o desenvolvimento de medicamentos.

Uma variedade de modelos animais de fibrose pulmonar depende da instilação intratraqueal de BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. No entanto, a distribuição das alterações fibróticas que o BLM causa nos pulmões não é uniforme, e os animais correm o risco de asfixia durante o processo de instilação. Embora a injeção intraperitoneal de BLM induza alterações fibróticas relativamente uniformes no pulmão, ela requer doses múltiplas devido ao direcionamento insuficiente do medicamento. A administração de aerossol intratraqueal por meio de um laringoscópio não requer traqueotomia ou punção, e a distribuição do medicamento resultante no pulmão é ideal. No entanto, as partículas aerossolizadas são grandes (5-40 μm) e, portanto, não podem atingir a área subpleural do tecido pulmonar.

Neste estudo, a administração intrapulmonar de BLM é realizada por nebulização nasal. Durante a nebulização, os camundongos respiraram espontaneamente e inalaram as partículas da droga. As partículas aerossolizadas tinham 2,5-4 μm de tamanho, o que lhes permitiu não apenas se distribuir uniformemente por todo o pulmão, mas também atingir a área subpleural. Sob baixa ampliação, as características histopatológicas pulmonares mais significativas de pacientes com fibrose pulmonar idiopática (FPI) são a gravidade variável das lesões, distribuição inconsistente, distribuição alternada de lesões de diferentes fases e a presença de inflamação intersticial, lesões fibróticas e alterações pulmonares em favo de mel, alternando com tecido pulmonar normal. Essas alterações patológicas envolvem predominantemente o parênquima subpleural periférico ou septo lobular ao redor dos bronquíolos. Assim, dado que essa abordagem permite que as partículas de BLM atinjam a área subpleural dos pulmões, esse modelo simula de perto as características clínicas da doença em humanos.

Protocolo

O Comitê de Estudos Animais do Hospital da Amizade China-Japão (Pequim, China) aprovou todos os procedimentos envolvendo camundongos que foram realizados como parte deste estudo (NO.190108). Os camundongos foram mantidos na sala de animais estéreis do Instituto de Pesquisa Médica Clínica da Amizade China-Japão, com temperatura ambiente de 20-25 °C, umidade relativa de 40%-70%, intensidade de luz animal de 15-20 LX e luz e escuridão alternadas por 12 h/12 h. Os animais tinham livre acesso a comida e água.

1. Ratos

1. Certifique-se de que todos os animais estejam aclimatados ao alojamento por 7 dias antes da nebulização.
2. Use camundongos C57BL/6 machos, com idade entre 8 e 10 semanas, para nebulização.

2. Nebulização de bleomicina nasal

1. Preparação de bleomicina
   CUIDADO: O BLM é um veneno químico, que mata tumores, mas também pode danificar células e tecidos normais.
   1. Prepare a solução BLM em uma bancada limpa.
      1. Para obter a concentração de trabalho (7 U/mL), ressuspenda 15 U de cloridrato de BLM em 2,14 mL de solução salina normal. Misture cuidadosamente o BLM ressuspenso até que esteja completamente dissolvido.
   2. Armazene a solução de trabalho a 4 °C ou no gelo e use dentro de 1 dia. Antes da nebulização, leve a solução BLM à temperatura ambiente.
2. Anestesia
   1. Prepare-se para a anestesia dissolvendo 0,1 g de pentobarbital sódico em 10 mL de solução salina normal. Armazene a solução de anestesia de trabalho em um local escuro a 4 °C e use dentro de 3 dias.
   2. Anestesiar os camundongos injetando o pentobarbital sódico no abdômen, usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G, na dose final de 75 mg / kg de peso corporal.
      NOTA: Neste estudo, os camundongos não responderam a esta dose por pelo menos 30 minutos. Se necessário, ajuste a dose em consulta com o veterinário de acordo com a resposta do camundongo.
   3. Após alguns minutos, pressione os dedos dos pés do camundongo anestesiado com o dedo indicador e o polegar para garantir que o reflexo de retirada do membro tenha desaparecido.
3. Preparação do sistema de nebulização
   1. Depois de calibrar o instrumento, prenda o mouse anestesiado com uma tampa de malha macia (Figura 1A), adicione a solução BLM de trabalho à cabeça atomizadora superior da torre de exposição com uma pipeta (Figura 1B) e opere o nebulizador por 30 min para obter uma atomização estável.
      NOTA: O fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1C,D. Para obter etapas detalhadas de operação do software, consulte a Figura Suplementar S1 e a Figura Suplementar S2, que ilustram as etapas 2.3.1.1-2.3.1.9.
      1. Clique duas vezes no ícone do flexiWare 8 (Figura Suplementar S1A), clique em sessão de experimentação (Figura Suplementar S1B) e clique no botão Novo Estudo (Figura Suplementar S1C).
      2. Edite o nome do experimento (Figura Suplementar S1D) e edite o Título e o Proprietário (Figura Suplementar S1E).
      3. Escolha o modelo IX-4DIO (Figura Suplementar S1F), insira o operador (Figura Suplementar S1G), clique no botão Confirmar (Figura Suplementar S1H) | Botão Avançar (Figura Suplementar S1I).
      4. Escolha a Bomba e clique em próximo (Figura Suplementar S1J) | Botão Avançar (Figura Suplementar S2A) | Botão Avançar (Figura Suplementar S2B) | Botão Concluir (Figura Suplementar S2C).
      5. Clique nas configurações para Contínuo-1Lmin (três pontos, Figura Suplementar S2D) | DIO1, defina o Ciclo de Trabalho (%) como 25% e clique em OK (Figura Suplementar S2E).
      6. Clique em DIO2, defina o Ciclo de Trabalho (%) como 25% e clique em OK (Figura Suplementar S2F).
      7. Clique em DIO3, defina o Ciclo de Trabalho (%) como 25% e clique em OK (Figura Suplementar S2G).
      8. Clique em DIO4, defina o Ciclo de Trabalho (%) para 25% e clique em OK (Figura Suplementar S2H).
      9. Clique no botão verde superior (esquerda) para começar a operar e clique no botão vermelho (direita) para interromper o trabalho. Clique no x no canto superior direito para sair (Figura Suplementar S2I).
   2. No grupo BLM, atomize 12 camundongos por vez, quatro vezes no total, até um total de 48 camundongos. Atomize seis camundongos de cada vez no grupo de controle normal com solução salina normal.
4. Recuperação de animais
   1. Após o tratamento no nebulizador por 30 min, mova o mouse para uma gaiola de recuperação equipada com uma almofada de aquecimento.
   2. Observe os ratos até que estejam totalmente conscientes.
   3. Assim que o mouse estiver em boas condições, o que significa que ele pode se mover livremente, devolva-o à sua gaiola original. Não o coloque com outros animais até que esteja completamente recuperado.
   4. Verifique os índices fisiológicos, incluindo frequência respiratória, sobrevida e quaisquer sintomas, duas vezes durante as 24 horas após o tratamento com BLM.

3. Processamento de tecido pulmonar

1. Aos 9, 16 e 23 dias após a administração de BLM, sacrifique seis camundongos injetando-os no abdômen com pentobarbital sódico (dose final de 100 mg / kg de peso corporal).
2. Remova a traqueia e os pulmões e enxágue imediatamente com solução salina tamponada com fosfato frio.
3. Fixe o pulmão esquerdo em tampão formalina neutro a 10% por 24 h antes da inclusão em parafina.
4. Coloração de hematoxilina-eosina (coloração H&E)
   1. Desidrate o tecido pulmonar fixo em um desidratador.
   2. Colocar o bloco de tecido pulmonar desidratado numa caixa de dissolução de cera a 56 °C durante 1 h.
   3. Para incorporar, despeje a parafina derretida na caixa do molde e, em seguida, coloque rapidamente o bloco de tecido impregnado de parafina na parte inferior da caixa do molde, esfrie e solidifique.
   4. Fixe o bloco de cera embutido no micrótomo, ajuste a mesa de corte para cima e para baixo para uma posição apropriada, empurre a lâmina, ajuste a escala e corte uma fatia com uma espessura de 4 μm. Use uma pinça para colocar a fatia em uma caixa de exibição cheia de água para desenrolar (com a frente para cima).
   5. Remende e leve ao forno as fatias. Depois que a fatia de cera estiver completamente desenrolada, coloque a lâmina de vidro contra a fatia de cera em um ângulo de 135°, use uma pinça para mover a fatia de cera para a lâmina de vidro, levante a lâmina de vidro e ajuste a posição da fatia de cera conforme necessário. Coloque as lâminas com fatias de cera montadas em uma mesa de temperatura constante a 47 °C por 1 min para permitir que as fatias se desenrolem novamente; quando as fatias estiverem completamente planas, colocar as lâminas numa incubadora a 62 °C durante 1 h.
   6. Para desparafinar, coloque as lâminas assadas em xileno por 20 min duas vezes.
   7. Para reidratação, coloque as lâminas em uma série de álcool graduado para reidratar as fatias de tecido pulmonar: álcool 100% por 2 min, álcool 95% por 1 min, álcool 90% por 1 min, álcool 85% por 1 min, álcool 75% por 1 min e água destilada por 3 min.
   8. Manchar as seções em hematoxilina por 5 min. Lave por 1 min duas vezes, depois coloque em uma solução de diferenciação de álcool de ácido clorídrico a 0,5% por 5 s, lave com água por 1 min duas vezes, coloque em solução de coloração azul por 8 a 10 s, enxágue duas vezes com água da torneira e mante com eosina por 30 s.
   9. Para desidratação e descoloração, coloque as seções manchadas em álcool 75% por 1 min, álcool 85% por 1 min, álcool 90% por 1 min, álcool 95% por 1 min, álcool 100% por 1 min e, em seguida, xileno por 1 min duas vezes e remova todo o líquido restante com papel absorvente.
   10. Para a montagem, passe uma gota de solução de vedação de goma neutra no meio da fatia e monte uma lamínula.
5. Padrão de classificação morfológica do tecido pulmonar de camundongo
   1. Usando o método descrito por Ashcroft et al., um investigador cego para o grupo experimental selecionou aleatoriamente três campos microscópicos de cada amostra e observou o grau de fibrose pulmonar com aumento de 100x: grau 0, pulmão normal; grau 1, alvéolos ligeiramente inchados, fibrose leve localizada; grau 2, fibrose acentuada (espessura da parede alveolar maior que três vezes o normal), com focos fibrosos; grau 3, áreas contínuas de fibrose (espessura da parede alveolar três vezes maior que o normal); grau 4, fusão de focos fibrosos, com a área fibrótica representando menos de 10% do tecido pulmonar; grau 5, os focos fibrosos são fundidos, a área de fibrose é de 10% a 50% e a estrutura alveolar está significativamente danificada; grau 6, grandes focos fibrosos contínuos (maior que 50% do tecido pulmonar); grau 7, o espaço alveolar é preenchido com tecido fibroso, bolhas pulmonares estão presentes; grau 8, fibrose completa.
   2. Atribua uma pontuação correspondente à nota a cada campo de visão (por exemplo, nota 4 equivale a quatro pontos) e pontue cada grupo de seis amostras separadamente.

Resultados

A lesão pulmonar foi induzida por BLM nebulizada, e os animais controle foram nebulizados com o mesmo volume de solução salina normal. Os camundongos foram nebulizados uma vez ao dia durante 3 dias, 30 min por dia, usando uma concentração de BLM de 7 U / mL. Os camundongos foram sacrificados nos dias 9, 16 e 23 após a administração de BLM para coloração H & E ( Figura 2B ). Lesões pneumônicas difusas com perda da arquitetura alveolar normal, espessamento sept...

Discussão

A injeção intratraqueal de bleomicina resulta em uma resposta inflamatória e fibrótica aguda em ambos os pulmões e pode ser considerada uma abordagem eficaz para estabelecer um modelo experimental de camundongo de doença pulmonar intersticial humana. A administração intratraqueal é a via de administração mais comumente utilizada 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice