鼻腔博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

摘要

已经使用博来霉素建立了各种肺纤维化动物模型，以阐明肺纤维化的发病机制并寻找新的药物靶点。然而，大多数针对肺组织的肺纤维化模型给药不均匀。在这里，我们提出了一个由鼻腔博来霉素雾化诱导的均匀肺纤维化模型。

摘要

肺纤维化是由各种原因引起的几种人类肺部疾病的特征。鉴于治疗选择相当有限，小鼠模型仍然是开发新的抗纤维化策略的重要工具。在这项研究中，博来霉素 （BLM） 的肺内给药是通过鼻腔雾化进行的，以创建与临床疾病特征非常相似的肺纤维化小鼠模型。C57BL/6 小鼠连续 3 天经鼻雾化接受 BLM （7 U/mL，30 分钟/天），并在第 9 天、第 16 天或第 23 天处死以观察肺组织的炎症和纤维化变化。鼻雾化 BLM 直接靶向肺部，导致广泛而均匀的肺部炎症和纤维化。因此，我们成功生成了典型人肺纤维化的实验小鼠模型。这种方法可以很容易地用于研究各种鼻腔气雾剂给药对肺部病理生理学的影响，并验证新的抗炎和抗纤维化治疗方法。

引言

肺纤维化是一种进行性疾病过程，其中细胞外基质成分（主要是 I 型胶原蛋白）在肺间质中过度沉积，导致肺功能受损¹。肺纤维化的病理生理学很复杂，目前的治疗选择相当有限。小鼠模型仍然是研究导致疾病出现和进展的致病机制以及药物开发新策略的重要工具。

肺纤维化的各种动物模型依赖于 BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 的气管内滴注。然而，BLM 在肺部引起的纤维化变化的分布并不均匀，动物在滴注过程中有窒息的风险。尽管腹膜内注射 BLM 会诱导肺部相对均匀的纤维化变化，但由于药物靶向不足，因此需要多次给药。通过喉镜进行气管内气雾剂给药不需要气管切开或穿刺，并且产生的药物在肺内的分布是最佳的。然而，雾化颗粒很大 （5-40 μm），因此无法到达肺组织的胸膜下区域。

在这项研究中，BLM 的肺内给药是通过鼻雾化进行的。在雾化过程中，小鼠自主呼吸并吸入药物颗粒。雾化颗粒的大小为 2.5-4 μm，这使它们不仅能够均匀分布在整个肺中，而且能够到达胸膜下区域。在低倍放大下，特发性肺纤维化 （IPF） 患者最显著的肺组织病理学特征是病灶严重程度不同、分布不一致、不同期病灶交替分布，以及存在间质炎症、纤维化病灶和蜂窝状肺变化，与正常肺组织交替。这些病理变化主要涉及细支气管周围的外周胸膜下实质或小叶隔膜。因此，鉴于这种方法使 BLM 颗粒能够到达肺部的胸膜下区域，该模型密切模拟了人类疾病的临床特征。

研究方案

中日友好医院（中国北京）动物研究委员会批准了本研究中涉及小鼠的所有程序 （NO.190108）。将小鼠饲养在中日友好临床医学研究所无菌动物房中，室温20-25°C，相对湿度40%-70%，动物光照强度15-20LX，明暗交替12 h/12 h。动物可以免费获得食物和水。

1. 老鼠

1. 确保所有动物在雾化前适应饲养设施 7 天。
2. 使用 8-10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠进行雾化。

2. 鼻腔博来霉素雾化

1. 博来霉素制备
   注意:BLM 是一种化学毒物，可杀死肿瘤，但也可能损害正常细胞和正常组织。
   1. 在洁净工作台上制备 BLM 溶液。
      1. 为了获得工作浓度 （7 U/mL），将 15 U BLM 盐酸盐重悬于 2.14 mL 生理盐水中。小心混合重悬的 BLM，直至完全溶解。
   2. 将工作溶液储存在 4 °C 或冰上，并在 1 天内使用。雾化前，将 BLM 溶液加热至室温。
2. 麻醉
   1. 将 0.1 g 戊巴比妥钠溶解在 10 mL 生理盐水中，为麻醉做准备。将工作麻醉液存放在 4 °C 的黑暗处，并在 3 天内使用。
   2. 通过使用带有 26 G 针头的 1 mL 注射器将戊巴比妥钠注射到腹部来麻醉小鼠，最终剂量为 75 mg/kg 体重。
      注意:在本研究中，小鼠至少在 30 分钟内对该剂量没有反应。如有必要，请根据小鼠的反应咨询兽医调整剂量。
   3. 几分钟后，用食指和拇指按压麻醉小鼠的脚趾，确保肢体撤退反射消失。
3. 雾化系统的准备
   1. 校准仪器后，用柔软的网罩固定麻醉的鼠标（图 1A），用移液管将工作 BLM 溶液添加到曝光塔的顶部雾化头中（图 1B），并运行雾化器 30 分钟以实现稳定的雾化。
      注意:工作流程如图 1C、D 所示。软件的详细操作步骤请参考 补充图 S1 和 补充图 S2，其中说明了步骤 2.3.1.1-2.3.1.9。
      1. 双击 flexiWare 8 图标（补充图 S1A），单击 实验会话 （补充图 S1B），然后单击 "新建研究 "按钮（补充图 S1C）。
      2. 编辑 实验名称 （补充图 S1D）并编辑 标题 和 所有者 （补充图 S1E）。
      3. 选择 IX-4DIO 模板 （补充图 S1F），输入 运算符 （补充图 S1G），单击 确认 按钮（补充图 S1H）| 下一步 按钮（补充图 S1I）。
      4. 选择 泵 并单击 下一步 （补充图 S1J）| "下一步 "按钮（补充图 S2A）| "下一步 "按钮（补充图 S2B）| "完成" 按钮（补充图 S2C）。
      5. 单击 Continuous-1Lmin 的设置（三个点， 补充图 S2D） | DIO1，将 占空比 （%） 设置为 25%，然后单击 确定 （补充图 S2E）。
      6. 单击 DIO2，将占空比 （%） 设置为 25%，然后单击确定（补充图 S2F）。
      7. 单击 DIO3，将占空比 （%） 设置为 25%，然后单击确定（补充图 S2G）。
      8. 单击 DIO4，将占空比 （%） 设置为 25%，然后单击确定（补充图 S2H）。
      9. 单击 顶部的绿色按钮 （左）开始操作，单击 红色按钮（右） 停止工作。单击右上角的 x 退出（补充图 S2I）。
   2. 在 BLM 组中，一次雾化 12 只小鼠，总共 4 次，最多最多 48 只小鼠。在正常对照组中，用生理盐水一次雾化六只小鼠。
4. 动物恢复
   1. 在雾化器中处理 30 分钟后，将鼠标移至配备有加热垫的恢复笼中。
   2. 观察老鼠，直到它们完全清醒。
   3. 一旦确认鼠标状况良好，这意味着它可以自由移动，将其放回原来的笼子里。在它完全恢复之前，不要将其与其他动物放在一起。
   4. 在 BLM 治疗后的 24 小时内，检查生理指标，包括呼吸频率、存活率和任何症状两次。

3. 肺组织处理

1. 在 BLM 给药后 9、16 和 23 天，通过在腹部注射戊巴比妥钠（终剂量 100 mg/kg 体重）来处死 6 只小鼠。
2. 取出气管和肺，并立即用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗。
3. 在石蜡包埋前，将左肺在 10% 中性福尔马林缓冲液中固定 24 小时。
4. 苏木精-伊红染色（H&E 染色）
   1. 在脱水机中对固定的肺组织进行脱水。
   2. 将脱水的肺组织块置于 56 °C 的溶蜡盒中 1 小时。
   3. 包埋时，将熔化的石蜡倒入模箱中，然后快速将石蜡浸渍的组织块放在模箱底部，冷却并固化。
   4. 将嵌入的蜡块固定在切片机上，将切片台上下调整到合适的位置，推动刀片，调整刻度，切出厚度为 4 μm 的切片。用镊子将切片放入装满水的展示盒中展开（正面朝上）。
   5. 将切片贴上并烘烤。蜡片完全展开后，将载玻片以 135° 角靠在蜡片上，用镊子将蜡片移动到载玻片上，提起载玻片，并根据需要调整蜡片的位置。将带有安装蜡片的载玻片放在 47 °C 的恒温台上 1 分钟，以再次让切片展开;切片完全平坦后，将载玻片置于 62 °C 培养箱中 1 小时。
   6. 为了脱蜡，将烤好的载玻片放入二甲苯中 20 分钟两次。
   7. 对于再水化，将载玻片放入分级酒精系列中以再水化肺组织切片:100% 酒精 2 分钟，95% 酒精 1 分钟，90% 酒精 1 分钟，85% 酒精 1 分钟，75% 酒精 1 分钟，蒸馏水 3 分钟。
   8. 用苏木精对切片染色 5 分钟。洗涤 1 分钟两次，然后置于 0.5% 盐酸醇分化液中 5 秒，用水洗涤 1 分钟两次，置于蓝色染色溶液中 8-10 秒，用自来水冲洗两次，并用伊红染色 30 秒。
   9. 对于脱水和脱色，将染色切片置于 75% 酒精中 1 分钟，85% 酒精中 1 分钟，90% 酒精中 1 分钟，95% 酒精中 1 分钟，100% 酒精中 1 分钟，然后二甲苯 1 分钟，并用吸水纸去除所有剩余液体。
   10. 封片时，在切片中间滴一滴中性胶封溶液，然后安装盖玻片。
5. 小鼠肺组织形态学分级标准
   1. 使用 Ashcroft 等人描述的方法，让对实验组不知情的研究人员从每个样本中随机选择三个微观视野，并在 100 倍放大倍率下观察肺纤维化的程度:0 级，肺正常;1 级，肺泡轻微肿胀，局部轻度纤维化;2 级，显著纤维化（肺泡壁厚度大于正常值的三倍），伴有纤维病灶;3 级，连续的纤维化区域（肺泡壁的厚度是正常值的三倍）;4 级，纤维病灶融合，纤维化面积占肺组织的 10% 以下;5 级，纤维病灶融合，纤维化面积为 10%-50%，肺泡结构明显受损;6 级，大的连续纤维病灶（大于肺组织的 50%）;7 级，肺泡间隙充满纤维组织，存在肺大疱;8 级，完全纤维化。
   2. 为每个视野分配一个与等级相对应的分数（例如，4 级等于 4 分），并分别对每组六个样本进行评分。

结果

雾化 BLM 诱导肺损伤，对照动物用相同体积的生理盐水雾化。小鼠雾化每天一次，持续 3 天，每天 30 分钟，使用 7 U/mL 的 BLM 浓度。在 BLM 给药后第 9 天、第 16 天和第 23 天处死小鼠进行 H&E 染色（图 2B）。与对照组小鼠相比，在接受 BLM 的小鼠的肺部观察到弥漫性肺病灶伴正常肺泡结构丧失、鼻中隔增厚、肺泡扩大以及炎症细胞浸润到间质和细支气管周围区域?...

讨论

气管内注射博来霉素导致双肺急性炎症和纤维化反应，可以被认为是建立人间质性肺病实验小鼠模型的有效方法。气管内给药是最常用的给药途径 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice