Un modello murino di fibrosi polmonare indotta dalla nebulizzazione nasale di bleomicina

Riepilogo

Vari modelli animali di fibrosi polmonare sono stati stabiliti utilizzando la bleomicina per chiarire la patogenesi della fibrosi polmonare e trovare nuovi bersagli farmacologici. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di fibrosi polmonare mirati al tessuto polmonare hanno una somministrazione irregolare del farmaco. Qui, proponiamo un modello di fibrosi polmonare uniforme indotta dalla nebulizzazione nasale di bleomicina.

Abstract

La fibrosi polmonare è caratteristica di diverse malattie polmonari umane che derivano da varie cause. Dato che le opzioni di trattamento sono piuttosto limitate, i modelli murini continuano ad essere uno strumento importante per lo sviluppo di nuove strategie antifibrotiche. In questo studio, la somministrazione intrapolmonare di bleomicina (BLM) viene effettuata mediante nebulizzazione nasale per creare un modello murino di fibrosi polmonare che imita da vicino le caratteristiche cliniche della malattia. I topi C57BL/6 hanno ricevuto BLM (7 U/mL, 30 min/die) mediante nebulizzazione nasale per 3 giorni consecutivi e sono stati sacrificati il giorno 9, 16 o 23 per osservare i cambiamenti infiammatori e fibrotici nel tessuto polmonare. Il BLM aerosolizzato nasale ha preso di mira direttamente i polmoni, provocando infiammazione polmonare e fibrosi diffuse e uniformi. Pertanto, abbiamo generato con successo un modello murino sperimentale di fibrosi polmonare umana tipica. Questo metodo potrebbe essere facilmente utilizzato per studiare gli effetti della somministrazione di vari aerosol nasali sulla fisiopatologia polmonare e convalidare nuovi trattamenti antinfiammatori e antifibrotici.

Introduzione

La fibrosi polmonare è un processo patologico progressivo in cui l'eccessiva deposizione di componenti della matrice extracellulare, principalmente il collagene di tipo I, nell'interstizio dei polmoni porta a una compromissione della funzione polmonare¹. La fisiopatologia della fibrosi polmonare è complessa e le opzioni di trattamento sono attualmente piuttosto limitate. I modelli murini rimangono uno strumento importante per studiare i meccanismi patogenetici che contribuiscono all'insorgenza e alla progressione della malattia, nonché nuove strategie per lo sviluppo di farmaci.

Una varietà di modelli animali di fibrosi polmonare si basa sull'instillazione intratracheale di BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Tuttavia, la distribuzione delle alterazioni fibrotiche che la BLM provoca nei polmoni non è uniforme e gli animali sono a rischio di asfissia durante il processo di instillazione. Sebbene l'iniezione intraperitoneale di BLM induca alterazioni fibrotiche relativamente uniformi nel polmone, richiede dosi multiple a causa dell'insufficiente targeting del farmaco. La somministrazione di aerosol intratracheale tramite laringoscopio non richiede tracheotomia o puntura e la distribuzione del farmaco risultante all'interno del polmone è ottimale. Tuttavia, le particelle aerosolizzate sono grandi (5-40 μm) e quindi non possono raggiungere l'area subpleurica del tessuto polmonare.

In questo studio, la somministrazione intrapolmonare di BLM viene effettuata mediante nebulizzazione nasale. Durante la nebulizzazione, i topi respiravano spontaneamente e inalavano le particelle del farmaco. Le particelle aerosolizzate avevano una dimensione di 2,5-4 μm, il che ha permesso loro non solo di distribuirsi uniformemente in tutto il polmone, ma anche di raggiungere l'area subpleurica. A basso ingrandimento, le caratteristiche istopatologiche polmonari più significative dei pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF) sono la gravità variabile delle lesioni, la distribuzione incoerente, la distribuzione alternata di lesioni di fase diversa e la presenza di infiammazione interstiziale, lesioni fibrotiche e alterazioni polmonari a nido d'ape, alternate a tessuto polmonare normale. Queste alterazioni patologiche coinvolgono prevalentemente il parenchima subpleurico periferico o il setto lobulare attorno ai bronchioli. Pertanto, dato che questo approccio consente alle particelle BLM di raggiungere l'area subpleurica dei polmoni, questo modello simula da vicino le caratteristiche cliniche della malattia nell'uomo.

Protocollo

Il Comitato per gli studi sugli animali dell'Ospedale dell'amicizia Cina-Giappone (Pechino, Cina) ha approvato tutte le procedure che coinvolgono i topi che sono state eseguite nell'ambito di questo studio (NO.190108). I topi sono stati tenuti nella stanza sterile degli animali dell'Istituto di ricerca medica clinica dell'amicizia Cina-Giappone, con una temperatura ambiente di 20-25 °C, umidità relativa del 40%-70%, intensità della luce animale di 15-20 LX e alternanza di luce e buio per 12 ore/12 ore. Gli animali avevano libero accesso al cibo e all'acqua.

1. Topi

1. Assicurarsi che tutti gli animali siano acclimatati alla struttura di stabulazione per 7 giorni prima della nebulizzazione.
2. Utilizzare topi maschi C57BL/6, di età compresa tra 8 e 10 settimane, per la nebulizzazione.

2. Nebulizzazione nasale di bleomicina

1. Preparazione della bleomicina
   ATTENZIONE: Il BLM è un veleno chimico, che uccide i tumori ma può anche danneggiare le cellule normali e i tessuti normali.
   1. Preparare la soluzione BLM su un banco pulito.
      1. Per ottenere la concentrazione di lavoro (7 U/mL), risospendere 15 U di cloridrato BLM in 2,14 mL di soluzione fisiologica normale. Mescolare accuratamente il BLM risospeso fino a quando non è completamente sciolto.
   2. Conservare la soluzione di lavoro a 4 °C o in ghiaccio e consumare entro 1 giorno. Prima della nebulizzazione, portare la soluzione BLM a temperatura ambiente.
2. Anestesia
   1. Prepararsi per l'anestesia sciogliendo 0,1 g di pentobarbital sodico in 10 ml di soluzione fisiologica normale. Conservare la soluzione per anestesia funzionante in un luogo buio a 4 °C e utilizzarla entro 3 giorni.
   2. Anestetizzare i topi iniettando il pentobarbital sodico nell'addome, utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 26 G, a una dose finale di 75 mg/kg di peso corporeo.
      NOTA: In questo studio, i topi non hanno risposto a questa dose per almeno 30 minuti. Se necessario, regolare la dose in consultazione con il veterinario in base alla risposta del topo.
   3. Dopo alcuni minuti, premere le dita dei piedi del topo anestetizzato con l'indice e il pollice per assicurarsi che il riflesso di ritiro dell'arto sia scomparso.
3. Preparazione del sistema di nebulizzazione
   1. Dopo aver calibrato lo strumento, fissare il topo anestetizzato con una copertura a rete morbida (Figura 1A), aggiungere la soluzione BLM funzionante alla testa di nebulizzazione superiore della torre di esposizione con una pipetta (Figura 1B) e far funzionare il nebulizzatore per 30 minuti per ottenere un'atomizzazione stabile.
      NOTA: Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1C, D. Per le fasi operative dettagliate del software, fare riferimento alla Figura supplementare S1 e alla Figura supplementare S2, che illustrano i passaggi 2.3.1.1-2.3.1.9.
      1. Fare doppio clic sull'icona flexiWare 8 (Figura supplementare S1A), fare clic sulla sessione di sperimentazione (Figura supplementare S1B) e fare clic sul pulsante Nuovo studio (Figura supplementare S1C).
      2. Modificare il nome dell'esperimento (Figura supplementare S1D) e modificare il titolo e il proprietario (Figura supplementare S1E).
      3. Scegliere il modello IX-4DIO (Figura supplementare S1F), inserire l'operatore (Figura supplementare S1G), fare clic sul pulsante Conferma (Figura supplementare S1H) | Pulsante Avanti (Figura supplementare S1I).
      4. Scegli la pompa e fai clic su Avanti (Figura supplementare S1J) | Pulsante Avanti (Figura supplementare S2A) | Pulsante Avanti (Figura supplementare S2B) | Pulsante Fine (Figura supplementare S2C).
      5. Fare clic sulle impostazioni per Continuous-1Lmin (tre punti, Figura supplementare S2D) | DIO1, impostare il ciclo di lavoro (%) su 25%, quindi fare clic su OK (Figura supplementare S2E).
      6. Fare clic su DIO2, impostare il ciclo di lavoro (%) su 25%, quindi fare clic su OK (Figura supplementare S2F).
      7. Fare clic su DIO3, impostare il ciclo di lavoro (%) su 25%, quindi fare clic su OK (Figura supplementare S2G).
      8. Fare clic su DIO4, impostare il ciclo di lavoro (%) su 25%, quindi fare clic su OK (Figura supplementare S2H).
      9. Fare clic sul pulsante verde in alto (a sinistra) per avviare l'operazione e fare clic sul pulsante rosso (a destra) per interrompere il lavoro. Fare clic sulla x nell'angolo in alto a destra per uscire (Figura supplementare S2I).
   2. Nel gruppo BLM, atomizzare 12 topi alla volta, per quattro volte in totale, fino a un totale di 48 topi. Atomizzare sei topi alla volta nel gruppo di controllo normale con soluzione fisiologica.
4. Recupero degli animali
   1. Dopo il trattamento nel nebulizzatore per 30 minuti, spostare il mouse in una gabbia di recupero dotata di un termoforo.
   2. Osserva i topi fino a quando non sono completamente coscienti.
   3. Una volta confermato che il topo è in buone condizioni, il che significa che può muoversi liberamente, rimettilo nella sua gabbia originale. Non metterlo con altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
   4. Controllare gli indici fisiologici, tra cui la frequenza respiratoria, la sopravvivenza e gli eventuali sintomi, due volte durante le 24 ore successive al trattamento con BLM.

3. Elaborazione del tessuto polmonare

1. A 9, 16 e 23 giorni dopo la somministrazione di BLM, sacrificare sei topi iniettandoli nell'addome con pentobarbital sodico (dose finale 100 mg/kg di peso corporeo).
2. Rimuovere la trachea e i polmoni e risciacquare immediatamente con soluzione fisiologica fredda tamponata con fosfato.
3. Fissare il polmone sinistro in tampone di formalina neutra al 10% per 24 ore prima dell'inclusione della paraffina.
4. Colorazione ematossilina-eosina (colorazione H&E)
   1. Disidratare il tessuto polmonare fissato in un disidratatore.
   2. Porre il blocco di tessuto polmonare disidratato in una scatola di scioglimento della cera a 56 °C per 1 ora.
   3. Per l'incorporazione, versare la paraffina fusa nella scatola dello stampo, quindi posizionare rapidamente il blocco di tessuto impregnato di paraffina sul fondo della scatola dello stampo, raffreddare e solidificare.
   4. Fissare il blocco di cera incorporato sul microtomo, regolare il tavolo per affettare su e giù in una posizione appropriata, spingere la lama, regolare la scala e tagliare una fetta con uno spessore di 4 μm. Usa le pinzette per posizionare la fetta in una scatola piena d'acqua per srotolarla (lato anteriore rivolto verso l'alto).
   5. Rattoppare e cuocere le fette. Dopo che la fetta di cera si è completamente srotolata, posizionare il vetrino contro la fetta di cera con un angolo di 135°, usare una pinzetta per spostare la fetta di cera sul vetrino, sollevare il vetrino e regolare la posizione della fetta di cera secondo necessità. Posizionare i vetrini con le fette di cera montate su un tavolo a temperatura costante a 47 °C per 1 minuto per consentire nuovamente alle fette di srotolarsi; una volta che le fette sono completamente piatte, posizionare i vetrini in un'incubatrice a 62 °C per 1 ora.
   6. Per la deceratura, posizionare i vetrini cotti nello xilene per 20 minuti due volte.
   7. Per la reidratazione, posizionare i vetrini in una serie di alcol graduato per reidratare le fette di tessuto polmonare: 100% di alcol per 2 minuti, 95% di alcol per 1 minuto, 90% di alcol per 1 minuto, 85% di alcol per 1 minuto, 75% di alcol per 1 minuto e acqua distillata per 3 minuti.
   8. Colorare le sezioni con ematossilina per 5 minuti. Lavare per 1 minuto due volte, quindi immergere in una soluzione di differenziazione alcolica di acido cloridrico allo 0,5% per 5 secondi, lavare con acqua per 1 minuto due volte, immergere nella soluzione colorante blu per 8-10 secondi, risciacquare due volte con acqua di rubinetto e colorare con eosina per 30 secondi.
   9. Per la disidratazione e la decolorazione, immergere le sezioni macchiate in alcol al 75% per 1 minuto, alcol all'85% per 1 minuto, alcol al 90% per 1 minuto, alcol al 95% per 1 minuto, alcol al 100% per 1 minuto e quindi xilene per 1 minuto due volte e rimuovere tutto il liquido rimanente con carta assorbente.
   10. Per il montaggio, versare una goccia di soluzione sigillante neutra al centro della fetta e montare un vetrino coprioggetti.
5. Standard di classificazione morfologica del tessuto polmonare di topo
   1. Utilizzando il metodo descritto da Ashcroft et al., chiedi a un ricercatore all'oscuro del gruppo sperimentale di selezionare casualmente tre campi microscopici da ciascun campione e osservare il grado di fibrosi polmonare a un ingrandimento di 100x: grado 0, polmone normale; grado 1, alveoli leggermente gonfi, lieve fibrosi localizzata; grado 2, fibrosi marcata (spessore della parete alveolare superiore a tre volte il normale), con focolai fibrosi; grado 3, aree continue di fibrosi (spessore della parete alveolare tre volte maggiore del normale); grado 4, fusione di focolai fibrosi, con l'area fibrotica che rappresenta meno del 10% del tessuto polmonare; grado 5, i focolai fibrosi sono fusi, l'area della fibrosi è compresa tra il 10% e il 50% e la struttura alveolare è significativamente danneggiata; grado 6, grandi focolai fibrosi continui (superiori al 50% del tessuto polmonare); grado 7, lo spazio alveolare è riempito di tessuto fibroso, sono presenti bolle polmonari; grado 8, fibrosi completa.
   2. Assegna un punteggio corrispondente al voto a ciascun campo visivo (ad esempio, il grado 4 equivale a quattro punti) e assegna un punteggio a ciascun gruppo di sei campioni separatamente.

Risultati

Il danno polmonare è stato indotto da BLM nebulizzato e gli animali di controllo sono stati nebulizzati con lo stesso volume di soluzione fisiologica normale. I topi sono stati nebulizzati una volta al giorno per 3 giorni, 30 minuti al giorno, utilizzando una concentrazione di BLM di 7 U/mL. I topi sono stati sacrificati nei giorni 9, 16 e 23 dopo la somministrazione di BLM per la colorazione H&E (Figura 2B). Lesioni polmonari diffuse con perdita della normale architett...

Discussione

L'iniezione intratracheale di bleomicina provoca una risposta infiammatoria acuta e fibrotica in entrambi i polmoni e può essere considerata un approccio efficace per stabilire un modello murino sperimentale di malattia polmonare interstiziale umana. La somministrazione intratracheale è la via di somministrazione più comunemente utilizzata 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice