מודל עכבר של פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי נבוליזציה של בלומיצין באף

Summary

מודלים שונים של בעלי חיים של פיברוזיס ריאתי הוקמו באמצעות בלומיצין כדי להבהיר את הפתוגנזה של פיברוזיס ריאתי ולמצוא מטרות תרופות חדשות. עם זאת, רוב המודלים פיברוזיס ריאתי המכוונים לרקמת הריאה יש מתן תרופות לא אחיד. כאן, אנו מציעים מודל של פיברוזיס ריאתי אחיד המושרה על ידי nebulization בלומיצין האף.

Abstract

פיברוזיס ריאתי אופייני למספר מחלות ריאה אנושיות הנובעות מסיבות שונות. בהתחשב בכך שאפשרויות הטיפול מוגבלות למדי, מודלים של עכברים ממשיכים להיות כלי חשוב לפיתוח אסטרטגיות אנטי-פיברוטיות חדשות. במחקר זה, מתן תוך ריאתי של בלומיצין (BLM) מתבצע על ידי ערפיליזציה של האף כדי ליצור מודל עכברי של פיברוזיס ריאתי המחקה באופן הדוק מאפייני מחלה קליניים. עכברי C57BL/6 קיבלו BLM (7 U/mL, 30 דקות ליום) על ידי ערפיליזציה באף במשך 3 ימים רצופים והוקרבו ביום 9, 16 או 23 כדי לצפות בשינויים דלקתיים ופיברוטיים ברקמת הריאה. BLM אירוסולי באף התמקד ישירות בריאות, וכתוצאה מכך דלקת ריאות נרחבת ואחידה ופיברוזיס. לפיכך, יצרנו בהצלחה מודל עכברי ניסיוני של פיברוזיס ריאתי אנושי טיפוסי. שיטה זו יכולה לשמש בקלות כדי ללמוד את ההשפעות של מתן אירוסולים שונים באף על פתופיזיולוגיה של הריאות ולאמת טיפולים אנטי דלקתיים ואנטי פיברוטיים חדשים.

Introduction

פיברוזיס ריאתי הוא תהליך מחלה פרוגרסיבי שבו שקיעת יתר של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, בעיקר קולגן מסוג I, באינטרסטיציום של הריאות מובילה לתפקוד ריאות לקוי¹. הפתופיזיולוגיה של פיברוזיס ריאתי מורכבת, ואפשרויות הטיפול כיום מוגבלות למדי. מודלים עכבריים נותרו כלי חשוב לחקר המנגנונים הפתוגניים התורמים להופעתה והתקדמותה של המחלה, כמו גם אסטרטגיות חדשות לפיתוח תרופות.

מגוון מודלים של פיברוזיס ריאתי בבעלי חיים מסתמכים על החדרה תוך-טרכאלית של BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. עם זאת, התפלגות השינויים הפיברוטיים שגורם BLM בריאות אינה אחידה, ובעלי החיים נמצאים בסכנת חנק בתהליך ההחדרה. למרות שהזרקה תוך צפקית של BLM גורמת לשינויים פיברוטיים אחידים יחסית בריאה, היא דורשת מינונים מרובים בגלל מיקוד תרופתי לא מספיק. מתן תרסיס תוך טרכאלי באמצעות לרינגוסקופ אינו דורש טרכאוטומיה או ניקוב, וחלוקת התרופות המתקבלת בתוך הריאה היא אופטימלית. עם זאת, החלקיקים האירוסוליים גדולים (5-40 מיקרומטר), ולכן אינם יכולים להגיע לאזור התת-פלאורלי של רקמת הריאה.

במחקר זה, ניהול תוך ריאתי של BLM מתבצע על ידי nebulization האף. במהלך הערפיליזציה, העכברים נשמו באופן ספונטני ושאפו את חלקיקי התרופה. גודלם של החלקיקים האירוסוליים היה 2.5-4 מיקרומטר, מה שאפשר להם לא רק להתפזר באופן שווה ברחבי הריאה אלא גם להגיע לאזור התת-פלאורלי. תחת הגדלה נמוכה, המאפיינים ההיסטופתולוגיים המשמעותיים ביותר של הריאות של חולים עם פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) הם חומרת הנגעים המשתנה, התפלגות לא עקבית, התפלגות לסירוגין של נגעים בפאזה שונה, ונוכחות של דלקת אינטרסטיציאלית, נגעים פיברוטיים ושינויים בריאה חלת דבש, לסירוגין עם רקמת ריאה רגילה. שינויים פתולוגיים אלה כוללים בעיקר את parenchyma subpleural היקפי או מחיצת לובולרית סביב הסמפונות. לפיכך, בהתחשב בכך שגישה זו מאפשרת לחלקיקי BLM להגיע לאזור התת-פלאורלי של הריאות, מודל זה מדמה באופן הדוק את המאפיינים הקליניים של המחלה בבני אדם.

Protocol

הוועדה ללימודי בעלי חיים של בית החולים לידידות סין-יפן (בייג'ינג, סין) אישרה את כל ההליכים המערבים עכברים שבוצעו במסגרת מחקר זה (NO.190108). עכברים הוחזקו בחדר החיות הסטרילי של מכון המחקר הרפואי הקליני ידידות סין-יפן, עם טמפרטורת חדר של 20-25 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 40%-70%, עוצמת אור בעלי חיים של 15-20 LX, ואור וחושך לסירוגין במשך 12 שעות / 12 שעות. לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים.

1. עכברים

1. ודא כי כל בעלי החיים מאוקלמים במתקן הדיור במשך 7 ימים לפני nebulization.
2. השתמש בעכברי C57BL/6 זכרים, בגילאי 8-10 שבועות, לערפיליזציה.

2. ערפיליזציה של בלומיצין באף

1. הכנת בלומיצין
   זהירות: BLM הוא רעל כימי, אשר הורג גידולים אך עלול גם לפגוע בתאים נורמליים וברקמות נורמליות.
   1. הכינו פתרון BLM על ספסל נקי.
      1. כדי להשיג את ריכוז העבודה (7 U / mL), להשהות מחדש 15 U של הידרוכלוריד BLM ב 2.14 מ"ל של מלוחים רגילים. ערבבו בזהירות את BLM המושעה עד שהוא מומס לחלוטין.
   2. אחסנו את פתרון העבודה בטמפרטורה של 4°C או על קרח והשתמשו תוך יום אחד. לפני הערפיליזציה, הביאו את תמיסת BLM לטמפרטורת החדר.
2. הרדמה
   1. היכונו להרדמה על ידי המסת 0.1 גרם של נתרן pentobarbital ב 10 מ"ל של מלוחים רגילים. יש לאחסן את תמיסת ההרדמה העובדת במקום חשוך בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 3 ימים.
   2. מרדימים את העכברים על ידי הזרקת נתרן pentobarbital לתוך הבטן, באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 גרם, במינון סופי של 75 מ"ג / ק"ג משקל הגוף.
      הערה: במחקר זה, העכברים לא הגיבו למינון זה במשך 30 דקות לפחות. במידת הצורך, התאימו את המינון בהתייעצות עם הווטרינר בהתאם לתגובת העכבר.
   3. לאחר מספר דקות, לחץ על אצבעות רגלי העכבר המורדם עם האצבע המורה והאגודל כדי לוודא שרפלקס נסיגת הגפיים נעלם.
3. הכנת מערכת הערפיליזציה
   1. לאחר כיול המכשיר, אבטחו את העכבר המורדם באמצעות כיסוי רשת רך (איור 1A), הוסיפו את תמיסת BLM העובדת לראש האטומיזציה העליון של מגדל החשיפה באמצעות פיפטה (איור 1B), והפעילו את הנבולייזר במשך 30 דקות כדי להשיג אטומיזציה יציבה.
      הערה: זרימת העבודה מוצגת באיור 1C,D. לקבלת שלבי פעולה מפורטים של התוכנה, עיין באיור המשלים S1 ובאיור המשלים S2, הממחישים שלבים 2.3.1.1-2.3.1.9.
      1. לחצו פעמיים על האייקון flexiWare 8 (איור משלים S1A), לחצו על ניסוי (איור משלים S1B) ולחצו על כפתור מחקר חדש (איור משלים S1C).
      2. ערוך את שם הניסוי (איור משלים S1D) וערוך את הכותרת והבעלים (איור משלים S1E).
      3. בחר את תבנית IX-4DIO (איור משלים S1F), הזן את האופרטור (איור משלים S1G), לחץ על הלחצן אישור (איור משלים S1H) | הלחצן הבא (איור משלים S1I).
      4. בחר את המשאבה ולחץ על הבא (איור משלים S1J) | הלחצן הבא (איור משלים S2A) | הלחצן הבא (איור משלים S2B) | לחצן סיום (איור משלים S2C).
      5. לחץ על הגדרות עבור רציף-1Lmin (שלוש נקודות, איור משלים S2D) | DIO1, הגדר את מחזור העבודה (%) ל- 25% ולאחר מכן לחץ על אישור (איור משלים S2E).
      6. לחץ על DIO2, הגדר את מחזור העבודה (%) ל- 25% ולאחר מכן לחץ על אישור (איור משלים S2F).
      7. לחץ על DIO3, הגדר את מחזור העבודה (%) ל- 25% ולאחר מכן לחץ על אישור (איור משלים S2G).
      8. לחץ על DIO4, הגדר את מחזור העבודה (%) ל- 25% ולאחר מכן לחץ על אישור (איור משלים S2H).
      9. לחץ על הלחצן הירוק העליון (משמאל) כדי להתחיל לפעול, ולחץ על הלחצן האדום (מימין) כדי להפסיק את העבודה. לחץ על ה- x בפינה השמאלית העליונה כדי לצאת (איור משלים S2I).
   2. בקבוצת BLM, אאטום 12 עכברים בכל פעם, במשך ארבע פעמים בסך הכל, עד לסך של 48 עכברים. אטומיזציה של שישה עכברים בכל פעם בקבוצת הביקורת הרגילה עם מי מלח רגילים.
4. שיקום בעלי חיים
   1. לאחר טיפול בנבולייזר במשך 30 דקות, להעביר את העכבר לכלוב התאוששות מצויד כרית חימום.
   2. התבוננו בעכברים עד שהם בהכרה מלאה.
   3. ברגע שהעכבר מאושר במצב טוב, מה שאומר שהוא יכול לנוע בחופשיות, החזירו אותו לכלוב המקורי שלו. אין להניח אותו עם בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.
   4. בדוק מדדים פיזיולוגיים, כולל קצב נשימה, הישרדות וכל תסמינים, פעמיים במהלך 24 השעות שלאחר הטיפול ב- BLM.

3. עיבוד רקמת ריאה

1. בגיל 9, 16 ו-23 ימים לאחר מתן BLM, יש להקריב שישה עכברים על ידי הזרקתם לבטן עם נתרן פנטוברביטל (מינון סופי של 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
2. הסר את קנה הנשימה ואת הריאות ומיד לשטוף עם מלוחים פוספט קר.
3. יש לקבע את הריאה השמאלית במאגר פורמלין נייטרלי 10% למשך 24 שעות לפני הטמעת פרפין.
4. צביעת Hematoxylin-eosin (צביעת H&E)
   1. לייבש את רקמת הריאה הקבועה במייבש.
   2. הניחו את גוש רקמת הריאה המיובשת בקופסה להמסת שעווה בטמפרטורה של 56°C למשך שעה אחת.
   3. להטבעה, יוצקים את הפרפין המומס לקופסת התבנית, ואז מניחים במהירות את גוש הרקמה ספוג הפרפין בתחתית קופסת התבנית, מצננים ומתמצקים.
   4. מקבעים את גוש השעווה המוטבע על המיקרוטום, מתאימים את שולחן החיתוך למעלה ולמטה למיקום מתאים, דוחפים את הלהב, מכוונים את קנה המידה וחותכים פרוסה בעובי של 4 מיקרומטר. השתמשו בפינצטה כדי להניח את הפרוסה בקופסת תצוגה מלאה במים כדי לפתוח את התלתלים (החלק הקדמי למעלה).
   5. מדביקים ואופים את הפרוסות. לאחר שפרוסת השעווה התכרבלה לחלוטין, הניחו את מגלשת הזכוכית על פרוסת השעווה בזווית של 135°, השתמשו בפינצטה כדי להעביר את פרוסת השעווה אל מגלשת הזכוכית, הרימו את מגלשת הזכוכית והתאימו את מיקום פרוסת השעווה לפי הצורך. הניחו את המגלשות עם פרוסות שעווה רכובות על שולחן בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 47°C למשך דקה אחת כדי לאפשר שוב לפרוסות להתכרבל; לאחר שהפרוסות שטוחות לחלוטין, הניחו את המגלשות באינקובטור של 62 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
   6. להסרת שעווה, מניחים את המגלשות האפויות בקסילן למשך 20 דקות פעמיים.
   7. להחזרת נוזלים, הניחו את המגלשות בסדרת אלכוהול מדורגת כדי להחזיר לחות לפרוסות רקמת הריאה: 100% אלכוהול למשך 2 דקות, 95% אלכוהול למשך דקה, 90% אלכוהול למשך דקה, 85% אלכוהול למשך דקה, 75% אלכוהול למשך דקה אחת ומים מזוקקים למשך 3 דקות.
   8. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5 דקות. יש לשטוף במשך דקה אחת פעמיים, ולאחר מכן להכניס לתמיסת התמיינות אלכוהול של 0.5% חומצה הידרוכלורית למשך 5 שניות, לשטוף במים למשך דקה אחת פעמיים, להכניס לתמיסת צביעה כחולה למשך 8-10 שניות, לשטוף פעמיים במי ברז ולהכתים באאוזין למשך 30 שניות.
   9. להתייבשות ועיכוב, יש להניח את החלקים המוכתמים ב-75% אלכוהול למשך דקה, 85% אלכוהול למשך דקה, 90% אלכוהול למשך דקה, 95% אלכוהול למשך דקה, 100% אלכוהול למשך דקה, ולאחר מכן קסילן למשך דקה אחת פעמיים, ולהסיר את כל הנוזלים הנותרים עם נייר סופג.
   10. להרכבה, יש להניח טיפה של תמיסת איטום מסטיק ניטרלית במרכז הפרוסה ולהרכיב כיסוי.
5. תקן דירוג מורפולוגי של רקמת ריאה עכברית
   1. באמצעות השיטה שתוארה על ידי Ashcroft et al., יש חוקר עיוור לקבוצת הניסוי לבחור באופן אקראי שלושה שדות מיקרוסקופיים מכל דגימה, ולבחון את מידת פיברוזיס ריאתי בהגדלה 100x: כיתה 0, ריאה נורמלית; כיתה 1, alveoli נפוח מעט, פיברוזיס קל מקומי; כיתה 2, פיברוזיס מסומן (עובי של קיר alveolar גדול משלוש פעמים נורמלי), עם מוקדים סיביים; כיתה 3, אזורים רציפים של פיברוזיס (עובי של קיר alveolar שלוש פעמים גדול מהרגיל); כיתה 4, איחוי של מוקדים סיביים, כאשר האזור הפיברוטי מהווה פחות מ -10% מרקמת הריאה; כיתה 5, המוקדים הסיביים מאוחים, אזור הפיברוזיס הוא 10% עד 50%, והמבנה הנאדי נפגע באופן משמעותי; כיתה 6, מוקדים סיביים רציפים גדולים (יותר מ -50% מרקמת הריאה); כיתה 7, החלל alveolar מלא רקמה סיבית, bullae ריאתי נוכחים; כיתה 8, פיברוזיס מלא.
   2. הקצו ציון המתאים לציון לכל שדה ראייה (למשל, ציון 4 שווה לארבע נקודות), והניחו ציון לכל קבוצה של שש דוגמאות בנפרד.

תוצאות

פגיעה ריאתית נגרמה על ידי BLM ערפילי, וחיות הביקורת עברו ערפיליזציה עם אותו נפח של מי מלח רגילים. העכברים עברו ערפיליזציה פעם ביום במשך 3 ימים, 30 דקות ביום, תוך שימוש בריכוז BLM של 7 U/mL. עכברים הוקרבו בימים 9, 16 ו-23 לאחר מתן BLM עבור צביעת H&E (איור 2B). נגעים פנאומוניים מפוזר...

Discussion

הזרקה תוך טרכאלית של בלומיצין גורמת לתגובה דלקתית ופיברוטית חריפה בשתי הריאות ויכולה להיחשב כגישה יעילה לביסוס מודל עכברי ניסיוני של מחלת ריאות אינטרסטיציאלית אנושית. מתן תוך קנה הנשימה הוא המסלול הנפוץ ביותר של מתן 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice