Un modelo murino de fibrosis pulmonar inducida por nebulización nasal de bleomicina

Resumen

Se han establecido varios modelos animales de fibrosis pulmonar utilizando bleomicina para aclarar la patogenia de la fibrosis pulmonar y encontrar nuevas dianas farmacológicas. Sin embargo, la mayoría de los modelos de fibrosis pulmonar dirigidos al tejido pulmonar tienen una administración desigual del fármaco. En este trabajo se propone un modelo de fibrosis pulmonar uniforme inducida por la nebulización nasal de bleomicina.

Resumen

La fibrosis pulmonar es característica de varias enfermedades pulmonares humanas que surgen por diversas causas. Dado que las opciones de tratamiento son bastante limitadas, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta importante para el desarrollo de nuevas estrategias antifibróticas. En este estudio, la administración intrapulmonar de bleomicina (BLM) se lleva a cabo mediante nebulización nasal para crear un modelo murino de fibrosis pulmonar que imita de cerca las características clínicas de la enfermedad. Los ratones C57BL/6 recibieron BLM (7 U/mL, 30 min/día) por nebulización nasal durante 3 días consecutivos y fueron sacrificados los días 9, 16 o 23 para observar cambios inflamatorios y fibróticos en el tejido pulmonar. La BLM nasal en aerosol se dirigió directamente a los pulmones, lo que provocó una inflamación y fibrosis pulmonar generalizadas y uniformes. Por lo tanto, generamos con éxito un modelo experimental de ratón de fibrosis pulmonar humana típica. Este método podría utilizarse fácilmente para estudiar los efectos de la administración de diversos aerosoles nasales sobre la fisiopatología pulmonar y validar nuevos tratamientos antiinflamatorios y antifibróticos.

Introducción

La fibrosis pulmonar es un proceso patológico progresivo en el que la deposición excesiva de componentes de la matriz extracelular, principalmente colágeno tipo I, en el intersticio de los pulmones conduce a un deterioro de la función pulmonar¹. La fisiopatología de la fibrosis pulmonar es compleja y las opciones de tratamiento son actualmente bastante limitadas. Los modelos de ratón siguen siendo una herramienta importante para estudiar los mecanismos patogénicos que contribuyen a la aparición y progresión de la enfermedad, así como nuevas estrategias para el desarrollo de fármacos.

Una variedad de modelos animales de fibrosis pulmonar se basan en la instilación intratraqueal de BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Sin embargo, la distribución de los cambios fibróticos que causa la BLM en los pulmones no es uniforme y los animales corren el riesgo de asfixia durante el proceso de instilación. Aunque la inyección intraperitoneal de BLM induce cambios fibróticos relativamente uniformes en el pulmón, requiere dosis múltiples debido a la insuficiente orientación del fármaco. La administración de aerosoles intratraqueales a través de un laringoscopio no requiere traqueotomía ni punción, y la distribución resultante del fármaco dentro del pulmón es óptima. Sin embargo, las partículas en aerosol son grandes (5-40 μm) y, por lo tanto, no pueden alcanzar el área subpleural del tejido pulmonar.

En este estudio, la administración intrapulmonar de BLM se lleva a cabo mediante nebulización nasal. Durante la nebulización, los ratones respiraron espontáneamente e inhalaron las partículas del fármaco. Las partículas aerosolizadas tenían un tamaño de 2,5-4 μm, lo que les permitió no solo distribuirse uniformemente por todo el pulmón, sino también llegar a la zona subpleural. Bajo aumento, las características histopatológicas pulmonares más significativas de los pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (FPI) son la gravedad variable de las lesiones, la distribución inconsistente, la distribución alterna de lesiones en diferentes fases y la presencia de inflamación intersticial, lesiones fibróticas y cambios pulmonares en forma de panal, alternados con tejido pulmonar normal. Estos cambios patológicos afectan predominantemente al parénquima subpleural periférico o al tabique lobulillar alrededor de los bronquiolos. Así, dado que este enfoque permite que las partículas de BLM lleguen a la zona subpleural de los pulmones, este modelo simula de cerca las características clínicas de la enfermedad en humanos.

Protocolo

El Comité de Estudios Animales del Hospital de la Amistad China-Japón (Beijing, China) aprobó todos los procedimientos con ratones que se realizaron como parte de este estudio (NO.190108). Los ratones se mantuvieron en la sala de animales estériles del Instituto de Investigación Médica Clínica de la Amistad China-Japón, con una temperatura ambiente de 20-25 °C, humedad relativa de 40%-70%, intensidad de luz animal de 15-20 LX y alternancia de luz y oscuridad durante 12 h/12 h. Los animales tenían libre acceso a comida y agua.

1. Ratones

1. Asegúrese de que todos los animales estén aclimatados a las instalaciones de alojamiento durante 7 días antes de la nebulización.
2. Utilice ratones machos C57BL/6, de 8 a 10 semanas de edad, para la nebulización.

2. Nebulización nasal con bleomicina

1. Preparación de bleomicina
   PRECAUCIÓN: BLM es un veneno químico que mata los tumores, pero también puede dañar las células normales y los tejidos normales.
   1. Prepare la solución BLM en un banco limpio.
      1. Para obtener la concentración de trabajo (7 U/mL), resuspender 15 U de clorhidrato BLM en 2,14 mL de solución salina normal. Mezcle con cuidado el BLM resuspendido hasta que se disuelva por completo.
   2. Almacene la solución de trabajo a 4 °C o en hielo y utilícela en el plazo de 1 día. Antes de la nebulización, lleve la solución de BLM a temperatura ambiente.
2. Anestesia
   1. Prepárese para la anestesia disolviendo 0,1 g de pentobarbital sódico en 10 mL de solución salina normal. Guarde la solución anestésica funcional en un lugar oscuro a 4 °C y utilícela dentro de los 3 días.
   2. Anestesiar a los ratones inyectando el pentobarbital sódico en el abdomen, utilizando una jeringa de 1 mL con aguja de 26 G, a una dosis final de 75 mg/kg de peso corporal.
      NOTA: En este estudio, los ratones no respondieron a esta dosis durante al menos 30 minutos. Si es necesario, ajuste la dosis en consulta con el veterinario de acuerdo con la respuesta del ratón.
   3. Después de unos minutos, presione los dedos de los pies del ratón anestesiado con el dedo índice y el pulgar para asegurarse de que el reflejo de retirada de la extremidad haya desaparecido.
3. Preparación del sistema de nebulización
   1. Después de calibrar el instrumento, asegure el ratón anestesiado con una cubierta de malla suave (Figura 1A), agregue la solución BLM de trabajo al cabezal de atomización superior de la torre de exposición con una pipeta (Figura 1B) y haga funcionar el nebulizador durante 30 minutos para lograr una atomización estable.
      NOTA: El flujo de trabajo se muestra en la Figura 1C,D. Para ver los pasos detallados del funcionamiento del software, consulte la Figura complementaria S1 y la Figura complementaria S2, que ilustran los pasos 2.3.1.1-2.3.1.9.
      1. Haga doble clic en el icono de flexiWare 8 (Figura complementaria S1A), haga clic en Sesión de experimentación (Figura complementaria S1B) y haga clic en el botón Nuevo estudio (Figura complementaria S1C).
      2. Edite el nombre del experimento (Figura complementaria S1D) y edite el Título y el propietario (Figura complementaria S1E).
      3. Elija la plantilla IX-4DIO (Figura complementaria S1F), introduzca el operador (Figura complementaria S1G), haga clic en el botón Confirmar (Figura complementaria S1H) | Botón Siguiente (Figura complementaria S1I).
      4. Elija la bomba y haga clic en siguiente (Figura complementaria S1J) | Botón Siguiente (Figura complementaria S2A) | Botón Siguiente (Figura complementaria S2B) | Botón de finalización (Figura complementaria S2C).
      5. Haga clic en la Configuración de Continuous-1Lmin (tres puntos, Figura complementaria S2D) | DIO1, establezca el Ciclo de trabajo (%) en 25% y, a continuación, haga clic en Aceptar (Figura complementaria S2E).
      6. Haga clic en DIO2, establezca el ciclo de trabajo (%) en 25% y, a continuación, haga clic en Aceptar (figura complementaria S2F).
      7. Haga clic en DIO3, establezca el Ciclo de trabajo (%) en 25% y, a continuación, haga clic en Aceptar (Figura complementaria S2G).
      8. Haga clic en DIO4, establezca el ciclo de trabajo (%) en 25% y, a continuación, haga clic en Aceptar (figura complementaria S2H).
      9. Haga clic en el botón verde superior (izquierda) para comenzar a operar y haga clic en el botón rojo (derecha) para detener el trabajo. Haga clic en la x en la esquina superior derecha para salir (Figura complementaria S2I).
   2. En el grupo BLM, atomice 12 ratones a la vez, cuatro veces en total, hasta un total de 48 ratones. Atomizar seis ratones a la vez en el grupo de control normal con solución salina normal.
4. Recuperación de animales
   1. Después del tratamiento en el nebulizador durante 30 minutos, mueva el mouse a una jaula de recuperación equipada con una almohadilla térmica.
   2. Observa a los ratones hasta que estén completamente conscientes.
   3. Una vez que se confirme que el ratón está en buenas condiciones, lo que significa que puede moverse libremente, devuélvalo a su jaula original. No lo coloque con otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
   4. Comprobar los índices fisiológicos, incluyendo la frecuencia respiratoria, la supervivencia y cualquier síntoma, dos veces durante las 24 horas siguientes al tratamiento con BLM.

3. Procesamiento del tejido pulmonar

1. A los 9, 16 y 23 días después de la administración de BLM, sacrifique seis ratones inyectándoles pentobarbital sódico en el abdomen (dosis final de 100 mg/kg de peso corporal).
2. Retire la tráquea y los pulmones y enjuague inmediatamente con solución salina fría tamponada con fosfato.
3. Fijar el pulmón izquierdo en un tampón de formalina neutro al 10% durante 24 h antes de la inclusión en parafina.
4. Tinción con hematoxilina-eosina (tinción H&E)
   1. Deshidratar el tejido pulmonar fijo en un deshidratador.
   2. Coloque el bloque de tejido pulmonar deshidratado en una caja de disolución de cera a 56 °C durante 1 h.
   3. Para incrustar, vierta la parafina derretida en la caja del molde y luego coloque rápidamente el bloque de tejido impregnado de parafina en el fondo de la caja del molde, enfríe y solidifique.
   4. Fije el bloque de cera incrustado en el micrótomo, ajuste la mesa de corte hacia arriba y hacia abajo a una posición adecuada, empuje la cuchilla, ajuste la escala y corte una rodaja con un grosor de 4 μm. Use pinzas para colocar la rebanada en una caja de exhibición llena de agua para desenrollarla (con la parte delantera hacia arriba).
   5. Parche y hornee las rodajas. Después de que la rebanada de cera se haya desenrollado por completo, coloque el portaobjetos de vidrio contra el portaobjetos de cera en un ángulo de 135 °, use pinzas para mover el portaobjetos de cera sobre el portaobjetos de vidrio, levante el portaobjetos de vidrio y ajuste la posición de la rebanada de cera según sea necesario. Coloque los portaobjetos con las lonchas de cera montadas en una mesa de temperatura constante a 47 °C durante 1 minuto para permitir que las rodajas se desenrollen nuevamente; Una vez que las rodajas estén completamente planas, coloque los portaobjetos en una incubadora a 62 °C durante 1 h.
   6. Para desparafinar, coloque los portaobjetos horneados en xileno durante 20 minutos dos veces.
   7. Para la rehidratación, coloque los portaobjetos en una serie de alcohol graduado para rehidratar las rodajas de tejido pulmonar: 100 % de alcohol durante 2 minutos, 95 % de alcohol durante 1 minuto, 90 % de alcohol durante 1 minuto, 85 % de alcohol durante 1 minuto, 75 % de alcohol durante 1 minuto y agua destilada durante 3 minutos.
   8. Teñir las secciones con hematoxilina durante 5 min. Lavar durante 1 min dos veces, luego colocar en una solución de diferenciación de alcohol con ácido clorhídrico al 0,5% durante 5 s, lavar con agua durante 1 min dos veces, colocar en la solución de tinción Blue durante 8-10 s, enjuagar dos veces con agua del grifo y teñir con eosina durante 30 s.
   9. Para la deshidratación y la decoloración, coloque las secciones manchadas en alcohol al 75 % durante 1 minuto, 85 % de alcohol durante 1 minuto, 90 % de alcohol durante 1 minuto, 95 % de alcohol durante 1 minuto, 100 % de alcohol durante 1 minuto y luego xileno durante 1 minuto dos veces, y retire todo el líquido restante con papel absorbente.
   10. Para el montaje, coloque una gota de solución selladora de goma neutra en el centro de la rebanada y monte un cubreobjetos.
5. Estándar de clasificación morfológica del tejido pulmonar de ratón
   1. Utilizando el método descrito por Ashcroft et al., un investigador ciego al grupo experimental selecciona al azar tres campos microscópicos de cada muestra y observa el grado de fibrosis pulmonar con un aumento de 100x: grado 0, pulmón normal; grado 1, alvéolos ligeramente inflamados, fibrosis leve localizada; grado 2, fibrosis marcada (espesor de la pared alveolar superior a tres veces lo normal), con focos fibrosos; grado 3, áreas continuas de fibrosis (grosor de la pared alveolar tres veces mayor de lo normal); grado 4, fusión de focos fibrosos, con el área fibrótica que representa menos del 10% del tejido pulmonar; grado 5, los focos fibrosos están fusionados, el área de fibrosis es del 10% al 50% y la estructura alveolar está significativamente dañada; grado 6, grandes focos fibrosos continuos (más del 50% del tejido pulmonar); grado 7, el espacio alveolar está lleno de tejido fibroso, hay ampollas pulmonares; Grado 8, fibrosis completa.
   2. Asigne una puntuación correspondiente a la calificación a cada campo de visión (por ejemplo, la calificación 4 equivale a cuatro puntos) y califique cada grupo de seis muestras por separado.

Resultados

La lesión pulmonar fue inducida por BLM nebulizado, y los animales de control fueron nebulizados con el mismo volumen de solución salina normal. Los ratones se nebulizaron una vez al día durante 3 días, 30 min por día, utilizando una concentración de BLM de 7 U/mL. Los ratones fueron sacrificados en los días 9, 16 y 23 después de la administración de BLM para la tinción de H&E (Figura 2B). Se observaron lesiones neumónicas difusas con pérdida de la arquitectu...

Discusión

La inyección intratraqueal de bleomicina produce una respuesta inflamatoria y fibrótica aguda en ambos pulmones y puede considerarse un enfoque eficaz para establecer un modelo experimental de ratón de enfermedad pulmonar intersticial humana. La administración intratraqueal es la vía de administración más utilizada 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice